Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para imagens de ovários inteiros para análises quantitativas e qualitativas utilizando imunosscopia de montagem integral, microscopia multifotínica e visualização e análise 3D. Este protocolo acomoda um processamento de alto rendimento, confiável e repetível que é aplicável para toxicologia, diagnóstico clínico e ensaios genômicos da função ovariana.

Resumo

A fertilidade feminina e a vida útil reprodutiva dependem da qualidade e quantidade da reserva de oócito ovariano. Estima-se que 80% das células germinativas femininas que entram em prophase meiotic I são eliminadas durante o Atrito de Oócito Fetal (FOA) e a primeira semana de vida pós-natal. Três mecanismos principais regulam o número de oócitos que sobrevivem durante o desenvolvimento e estabelecem a reserva ovariana em fêmeas que entram na puberdade. Na primeira onda de perda de oócitos, 30-50% dos oócitos são eliminados durante o FOA inicial, um fenômeno que é atribuído à alta expressão de elemento nuclear intercalado de comprimento -1 (LINE-1). A segunda onda de perda de oócito é a eliminação de oócitos com defeitos meioticos por um ponto de verificação de qualidade meiotic. A terceira onda de perda de oócito ocorre perinatalmente durante a formação de folículos primordiais quando alguns oócitos não conseguem formar folículos. Ainda não está claro o que regula cada uma dessas três ondas de perda de oócito e como elas moldam a reserva ovariana em camundongos ou humanos.

A imunofluorescência e a visualização 3D abriram um novo caminho para a imagem e análise do desenvolvimento de oócitos no contexto de todo o ovário, em vez de em seções 2D menos informativas. Este artigo fornece um protocolo abrangente para imunostaining de ovários inteiros e limpeza óptica, produzindo preparações para imagens usando microscopia multifotídea e modelagem 3D usando software comercialmente disponível. Ele mostra como este método pode ser usado para mostrar a dinâmica do atrito de oócito durante o desenvolvimento ovariano em camundongos C57BL/6J e quantificar a perda de oócito durante as três ondas de eliminação de oócitos. Este protocolo pode ser aplicado aos ovários pós-natal e pós-natal precoces para visualização e quantificação de oócitos, bem como outras abordagens quantitativas. É importante ressaltar que o protocolo foi estrategicamente desenvolvido para acomodar o processamento de alto rendimento, confiável e repetível que pode atender às necessidades em toxicologia, diagnóstico clínico e ensaios genômicos da função ovariana.

Introdução

A maioria das fêmeas de mamíferos nasce com um número finito de oócitos presos por meioticamente armazenados dentro de folículos primordiais, constituindo a reserva ovariana (OR)^1,2. O BO determina a vida reprodutiva geral feminina e a saúde³. O OR normalmente diminui de tamanho com o envelhecimento e pode ser prematuramente esgotado após a exposição a certos agentes genotoxicos (radiação/quimioterapia) e estresses ambientais (desnutrição), levando à infertilidade ^4,5,6. A infertilidade feminina idiopática pode muitas vezes ser atribuída à qualidade genética e fisiológica dos ovos que se desenvolvem a partir do BO e permanece mal compreendida ^7,8. Como a dotação do folículo feminino é em grande parte predeterminada pelo nascimento, é essencial compreender os mecanismos regulatórios envolvidos no estabelecimento e manutenção do OR.

Em camundongos, a formação de OR começa com a especificação de células germinativas primordiais (PGCs) em torno do dia embrionário (E) 7,5². Os PGCs migram para os cumes genitais, onde residirão por aproximadamente E10,5⁹. A proliferação extensiva a seguir ocorre com citocinas incompletas resultando na formação de cistos que serão quebrados mais tarde no desenvolvimento^10,11. Aproximadamente E12,5, o sexo gonadal é determinado, e a proliferação de PGC para em ovários. No feminino, os PGCs, agora oócitos, entram em prophase I (MPI) em aproximadamente E13,5^12,13. Os ocitos progridem através de IPM estendido e prisão na fase de dictyate na época do nascimento. Durante a primeira semana após o nascimento, cada oócito preso é cercado por células de granulosa, formando assim um folículo primordial.

O número de folículos primordiais no OR de uma fêmea depende de quantas oócitos sobreviveram às ondas de eliminação de oócitos que ocorrem antes e durante a prisão do IMP por apoptose, autofagia ou necrose^14,15. A primeira onda ocorre durante o desenvolvimento fetal e é conhecida como FOA. O FOA é um processo evolutivamente conservado em fêmeas (mamíferos e não-mamíferos), pelo qual cerca de 50-80% dos oócitos são eliminados dependendo da espécie feminina 16,17,18,19. Em camundongos, o FOA ocorre durante o E15.5 ao E18.5 e tem sido atribuído à reativação e expressão de sequências retrotransposon LINE-1 causando morte oócida^20,21. A segunda onda de eliminação de oócitos ocorre através de um ponto de verificação meiotic que elimina oócitos com defeitos meioticos, como quebras de duplo fio de DNA não reparadas (DSBs)^22,23. A próxima onda de eliminação de oócito ocorre durante a quebra do cisto, culminando durante a formação de folículos primordiais, cada um dos quais contém um único oócito 10,11,24,25.

Em camundongos, a reserva primordial do folículo é em grande parte estabelecida pela puberdade, após a qual diminui à medida que folículos primordiais são ativados para o crescimento durante ciclos reprodutivos regulares. O tamanho do OR varia entre as mulheres individuais e entre diferentes cepas genéticas de camundongos; ainda assim, a regulação genética do tamanho do OR não é bem compreendida 26,27,28,29. Estudos genéticos de regulação de OR são dificultados pela falta de protocolos padronizados para estudar as ondas de eliminação de oócitos durante o desenvolvimento pré-natal e pós-natal. Várias metodologias de quantificação oócito foram desenvolvidas em camundongos, sendo a mais comum e amplamente utilizada a avaliação histomorfométrica das seções histológicas^30,31. Nesta técnica, os oócitos são identificados em seções seriais com manchas histológicas, como hematoxilina e eosina (H&E) e ácido periódico-Schiff (PAS) ou marcadores fluorescentes. Esta técnica é confiável se todas as condições permanecerem constantes, incluindo espessura de seção, recuperação eficiente de todas as seções ao longo do ovário e os esquemas de contagem de laboratórios individuais. No entanto, os números relatados por diferentes laboratórios muitas vezes diferem significativamente e, portanto, não são facilmente comparáveis.

Além disso, dadas as diferenças genéticas, o uso de diferentes cepas de camundongos também pode influenciar a contagem de oócitos. Abordagens computacionais adicionais foram desenvolvidas para avaliação histomorfométrica e incluem a detecção automatizada de oócitos usando a abordagem fracionado, contagem automática usando algoritmos computacionais e reconstrução 3D de imagens histológicas para evitar múltiplas contagens do mesmo oócito 31,32,33,34, ^35,36 . Mesmo com essas melhorias adicionadas à avaliação histomorfométrica, a técnica é relativamente intensiva em mão-de-obra, particularmente para estudos de grande escala e de alto rendimento. Os dados coletados podem não ser reprodutíveis e comparáveis entre estudos devido a diferenças nos esquemas de contagem, algoritmos de computador e software utilizado.

Recentemente, acelerado pelo desenvolvimento de novos métodos de microscopia multifotônio de média resolução e folha de luz e métodos de limpeza de tecidos ópticos, técnicas de modelagem e análise 3D para ovários intactos estão se tornando o método de escolha para quantificar eficientemente os números de oócitos e estudar a localização e dinâmica de proteínas^37,38. Esses métodos 3D são tipicamente vantajosos em comparação com métodos histológicos, pois tecidos e órgãos são melhor preservados e mantidos intactos. Além disso, a análise e modelagem 3D fornecem insights adicionais sobre a função e interações dentro e entre nichos celulares ou subestruturas dentro do órgão que podem ser perdidas na análise 2D.

A análise 3D de órgãos inteiros requer otimização de protocolos de fixação, imunostação e limpeza óptica para órgãos individuais, como ovários, sem distorção tecidual ou danos. Uma otimização adicional da montagem da amostra para imagens é necessária para microscopia de alta resolução e pode depender da plataforma de imagem disponível. Finalmente, a imagem de todo o ovário intacto gera uma grande quantidade de dados para análises computacionais subsequentes. Portanto, é necessário desenvolver métodos 3D padronizados para contagem de oócitos para estudos comparativos e em estágios de desenvolvimento.

Este protocolo usa protocolos de limpeza padrão e previamente relatados, com foco em uma abordagem simples, fácil de usar e de alto rendimento 38,39,40,41. O protocolo é otimizado para analisar um grande número de ovários pré-natal e pós-natal até o pós-natal 28 (P28) e tamanhos variados de ovários de diferentes origens genéticas de camundongos. As etapas de imunossuagem são semelhantes para todas as etapas; no entanto, os protocolos de compensação diferem para ovários pubertal devido ao seu tamanho maior, ScaleS4(0) e CUBIC para ovários pequenos e grandes, respectivamente^40,41. Além disso, a perfusão do corpo inteiro é realizada em camundongos P28 antes da fixação para evitar a autofluorescência das células sanguíneas. Um microscópio multifotográfico foi construído sobre a plataforma Leica DIVE/4Tune como alternativa à microscopia de folha de luz para adquirir imagens, e foi escolhido um software de Visualização e Análise 3D IMARIS com várias ferramentas analíticas para este protocolo. Este protocolo é simples de seguir e menos prático, portanto economizando tempo. Além disso, a quantificação do oócito é relativamente rápida, dependendo do tamanho do ovário e arranjo de oócitos.

Protocolo

Todos os camundongos utilizados foram da cepa genética C57BL/6J (ver a Tabela de Materiais). Esta cepa foi totalmente sequenciada e é padrão para muitos estudos sobre estrutura ovariana e função. Os camundongos foram alojados de acordo com as diretrizes do NIH, e os procedimentos realizados foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Laboratório Jackson. Os reagentes e composições utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais e na Tabela 1, respectivamente.

1. Preparação de reagentes

1. Fixação: Prepare 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS. Por exemplo, para 24 amostras (0,5 mL/amostra = volume total de 12 mL), adicione 3 mL de 16% de microscopia eletrônica PFA a 9 mL de 1x PBS.
2. Tampão de permeabilização
   1. Meça o álcool polivinyl (PVA) em um béquer plástico de 250 mL contendo 1x PBS um dia antes do tampão de permeabilização ser necessário. Mexa a solução durante a noite para permitir que o PVA se dissolva completamente.
   2. Adicione boroidido de sódio ao PVA dissolvido e deixe a mistura homogeneizar por aproximadamente 3-5 min. Espere a solução para espumar.
   3. Adicione Triton X-100 à solução e use o buffer assim que o Triton X-100 for dissolvido.
      NOTA: O PVA leva muito tempo para se dissolver (pelo menos 3 h), e a penetração do anticorpo depende de quão bem ele se dissolve. Para ovários maiores, é crucial dissolver o PVA completamente.
3. Tampão de bloqueio
   1. Meça a albumina de soro bovino (BSA) em um béquer com 1x PBS. Mexa a solução até que o BSA seja dissolvido.
   2. Adicione glicina, Triton X-100, Penicilina-estreptomicina, e azida de sódio. Mexa até que a solução homogeneize. Transfira o buffer para uma garrafa e armazene a 4 °C. Adicione soro de cabra normal antes de usar.
4. Tampão de lavagem: Meça PVA em um béquer contendo 1x PBS. Mexa a solução durante a noite para permitir que o PVA se dissolva. Adicione Triton X-100 e azida de sódio. Uma vez que o buffer esteja misturado, armazene-o a 4 °C.
5. Solução ScaleS4(0) (pH 8.1): Dissolver D-sorbitol em PBS em um béquer com agitação a ≤100 °C. Adicione ureia à solução e, uma vez que a ureia se dissolva, desligue o fogo e deixe a solução mexer até dissolver completamente. Adicione glicerol e sulfóxido de dimetil e mexa até que a solução homogeneize. Armazene a solução à temperatura ambiente no escuro.
   NOTA: A solução ScaleS4(0) deve ser feita de novo no primeiro dia de compensação dos ovários.
6. Solução ScaleCUBIC-1
   1. Dissolva a ureia em um béquer contendo PBS com agitação à temperatura ≤100 °C. Meça N,N,N',N'-tetrakis (2-hidroxipropyl)etilenediamina em um béquer separado, em seguida, adicione a ureia dissolvida, e mexa a uma temperatura de ≤100 °C até que os reagentes se dissolvam completamente. Uma vez que todos os reagentes estejam em solução, desligue o fogo e esfrie à temperatura ambiente. Guarde no escuro.
   2. Desgas a solução transferindo-a para um frasco filtrante. Coloque o frasco no vácuo com tubos, cubra o frasco e ligue o vácuo até que as bolhas na solução desapareçam. Use a solução após este desgassing.
      NOTA: A solução pode ser armazenada no escuro para usar por até um mês.
7. Solução de sacarose: Dissolver sacarose em 1x PBS; em seguida, desgas a solução antes de usar.
   NOTA: Prepare a solução recentemente antes de usar.
8. Solução ScaleCUBIC-2
   1. Dissolva a sacarose em um béquer contendo PBS com agitação a uma temperatura ≤100 °C. Adicione a ureia e mexa a uma temperatura de ≤100 °C até que a ureia se dissolva. Desligue o fogo.
   2. Adicione trietanolamina e Tritão X-100. Mexa até que a solução homogeneize. Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente e armazene no escuro. Desgas a solução antes de usar.
      NOTA: A solução pode ser armazenada no escuro para usar por até um mês.

2. Dissecção e fixação de ovários pré-natais (Figura 1A)

1. Mate fêmeas adultas (≥8 semanas) e machos de acordo com o protocolo institucional aprovado. Verifique se há plugues vaginais todas as manhãs.
   NOTA: A manhã de um plugue vaginal é designada como 0,5 dias pós coitum (d.p.c) ou E0.5.
2. No dia da dissecção, prepare 4% de paraformaldeído (PFA) e alíquota ~0,5 mL em tubos de microcentrifuuge, colocados no lado do banco (~4 por fêmea grávida).
   NOTA: A PFA é uma substância perigosa e deve ser manuseada sob uma capa química.
3. Prepare três placas de 100 mm contendo ~10 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato de 1x (PBS) para cada fêmea grávida (para colheita do útero, para dissecar complexo mesonephros-ovário e isolar ovários).
4. Eutanize fêmeas grávidas que carregam embriões do estágio de desenvolvimento preferido e procedem à dissecção. Eutanize não mais do que 1-2 fêmeas de cada vez. Use um protocolo aprovado para a eutanásia de camundongos gestantes (por exemplo, exposição ao CO₂ seguida de luxação cervical).
5. Uma vez que uma fêmea é eutanizada, pulverize o abdômen com 70% de etanol. Usando fórceps, levante a pele abdominal e use uma tesoura para fazer uma incisão em forma de V através do abdômen e da parede do corpo. Corte ao longo dos dois lados da incisão e descasque a pele para expor os órgãos internos e fetos no útero.
6. Com fórceps e tesouras, corte e separe o útero com os fetos das artérias e veias abdominais e ovarianas. Remova o útero e coloque-o em uma placa de 100 mm contendo 1x PBS. Solte os fetos na PBS cortando a parede uterina e perfurando o saco de gema. Corte o cordão umbilical.
   NOTA: Para fetos menores de 15 dias de gestação, a eutanásia da mãe e a remoção do útero garantem a morte rápida do feto. Fetos com mais de 15 dias de gestação ao nascimento devem ser eutanizados pela decapitação.
7. Transfira um feto para uma nova placa com pbs 1x fresco. Para decapitar um feto E15.5, delicadamente fixar os dois blocos traseiros na placa com fórceps para imobilizar o feto. Usando um segundo par de fórceps na mão dominante, segure o pescoço entre os pinos fórceps e aperte para cortar a cabeça do feto, ou use uma tesoura para cortar o pescoço.
8. Com as fórceps dominantes, corte abaixo dos membros dianteiros e puxe suavemente a parte superior do corpo para longe. Em seguida, insira um ponto final das fórceps dominantes na cavidade peritoneal verticalmente na abertura da região abdominal, enquanto o outro ponto final dos fórceps permanece fora. Feche os fórceps, belisque a parede do corpo para cortá-la e exponha os órgãos internos.
9. Com os mesmos fórceps, remova suavemente os órgãos, incluindo os intestinos e fígado, até que o rim e os órgãos reprodutivos se tornem visíveis. Determine o sexo do feto: em E15.5, os ovários têm uma forma alongada de salsicha enquanto os testículos são ovais.
   NOTA: Em estágios anteriores, pode ser necessário genotipagem para determinar o sexo.
10. Usando um par de fórceps, segure o feto feminino para baixo e use os outros fórceps para agarrar cada complexo de mesonepros-ovário e separá-lo suavemente dos rins e dos dutos müllerianos. Coloque os ovários em uma nova placa com 1x PBS, deixe os mesonephros ligados, mas remova os tecidos circundantes para garantir que os ovários estejam expostos. Coloque ambos os ovários em ~0,5 mL de 4% pfa em tubos de microcentrifuus e fixe a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, substitua a PFA por 70% de etanol.
11. Para a dissecção e fixação dos ovários E18.5, separe os fetos do útero conforme descrito acima e siga o protocolo para filhotes prepubertal descritos na seção 3 (Figura 1B).

3. Dissecção e fixação de ovários pré-púbertes (Figura 1B)

1. Prepare 4% PFA e alíquota ~0,5 mL em tubos de 1,5 mL e coloque-os no lado do banco (~um tubo por filhote). Prepare placas de 35 mm com 1x PBS (~um por filhote). Eutanize os filhotes usando o protocolo institucional aprovado.
   NOTA: A decapitação é o método preferido de eutanásia para camundongos com 8 dias ou mais. Camundongos neonatais podem ser decapitados usando tesouras dissecando 3-4" ou tesoura mayo de 5-7".
2. Determine o sexo dos filhotes medindo a distância anogenital, que é maior em machos do que em fêmeas. Use uma tesoura de decapitação afiada para decapitar filhotes fêmeas. Coloque o corpo, de lado aberto para baixo, em uma toalha de papel para drenar o sangue (~5-10 s).
3. Segure o filhote em suas costas colocando um pino na pata de cada pé. Pulverize o abdômen com 70% de etanol. Use fórceps para manter a pele do filhote longe do corpo e use uma tesoura para fazer uma pequena incisão em forma de V na pele do abdômen inferior.
4. Insira a tesoura na incisão sob a pele e corte ao longo de ambos os lados do abdômen. Use as fórceps para descascar suavemente a pele e revelar o abdômen inferior. Mova suavemente o intestino para cima e localize os chifres uterinos próximos à bexiga. Siga cada chifre uterino em direção ao rim e localize o ovário com tecido adiposo circundante abaixo de cada rim.
5. Para dissecar os ovários, segure o chifre uterino abaixo do ovário e oviduto com um par de fórceps (fórceps A, Figura 1B) e levemente levantá-lo do corpo. Usando outro par de fórceps (fórceps B), segure suavemente por baixo do primeiro par de fórceps para que o ovário e oviduto na almofada adiposa sejam visíveis acima do segundo par de fórceps. Em seguida, corte abaixo do segundo par de fórceps com uma tesoura ou puxe cuidadosamente para desprender os ovários e os tecidos ligados.
6. Coloque os órgãos isolados em uma placa com 1x PBS. Corte o tecido adiposo extra, oviduto e chifre uterino para limpar e isolar o ovário. Delicadamente abra a bursa em torno do ovário e exponha todo o ovário.
7. Corte a membrana de bursa sem danificar o ovário e deixe o tecido ao redor do hilum (estrutura semelhante ao ligamento entre o ovário e o trato reprodutivo) para manusear o ovário, como mostrado na Figura 1B, P5. Uma vez que os ovários são aparados, coloque-os em 4% PFA e fixe os ovários a 4 °C durante a noite. No dia seguinte, substitua 4% de PFA por 70% de etanol e armazene os ovários a 4°C até a etapa do protocolo de imunossuagem.

4. Perfusão, dissecção e fixação de ovários pubertal (Figura 1C)

1. Ratos perfuse de acordo com protocolos institucionalmente aprovados com o rato sob anestesia profunda em um capuz de fumaça química. Prepare o equipamento de perfusão e os reagentes. Veja o protocolo detalhado em ⁴².
   NOTA: A perfusão é um procedimento terminal de eutanásia que substitui o sangue em todo o sistema vascular por um tecido fixador.
2. Pesar um rato fêmea pubertal (P28) e registrar o peso do rato (tipicamente entre 13 g e 15 g). Calcule a quantidade do agente de anestesia aprovado a ser utilizado.
   NOTA: Aqui, foi utilizado neste protocolo 0,35 mL de tribromoetanol por 10 g de peso corporal.
3. Use uma seringa descartável de 10 mL com uma agulha de 20 G para encher a seringa com o agente anestésico aprovado. Substitua a agulha de 20 G por uma agulha de 26 G x 3/8.
4. Contenha cuidadosamente o rato esmagando a pele dorsal do pescoço com uma mão. Vire o rato para expor o abdômen. Injete a quantidade previamente calculada de anestésico na cavidade peritoneal. Coloque o mouse em um recipiente com uma tampa até que a anestesia faça efeito (ou seja, o mouse não se move mais).
5. Uma vez que o mouse pare de se mover, aperte suavemente os pés para verificar se não há resposta e garantir que o mouse esteja totalmente anestesiado antes de iniciar a perfusão. Coloque e fixe o mouse em suas costas, fixando suavemente todas as quatro pernas através das patas em uma tábua. Certifique-se de que as pernas estão presas em uma posição relaxada, não sobrecarregadas.
6. Pulverizar o rato com 70% de etanol do abdômen para a região do peito. Use fórceps para beliscar suavemente e levantar a pele abdominal e, em seguida, usar uma tesoura para fazer um pequeno corte em forma de V através da pele e parede do corpo.
7. Retire a aba da pele da cavidade corporal e insira a tesoura abaixo da pele e da parede do corpo. Corte a pele e a parede do corpo em direção à cabeça até a borda da cavidade torácica no esterno.
8. Abra a cavidade torácica cortando cuidadosamente as costelas em ambos os lados do esterno para logo abaixo da escápula. Tome cuidado para não perfurar os pulmões abaixo da caixa torácica. Pegue os retalhos da pele/costela com fórceps e fixe-os para expor os órgãos internos.
9. Corte suavemente qualquer tecido, como o timo, que possa obstruir o acesso claro ao coração. Expor todos os órgãos, incluindo o trato gastrointestinal, para permitir a confirmação visual de que todo o corpo está perfumado, incluindo o abdômen inferior.
10. Use uma tesoura de dissecção para cortar o átrio direito do coração e liberar sangue do sistema. Segure suavemente o coração com fórceps e insira uma agulha de perfusão (conectada a um controlador de bomba peristáltica) no ventrículo esquerdo.
11. Bombear ~10 mL de PBS, com pressão suave, mas constante, até que tecidos como fígado, rins e trato reprodutivo (Figura 1E,F) vire de rosa para branco. Em seguida, substitua o PBS por PFA recém-feito e continue perfusão com aproximadamente 10 mL de PFA ou até que ocorra contração na parte inferior do corpo do mouse (por exemplo, cauda).
    NOTA: Estes tremores de fixação indicam perfusão bem sucedida.
12. Uma vez concluída a perfusão, localize a almofada de gordura com os ovários abaixo do rim e disseque suavemente todo o trato reprodutivo, incluindo a almofada de gordura, ovários e chifres uterinos, e coloque o trato em um frasco com 4% de PFA. Fixar os ovários à temperatura ambiente durante a noite (~16-24 h). Em seguida, substitua o PFA de 4% por 70% de etanol por pelo menos um dia e corte os ovários (Figura 1E,F), conforme descrito acima, antes de iniciar o protocolo de imunossuagem.

5. Imunostaining do ovário de montagem inteira (Figura 2A)

NOTA: Pratique técnicas estéreis durante o protocolo de imunossuagem, especialmente ao alterar tampões, para evitar contaminação durante períodos prolongados de incubação.

1. Realize todas as etapas de imunostaining em uma placa de 24 poços, como mostrado na Figura 2A. Ajuste os volumes de reagentes para outros formatos. Troque os buffers cuidadosamente para evitar a perda de pequenos ovários pré-natal e prepubertal.
   NOTA: Outros formatos, como placas de 48 e 96 poços, podem ser usados, mas os poços mais profundos e aberturas mais estreitas dificultam a aspiração de tampões sem perder ou danificar ovários.
2. Dia 1º
   1. Pipeta 1 mL de PBS/bem no número de poços necessários em uma placa limpa de 24 poços. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 200 μL para fazer uma abertura ampla e use-a para transferir suavemente os ovários pré-púrias de tubos de 1,5 mL com 70% de etanol para os poços. Para ovários pubertal, use uma ponta de pipeta de 1000 μL com a ponta cortada para a transferência.
      NOTA: A abertura mais ampla da ponta evita danos teciduais durante a transferência.
   2. Uma vez que todas as amostras são transferidas para os poços, use uma nova ponta para aspirar o PBS e substituí-lo por 0,8 mL fresco de PBS/well. Incubar as amostras à temperatura ambiente em um agitador a ~100-150 rpm durante a noite. Iniciar a preparação do tampão de permeabilização (ver Tabela 1 e seção 1).
      NOTA: A nova ponta impede que os ovários grudem na ponta, e a etapa de incubação do PBS permite que os ovários se equilibrem em PBS e reidratem antes da coloração.
3. Dia 2.
   1. Finalize a preparação do tampão de permeabilização. Aspire PBS dos poços e substitua-o por 0,8 mL do buffer de permeabilização por poço. Coloque as placas de volta no agitador e incubar as amostras em temperatura ambiente por 4h.
   2. Após 4h de incubação, aspire completamente o tampão de permeabilização e substitua-o por 0,5 mL de tampão de bloqueio (ver Tabela 1 e seção 1). Sele a placa com parafilm para evitar a evaporação, coloque em um recipiente bem coberto em um agitador e incuba as amostras com agitação suave no tampão de bloqueio durante a noite (16-24 h) à temperatura ambiente.
4. Dia 3.
   1. Prepare os anticorpos primários por diluição no tampão de bloqueio. Para visualizar oócitos, use marcadores de oócito, por exemplo, peptidase ácido nuclear anti-germe de rato (GCNA)/TRA98 para ovários pré-natais e prepubertais e helicase anti-DEAD-box 4 (DDX4)/homologue vasa de rato (MVH) para ovários pré-púrcis e pubertal. Para quantificar a expressão LINE-1 ORF1p em ovários pré-natais, use coelho anti-LINE-1 ORF1p ou outro anticorpo disponível.
      NOTA: O sinal GCNA/TRA98 não é detectável nos ovários pubertal.
   2. Aspire o tampão de bloqueio das amostras e substitua-o por 0,5 mL de anticorpos primários diluídos. Sele a placa com parafilm para evitar a evaporação. Coloque as placas em um recipiente com uma tampa para evitar o secagem das amostras durante a incubação. Coloque o recipiente no agitador e incubar as amostras por 3-4 dias em temperatura ambiente.
5. Dia 7.
   1. Remova suavemente o parafilme das placas e aspire a mistura de anticorpos primários das amostras. Armazene as misturas de anticorpos primários a 4 °C (por até um mês ou três usos) e reutilize-as posteriormente, suplementando-as com anticorpos frescos (por exemplo, 2 μL de aliquot de anticorpo fresco por 5 mL da mistura usada anteriormente).
   2. Adicione 1 mL de tampão de lavagem (ver Tabela 1 e seção 1) por poço às amostras e balance suavemente as placas por alguns segundos para enxaguar os anticorpos residuais. Aspire cuidadosamente e substitua o tampão de lavagem por 0,8 mL de tampão de lavagem fresco e agite as placas à temperatura ambiente durante a noite.
6. Dia 8.
   1. Aspire o tampão de lavagem durante a noite, substitua-o por 0,8 mL de tampão de lavagem fresco e agite à temperatura ambiente por 2h. Repita a etapa de lavagem com tampão de lavagem fresco por mais 2h.
   2. Após a última lavagem, substitua o tampão de lavagem por 0,5 mL de misturas secundárias de anticorpos diluídas em um buffer de bloqueio, por exemplo, a anti-rato de cabra Alexa Fluor 555 e a anti-coelho de cabra Alexa Fluor 647 a 1:1.000 diluição. Prepare a mistura de anticorpos secundários fresco para cada experimento de imunossuagem.
   3. Sele a placa com parafilme para evitar a evaporação durante a incubação. Incubar as amostras à temperatura ambiente no escuro ou em placas cobertas com papel alumínio com agitação suave por 3 dias.
      NOTA: Esta etapa e todas as etapas subsequentes ocorrem no escuro ou com envoltório de papel alumínio.
7. Dia 11.
   1. Aspire a mistura de anticorpos secundários e realize uma lavagem inicial com 1 mL de tampão de lavagem. Balance suavemente as placas por alguns segundos para enxaguar os anticorpos secundários residuais.
   2. Aspire o tampão de lavagem, substitua-o por 0,8 mL de tampão de lavagem fresco e incuba as amostras em temperatura ambiente por 2h com agitação, protegido da luz. Repita a etapa de lavagem 2 vezes para um total de 3 lavagens. Após a terceira lavagem, prossiga para a etapa de compensação (seção 6).

6. Limpeza de ovários de montagem integral imunossundo (Figura 2A).

NOTA: Realize todas as etapas de desobstrução no escuro, embrulhando as placas em papel alumínio ou colocação em recipientes opacos. As etapas de compensação diferem para ovários pré-púrdricas e pubertais.

1. Dia 11 [Ovários pré-natal e pré-púdulo são liberados em um protocolo de uma etapa]
   1. Após a última lavagem, aspire o tampão de lavagem e substitua-o por 0,8 mL de solução ScaleS4(0) recém-feita (ver Tabela 1 e seção 1). Sele a placa com parafilm e incuba as amostras no escuro com agitação à temperatura ambiente por três a quatro dias antes da imagem.
   2. Substitua a solução ScaleS4(0) por uma nova solução diariamente, se necessário; Tome cuidado ao substituir as soluções, pois os ovários limpos se tornam transparentes e são difíceis de ver. Após a limpeza, proceda à configuração da amostra e à imagem (seção 7).
      NOTA: A mudança de soluções não melhorou significativamente a qualidade da imagem. Mudanças diárias aumentam a probabilidade de perder amostras pequenas e principalmente transparentes.
2. Dias 11-15 [Ovários pubertal são limpos em um protocolo de duas etapas]
   1. Após a última lavagem imunossurgiante, aspire o tampão de lavagem e substitua-o por 0,8 mL de ScaleCUBIC-1 (ver Tabela 1 e seção 1). Sele a placa com parafilm e agite delicadamente amostras a 37 °C durante 3 dias no escuro. Substitua a solução ScaleCUBIC-1 pela solução fresca diariamente.
   2. No dia 15, lave as amostras 3 vezes por 10 minutos cada vez em 0,8 mL de PBS em temperatura ambiente com agitação suave. Substitua o PBS por 0,8 mL de sacarose de 20% preparada recentemente por PBS. Agite suavemente à temperatura ambiente por 1h.
   3. Substitua a solução de 20% de sacarose por 0,8 mL de solução ScaleCUBIC-2 (ver Tabela 1 e seção 1), sele a placa com parafilme e agite suavemente à temperatura ambiente com as mudanças diárias da Solução ScaleCUBIC-2. Limpe por 4-5 dias e prossiga para a imagem. Tome cuidado ao trocar soluções para evitar a perda de amostras, pois os ovários limpos são transparentes e difíceis de ver. Proceda à configuração da amostra e à imagem (seção 7).

7. Configuração e imagem de amostras com um microscópio multifotônio

NOTA: Todas as etapas descritas abaixo foram realizadas com um Leica DIVE/4TUNE/FALCON com dois lasers ti:sapphire multifotônio com duração de pulso de 120 fs com um objetivo de multi-imersão 16x/NA0.6 (líquido de imersão = glicerol) com uma distância máxima de trabalho de 2,2 mm. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o software de aquisição de imagens. Tabela Suplementar S1 e Figura Suplementar S1 mostram as configurações utilizadas para este protocolo. Para outras plataformas de imagem, consulte o núcleo de microscopia ou siga as especificações/recomendações dos fabricantes.

1. Configuração da amostra
   1. Prepare a configuração para a montagem das amostras. Por exemplo, use uma junta de silicone pegajosa e flexível para criar um poço adesivo. Coloque bem o adesivo em uma tampa de 25 mm x 25mm nº 1,5 micro para criar um poço no qual os ovários serão colocados (Figura 2B).
      NOTA: Uma junta de 1 mm de espessura acomoda todos os tamanhos dos ovários. Esta configuração é recomendada, pois elimina o movimento do ovário durante a imagem, o que pode ocorrer quando os ovários são colocados em montário em um prato de fundo de vidro.
   2. Utilizando uma ponta de pipeta com a ponta cortada (20 μL para pré-natal e prepubertal), transfira os ovários com ~5-10 μL de solução ScaleS4(0) para o meio do adesivo, bem como mostrado na Figura 2B. Para ovários pubertal, use uma ponta de pipeta de 200 μL com a ponta cortada o suficiente para transferir os ovários. Adicione ~15-20 μL da solução ScaleCUBIC-2 no meio do poço adesivo.
      NOTA: Muita solução pode causar vazamento no estágio do microscópio, e pouca solução resultará em má qualidade de imagem. Use um microscópio de dissecção para transferir amostras à medida que os ovários limpos se tornam transparentes e são difíceis de ver.
   3. Uma vez que os ovários são transferidos para poços individuais com uma gota de solução de compensação, coloque suavemente outro copo de cobertura no poço adesivo, pressione para criar um selo e mantenha as amostras no lugar em uma pequena piscina de solução de compensação sanduíche entre as duas tampas (Figura 2B). Para a imagem, coloque o "sanduíche" em um slide adaptador de microscópio impresso em 3D (por ^exemplo,43 ).
      NOTA: Os poços adesivos são reutilizáveis depois de desconstruir o "sanduíche" e lavar com água.
2. Imagem (Tabela Suplementar S1 e Figura Suplementar S1)
   1. Ligue o microscópio e o software de acordo com as diretrizes do núcleo de microscopia ou do fabricante. Coloque as amostras montadas no estágio do microscópio e olhe através da ocular para localizar a amostra iluminada com uma lâmpada de fluorescência LED de baixa potência.
   2. Uma vez localizadas as amostras, ligue o laser(s) e atribua cada detector a um corante/marcador Alexa Fluor específico. Para múltiplos lasers, permita a aquisição de imagens sequenciais. Adquira a pilha inteira antes de trocar lasers.
      NOTA: Para este protocolo, foi utilizado um laser para a aquisição de imagens de fluoroforos de 555 nm e 647 nm.
   3. Configure os parâmetros para aquisição de imagens de acordo com as especificações do núcleo de microscopia ou do fabricante. Use a aquisição bidirecional de imagem, se disponível, para reduzir o tempo de digitalização e melhorar a eficiência. Ajuste outras configurações, incluindo a média da linha (1), a média do quadro (1) e o acúmulo de quadros (1).
      NOTA: A aquisição de imagens bidirecionais permite que os lasers escaneiem em ambas as direções à medida que se movem no eixo X.
   4. Configure o Z-Stack identificando o início (parte inferior da tampa de vidro da amostra/inferior) e a posição final (parte superior da tampa de vidro da amostra/superior). Selecione um tamanho de passo Z de 2 μm para ovários pré-púbertes e 5 μm para ovários pubertal.
   5. Ative o recurso de compensação Z e, dentro deste recurso, ative o ganho de excitação. Defina a compensação Z para a parte inferior e superior da amostra selecionando uma intensidade laser tanto para a parte inferior (baixa intensidade) quanto para a pilha superior (alta intensidade). Veja Figura Suplementar S1, Linear Z-compensação, onde a caixa de ganho de excitação é selecionada, e a intensidade do laser para a parte inferior (0) e superior (347,75) é definida como 10 e 12, respectivamente.
   6. Use o modo de revestimento para amostras maiores que não podem ser capturadas em um único campo de visão. Ative o navegador de imagem e indique o número de telhas necessárias para capturar toda a amostra usando a ferramenta de marcação retangular.
   7. Inicie a aquisição da imagem. Para imagens com múltiplas telhas, inicie a aquisição de imagens com o navegador para capturar todas as telhas. Uma vez concluída a aquisição da imagem, primeiro salve todas as imagens e, se várias telhas foram adquiridas, execute a ferramenta de fusão de mosaico para mesclar as telhas em uma única imagem.
   8. Salve os arquivos mesclados em uma pasta de projeto separada para facilitar o trabalho com as imagens do tamanho de Gigabyte. Transfira os arquivos para processamento de imagens com software de visualização e análise de imagens 3D. A Figura 3 mostra imagens representativas tiradas em diferentes estágios com dois marcadores (GCNA e DDX4).

8. Processamento de imagens

NOTA: Todas as etapas descritas abaixo foram desenvolvidas e realizadas utilizando o software de visualização e análise de imagens 3D IMARIS.

1. Importe a imagem no software de visualização e análise de imagens 3D e, se necessário, converta os arquivos do formato original (por exemplo, .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2) para o formato .ims.
2. Se necessário, processe as imagens com o filtro gaussiano para reduzir a pixelação (Figura 4A). Usando o recurso de exibição 3D , posicione a imagem e desmarque a opção de quadro (para remover o quadro).
   NOTA: Existem outros filtros opcionais, que também podem ser usados para diminuir a pixelação e reduzir a intensidade de fundo.
3. Amplie a imagem para uma escala específica e use o recurso Snapshot. Defina as preferências da seguinte forma: selecione 300 DPI, salve como Imagem TIFF e Fundo Transparente. Tire uma foto da imagem e salve-a. A Figura 3 mostra imagens completas montadas.

9. Quantificação oólito

NOTA: A imunofluorescência do ovário total e a visualização e análise de imagem 3D podem ser utilizadas para a estimativa de números de oócitos em ovários inteiros (Figura 3 e Figura 4) utilizando o recurso Spot. O sinal GCNA pode ser usado para quantificar oócitos em ovários pré-natais e pré-púbertes, como mostrado na Figura 4 (P5). Nos ovários pubertal, use o sinal DDX4 para quantificar duas populações de oócitos em folículos não em crescimento (estrutura "tipo anel", seta fechada) e folículos em crescimento (grandes estruturas, seta aberta, Figura 4, P28).

1. Determine o tamanho dos oócitos que serão usados como parâmetro para quantificar oócitos com o recurso Spots na etapa 9.2.
   1. Abra a imagem e selecione a opção Cortar para abrir a imagem de pilha Z.
   2. Selecione a opção Linha no painel Medir e meça a distância desenhando uma linha de uma borda de um oócito/marcador para a outra borda no ponto mais largo para determinar o diâmetro XY do tipo/tamanho oócito a ser contado. Mova-se através da pilha e obtenha a faixa de diâmetros para vários oócitos do mesmo tipo. Use o comprimento mais curto como critério de seleção de tamanho para contagens de oócito.
2. Característica de pontos : Selecione a opção Exibir 3D e ative a função Adicionar novos pontos no painel Cena para abrir o painel Algoritmo . Desmarque todas as configurações do algoritmo, pois será utilizado o filtro de seleção de tamanho com o tamanho do oócito obtido na etapa 9.1.
   1. Clique na seta única para a frente para mover-se para o Canal fonte. Selecione o Canal com o marcador e digite o diâmetro XY estimado obtido na etapa 9.1. Por exemplo, utilize um diâmetro XY estimado de 7 μm para oócitos pré-natais e 11 μm para oócitos P5 (GCNA = sinal verde; Figura 3 e Figura 4A).
   2. Use 30 μm para o sinal DDX4 para estimar o número de oócitos em folículos em crescimento em ovários P5 (DDX4 = sinal magenta; Figura 3 e Figura 4A). Para ovários pubertais, use o sinal DDX4 para quantificações de oócitos. Por exemplo, use diâmetros XY de 15 μm e 80 μm para identificar oócitos dentro de folículos não em crescimento e folículos em crescimento, respectivamente, como mostrado na Figura 4A.
      NOTA: O tamanho selecionado pode variar devido aos critérios de aquisição de imagens e ao tipo de microscópio utilizado. A seleção também pode variar entre as cepas genéticas, pois os ovários com mais oócitos exigirão seleções de tamanho menor para melhor detecção automatizada de oócitos.
   3. Após a seleção de tamanho, ative o modelo de alongamento do PSF e subtração de fundo, que são automaticamente determinados. Selecione a única seta para a frente para mover-se para o painel Pontos de filtro . Adicione o filtro Qualidade e determine um limiar. Para garantir a estimativa precisa dos números de oócitos, amplie a imagem à medida que o limiar é ajustado para escolher um valor limiar que seleciona a maioria dos oócitos. Clique na seta dupla para terminar contagens automatizadas.
   4. Verifique manualmente os oócitos selecionados usando a guia Editar para selecionar oócitos perdidos ou desmarcar partículas não oócitos selecionadas pelo limiar automático. Registo os dados na guia Estatísticas na guia Geral para análise suplementar.
      NOTA: Os parâmetros utilizados para a contagem das manchas podem ser salvos e utilizados para outro conjunto de amostras, mas recomenda-se fazer uma verificação manual antes de executar a análise do lote.
   5. Para armazenar os parâmetros, clique na guia Criação e clique em Armazenar parâmetros para lote.
      NOTA: Os marcadores nucleares (oócitos GCNA+, Figura 4A) são facilmente identificados pelo recurso spot e podem não exigir muito ajuste manual. No entanto, o marcador citoplasmático (Oócito DDX4+, Figura 3 (P28, seta fechada) e Figura 4A exigirá mais ajuste manual para garantir a identificação do tamanho/tipo correto de oócitos.

10. Quantificando a expressão proteica em ovários

NOTA: Existem várias maneiras de quantificar a expressão oótida de marcadores específicos usando o recurso Spots (seção 9 e passo 10.1) e o recurso Superfícies (etapa 10.2). O recurso Spots pode ser usado para proteínas com padrões de localização distintos, como marcadores nucleares (GCNA), e o recurso Superfícies pode ser usado para proteínas com padrões de localização não uniformes, como mostrado na Figura 5A , onde as intensidades LINE-1 ORF1p em ovários E15.5 e E18,5 foram medidas. Para calcular e comparar a intensidade da proteína de interesse entre duas amostras (por exemplo, pontos de tempo, tratamentos ou genótipos), coletar imagens com as mesmas propriedades. Use amostras com um sinal mais intenso para determinar os parâmetros que podem ser armazenados e utilizados para as outras amostras.

1. Para obter a expressão proteica com o recurso Spots , primeiro identifique os oócitos como destacado (seção 9).
   1. Em seguida, no recurso Pontos , selecione a guia Estatísticas , seguido da guia Detalhado . Clique na seta para baixo e selecione Valores Específicos, que abrirá outra guia abaixo dela contendo diferentes medidas. Selecione a Média de Intensidade do canal usado para a geração de superfície (ou selecione outras medidas de intensidade, como a Mediana da Intensidade).
   2. Para obter as informações estatísticas combinadas/médias, selecione o critério valores médios . Uma vez feito, exporte e salve dados para análises posteriores.
2. Para obter a expressão proteica com o recurso Superfícies , abra a imagem, selecione a opção 3D View e ative a função Adicionar novas superfícies no painel Cena para abrir o painel Algoritmo . Desmarque todas as configurações do algoritmo se não for necessário e clique na única seta para a frente para mover-se para o Canal de Origem.
   1. Selecione o Canal com o sinal de anticorpo para medir. Outras propriedades a serem selecionadas são opções específicas do usuário. Aqui, o sinal LINE-1 foi usado como marcador. Os valores de Detalhamento de Superfícies e Subtração de Fundo (Contraste Local) foram mantidos em valores padrão de 1,42 e 5,33, respectivamente.
   2. Clique na seta dianteira para mover-se para o painel Limiar . Escolha um valor de limiar comparável em ambas as amostras (por exemplo, aqui, a expressão LINE-1 em E18.5 foi usada para escolher um limiar). Selecione Habilitar com um diâmetro de pontos de semente padrão de 7.10 (este valor foi encontrado ideal para as imagens, mas pode depender do tamanho esperado de pixels de recursos).
   3. Clique na seta dianteira para mover-se para o painel Superfícies do filtro . Utilizou-se um filtro de qualidade e basear o valor, como no valor limiar , na expressão das proteínas em ambas as amostras de ovário. Uma vez selecionada a propriedade do filtro, clique na seta dupla para a frente para completar a geração da superfície.
   4. Para obter os valores de intensidade, selecione a guia Estatísticas , seguida pela guia Detalhado . Clique na seta para baixo e selecione Valores Específicos, que abrirá outra guia abaixo dela contendo diferentes medidas.
   5. Selecione a Média de Intensidade do canal utilizado para a geração de superfície (ou selecione outras medidas de intensidade, como a mediana da intensidade).
   6. Para obter as informações estatísticas combinadas/médias, selecione o critério valores médios . Uma vez feito, exporte e salve os dados para análise suplementar (Figura 5C).

11. Estimativa do total de oócitos em ovário danificado com correção computacional

NOTA: Se ocorrer um pequeno dano no ovário durante a dissecção, pode ser possível estimar computacionalmente a contagem total de oócitos. Recomenda-se o uso de ovários intactos da mesma cepa e estágio de desenvolvimento para estimativa de número de oócito, como mostrado na Figura 6. Simulações realizadas com ovários em E15.5 indicam que a correção para uma perda de ≥30% resulta em um desvio significativo dos números reais (Figura 6C).

1. Abra imagens de ovários intactos com IMARIS e selecione o recurso Quadro . Nas configurações do quadro, selecione as etiquetas Box, Grade, Tickmarks e Axis . Na guia Posição X/Y/Z , selecione 200 μm para gerar marcas de tique-taque com 200 μm em todas as posições X/Y/Z.
   NOTA: As marcas de tique-taque criam uma grade/régua em aviões X, Y e Z para identificar oócitos dentro de uma região específica.
2. Ative o recurso Manchas para identificar os oócitos como destacado na seção 9 (Figura 4). Crie um modelo 3D usando os oócitos identificados em todos os ovários intactos que estão sendo usados para a simulação, selecionando esfera sob a guia Estilo de pontos/Qualidade no recurso Pontos .
   NOTA: A largura do pixel também pode ser alterada na guia Estilo de pontos/Qualidade .
3. Com a caixa gerada na etapa 11.1, alinhe os modelos 3D dos ovários intactos na mesma orientação mostrada na Figura 6A.
4. Usando as marcas de 200 μm (etapa 11.1), selecione oócitos que se enquadram em 50% do volume de cada ovário. Clique no recurso Manchas e selecione Editar rótulos para classificar os oócitos que se enquadram na região de 50% por cor, como mostrado na Figura 6A.
   NOTA: Uma vez classificados os oócitos em uma região, será fornecido o número de oócitos que se enquadram em cada classe.
5. Amplie na região de 50% e altere as marcas de tique-taque de 200 μm para 50 μm para fazer uma régua menor para identificação de oócitos. Mantenha o zoom % em todas as imagens. Com as marcas de 50 μm como guia, divida a região de 50% em cinco partes iguais.
   NOTA: Os oócitos dentro de cada parte representarão 10% do volume como destacado na Figura 6A, onde um ovário intacto mostra oócitos na metade superior do ovário classificados por cinco cores diferentes com cada cor representando oócitos dentro de uma região volumosa de 10%.
6. Registre os números de oócitos em cada região de 10%, como mostrado na Figura 6A,B. Calcule o número médio de oócitos para incrementos de 10, 20, 30, 40 e 50%.
7. Utilize o destaque nas etapas 11.1 a 11.6 para obter números de oócito no ovário parcial danificado. Posicione o ovário danificado na mesma orientação dos ovários intactos e estime o volume/porcentagem ausente conforme descrito acima.
8. Para estimar o número total de oócitos em todo o ovário, adicione o número médio de oócitos calculado para um volume semelhante ao número obtido do ovário parcial (Figura 6B).

Resultados

A imunostenção e a imagem de todo o ovário permitem a visualização e quantificação de oócitos ou expressão proteica em ovários em diferentes estágios de desenvolvimento usando a mesma técnica e marcadores (Figura 3). Este protocolo foi desenvolvido para um projeto em larga escala no qual era necessária a análise dos ovários em múltiplos estágios e a partir de múltiplas cepas de camundongos. Aqui, apresentamos dados coletados para a cepa C57BL6/J, uma cepa padrão para anál...

Discussão

Este artigo apresenta um protocolo detalhado de imunostaining 3D e de imagem para ovários pré-natais e pós-natais para estudos de alta produtividade e comparativos para quantificação de células germinativas e localização de proteínas. Desenvolvemos este protocolo para analisar os números de oócitos em ovários (N=6-12) em seis pontos de tempo de desenvolvimento em 10-16 cepas diferentes, onde 2-4 placas de 24 poços são tipicamente processadas ao mesmo tempo. Este método pode ser adaptado para outros órgão...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benchtop Incubator	Benchmark Scientific	H2200-H	37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	97061-416
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D1435	Hazardous material
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S6021
Dumont #5 Forceps	FST	91150-20
FastWells Reagent Barriers	GraceBio	664113	Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors	FST	91460-11
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025
Glycine	ThermoFisher Scientific	BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21246	Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21434	Dilution 1:1000
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
IMARIS Software	Oxford Instruments	Version 9.7.0	Image visualization and analysis software
Insight X3	Spectra-Physics	InSight X3 Tunable Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
LASX software	Leica	Version 3.5.6	Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON	Leica	Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406	Multiphoton Microscope
MaiTai HP	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller	SPW Industrial	Model: 7553-50	Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors	FST	14010-17	5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm	VWR	48366-249
Mini BioMixer	Benchmark Scientific	B3D1020	shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270	Leica	SMZ1270	stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)	Electron Microscopy Sciences	15710	Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline	ThermoFisher Scientific	BP2944100	Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution	ThermoFisher Scientific	ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)	Sigma-Aldrich	122262
Rabbit anti-DDX4/MVH	Abcam	ab27591	Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p	Abcam	ab216324	Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA	Abcam	ab82527	Dilution 1:500
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Hazardous material
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882	Hazardous material
Sucrose	ThermoFisher Scientific	S0389
Tekmar Orbital Shaker	Bimedis	VXR-S10	shaker for room temperature
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
UNOLOK Infusion Set	MYCO Medical	7001-23	needles for perfusion
Urea	Amresco	97061-920
X-Cite 120LED	Excelitas	S/N XT640-W-0147	low-power LED fluorescence lamp