Ein TNBS-induziertes Nagetiermodell zur Untersuchung der pathogenen Rolle von mechanischem Stress bei Morbus Crohn

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Entwicklung eines Morbus Crohn-ähnlichen Colitis-Modells bei Nagetieren. Eine transmurale Entzündung führt zu einer Stenose an der TNBS-Instillationsstelle, und eine mechanische Vergrößerung wird im Segment proximal zur Stenose beobachtet. Diese Änderungen ermöglichen die Untersuchung der mechanischen Belastung bei Colitis.

Zusammenfassung

Entzündliche Darmerkrankungen (IBD) wie Morbus Crohn (CD) sind chronisch entzündliche Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes, von denen etwa 20 pro 1.00.000 in Europa und den USA betroffen sind. CD ist gekennzeichnet durch transmurale Entzündungen, Darmfibrose und Luminalstenose. Obwohl entzündungshemmende Therapien helfen können, Entzündungen zu kontrollieren, haben sie keine Wirksamkeit bei Fibrose und Stenose bei CD. Die Pathogenese der CD ist nicht gut verstanden. Aktuelle Studien konzentrieren sich hauptsächlich auf die Abgrenzung von dysregulierten Immunantwortmechanismen des Darms. Während CD-assoziierte transmurale Entzündungen, Darmfibrose und luminale Stenose alle eine mechanische Belastung der Darmwand darstellen, ist die Rolle der mechanischen Belastung bei CD nicht gut definiert. Um festzustellen, ob mechanischer Stress eine unabhängige pathogene Rolle bei CD spielt, wurde ein Protokoll des TNBS-induzierten CD-ähnlichen Kolitis-Modells bei Nagetieren entwickelt. Dieses TNBS-induzierte transmurale Entzündungs- und Fibrosemodell ähnelt pathologischen Kennzeichen von CD im Dickdarm. Es wird durch intrakolonische Instillation von TNBS in den distalen Dickdarm erwachsener Sprague-Dawley-Ratten induziert. In diesem Modell führt eine transmurale Entzündung zu einer Stenose an der TNBS-Instillationsstelle (Site I). Mechanische Dehnung wird in dem Teil proximal zur Instillationsstelle (Site P) beobachtet, der mechanische Belastung, aber keine sichtbare Entzündung darstellt. Der distale bis zur Entzündung (Punkt D) distale Dickdarmabschnitt stellt weder eine Entzündung noch eine mechanische Belastung dar. Markante Veränderungen der Genexpression, der Immunantwort, der Fibrose und des Wachstums der glatten Muskulatur an verschiedenen Stellen (P, I und D) wurden beobachtet, was einen tiefgreifenden Einfluss mechanischer Belastungen hervorhebt. Daher wird uns dieses Modell der CD-ähnlichen Kolitis helfen, die pathogenen Mechanismen von CD besser zu verstehen, insbesondere die Rolle von mechanischem Stress und mechanischer stressinduzierter Genexpression bei Immundysregulation, Darmfibrose und Gewebeumbau bei CD.

Einleitung

Entzündliche Darmerkrankungen (IBD), einschließlich Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD), sind durch chronische Entzündungen im Magen-Darm-Trakt (GI) gekennzeichnet. Es betrifft ~ 1-2 Millionen Amerikaner¹. Die geschätzten jährlichen Kosten für die IBD-Pflege in den USA belaufen sich auf 11,8 Milliarden US-Dollar. Im Gegensatz zu UC ist die CD durch transmurale Entzündung und Strikturbildung gekennzeichnet ^2,3. Strikturbildung (Stenose) tritt bei bis zu 70% der CD-Patienten^{auf 3} und kann durch transmurale Entzündung (entzündliche Stenose) oder Darmfibrose (fibrotische Stenose) verursacht ^werden4,5. Darmfibrose ist gekennzeichnet durch übermäßige Kollagenablagerung und andere extrazelluläre Matrizen (ECM) mit glatten Muskelzellen (SMC) als einer der wichtigsten mesenchymalen Zelltypen, die an dem Prozess beteiligt^{sind 3,4.} Die mit Hypertrophie assoziierte Hyperplasie der glatten Muskulatur ist eine weitere signifikante histologische Veränderung der fibrotischen Stenose bei CD⁶. Obwohl die Strikturbildung bei CD mit chronischen Entzündungen verbunden ist, ist keine entzündungshemmende Behandlung wirksam, außer der chirurgischen Behandlung ^2,6. Die rezidivierenden Fälle nach der Operation betragen jedoch fast 100%, wenn genügend Zeit^{zur Verfügung gestellt wird 2,7}. Als Entzündungsreaktion können sich Fibrose und SMC-Hyperplasie auch bei nicht-entzündlichen Zuständen (d.h. Darmverschluss) im Darm entwickeln ^8,9; Es wird angenommen, dass sowohl entzündungsabhängige als auch unabhängige Mechanismen an der Strikturbildung beteiligt^{sind 3,4}. Angesichts der Tatsache, dass umfangreiche Forschungen zu den entzündungsabhängigen Mechanismen keine wirksame Therapie für die Strikturbildung geführt haben, sind Studien zur möglichen Rolle entzündungsunabhängiger Mechanismen bei Darmfibrose erforderlich.

Als nicht-entzündlicher Faktor tritt mechanischer Stress (MS) im Zusammenhang mit Ödemen, Infiltration entzündlicher Zellen, Gewebedeformation, Fibrose und Stenose^10,11,12,13 häufig bei IBD auf^, insbesondere bei CD, die durch transmurale ^{Entzündungen} gekennzeichnet ist. Mechanischer Stress ist am bemerkenswertesten bei stenotischer CD, wo Stenose (entzündlich oder fibrotisch) an der Entzündungsstelle mechanische Belastung im lokalen Gewebe darstellt und zu Lumendehnung im Segment proximal zur Obstruktionsstelle führt^10,14. Frühere In-vitro-Studien haben gezeigt, dass mechanischer Stress die Genexpression spezifischer Entzündungsmediatoren (d. h. COX-2, IL-6)8,14,15 und Wachstumsfaktoren (d. h. TGF-β) im Magen-Darm-Gewebe, insbesondere der glatten Darmmuskelzellen (SMC)^16, verändert^. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass die Expression spezifischer profibrotischer Mediatoren wie des Bindegewebswachstumsfaktors (CTGF) sehr empfindlich auf mechanische Belastung reagiert^17,18. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass mechanischer Stress eine unabhängige pathogene Rolle bei CD-assoziierten Entzündungen, Fibrosen und Gewebeumbauten spielen könnte. Die pathogene Bedeutung von mechanischem Stress bei Darmentzündungen, Fibrosen und Hyperplasie der glatten Muskulatur bei der KV bleibt jedoch weitgehend unerforscht. Dies kann zum Teil daran liegen, dass Entzündungen ein sichtbarerer und besser untersuchter Prozess sind als mechanischer Stress. Noch wichtiger ist, dass es kein klar definiertes Tiermodell von IBD gibt, um die Wirkung von mechanischem Stress von der von Entzündungen zu unterscheiden.

Die aktuelle Arbeit beschreibt ein Nagetiermodell der Morbushuhn-ähnlichen Colitis, die durch intrakolonische Injektion von Hapten Reagenz 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) ^19,20 induziert wird, das dem Zweck dienen könnte^, die Rolle der mechanischen Belastung bei CD zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass die TNBS-Instillation eine lokalisierte (~ 2 cm lange) transmurale Entzündung mit Lumenverengung (Stenose) im distalen Dickdarm induzierte. Die Stenose führt zu einer ausgeprägten Darmdehnung (mechanische Belastung^)14,15, aber nicht zu einer sichtbaren Entzündung im Dickdarmsegment proximal zur Instillationsstelle. Im Gegenteil, das zur Stenosestelle distale Dickdarmsegment stellt weder eine Entzündung noch eine mechanische Belastung dar. Signifikante ortsspezifische Veränderungen in der Genexpression, Entzündung, Fibrose und SMC-Hyperplasie wurden an den drei verschiedenen Stellen beobachtet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass mechanischer Stress, insbesondere die mechanische, stressinduzierte Genexpression, eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Fibrose und Hyperplasie bei Morbus Crohn Colitis spielen kann.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach dem institutionellen Komitee für Tierpflege und -nutzung der University of Texas Medical Branch (#0907051C) durchgeführt. Männliche oder weibliche Sprague-Dawley-Ratten, ~ 8-9 Wochen alt, wurden für die Studie verwendet.

1. Tierpräparation

1. Fasten Sie Ratten für 24 h und behandeln Sie sie über Nacht mit Abführmittel (Darmreiniger, siehe Materialtabelle).
2. Am nächsten Tag betäuben Sie Ratten mit einem Anästhesiesystem (siehe Materialtabelle), indem Sie sie während der TNBS-Verabreichung 2% Isofluran zusammen mit 1 l / min Sauerstoff aussetzen. Überprüfen Sie auf Reflexe oder Quetschzehen, um die Anästhesie zu bestätigen.
3. Bereiten Sie frische TNBS-Lösung entsprechend dem Körpergewicht vor.
   HINWEIS: TNBS - 65 mg/kg Körpergewicht in 250 μL 40% Ethanol wurden verwendet.
4. Setzen Sie Ratten in Rückenlage auf den Anästhesietisch. Um Colitis zu induzieren, führen Sie durch den Anus einen medizinischen offenen Polyurethankatheter für ~ 7-8 cm vom Analrand ein und instillieren Sie vorsichtig TNBS (hergestellt in Schritt 1.3) in den Dickdarm¹⁹. Verabreichen Sie die Scheinkontrollratten nur mit 250 μL Kochsalzlösung.
5. Nach dem Einträufeln von TNBS oder Kochsalzlösung halten Sie die Ratten in Rückenlage und leicht mit dem Kopf nach unten (~ 30 °), wobei der Anus für 2 Minuten geschlossen ist, um die TNBS-Verteilung zu unterstützen und Verschüttungen zu vermeiden.
6. Versorgen Sie Ratten 7 Tage lang ad libitum mit Nahrung und Wasser und beobachten Sie die Ratten täglich auf Körpergewicht, Nahrungsaufnahme, Kot und allgemeinen Gesundheitszustand.

2. Gewebepräparate

1. Am Tag der Euthanasie die Ratten mit CO 2-Inhalation einschläfern und Euthanasie mit zervikaler Luxation bestätigen_.
2. Öffnen Sie den Hinterleib der Ratte mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette.
3. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Dickdarm (oberhalb des Analkanals) und übertragen Sie den Dickdarm sofort in den eiskalten 1x HBSS-Puffer.
4. Begradigen Sie den Doppelpunkt im Puffer und messen Sie die Dickdarmlänge mit einem Lineal. Nehmen Sie Nylonfaden und kreisen Sie um den Dickdarm, um den äußeren Umfang der Dickdarmsegmente in Kontroll- und TNBS-behandelten Ratten zu messen. Nehmen Sie Gewebe in voller Dicke für die Histologie.
5. Schneiden Sie den Dickdarm entlang der mesenterialen Tafel auf und reinigen Sie den Dickdarm gut mit HBSS-Puffer. Beurteilen Sie den Dickdarm für makroskopische Entzündungswerte basierend auf den zuvor beschriebenen Kriterien¹⁹ mit minimalen Modifikationen.
   HINWEIS: 0 = normale Schleimhaut; 1 = lokalisierte Hyperämie, aber keine Erosionen oder Geschwüre; 2 = Geschwür und Stenose (betroffener Bereich < 5 mm); 3 = schweres Geschwür, Narbe und Stenose (betroffener Bereich > 5 mm).
6. Sammeln Sie Kolongewebeproben von der Stelle P (Portion 2-3 cm vor dem oralen Rand der Entzündungsstelle), der Stelle I (Entzündungsstelle, typischerweise 4-6 cm vom Ende des Dickdarms, wo TNBS eingeträufelt wird) und der Stelle D (Portion 1-2 cm distal bis zum Aboralrand der Entzündungsstelle) bzw. von TNBS-behandelten Ratten.
   HINWEIS: Aus jedem Segment wurde Dickdarmgewebe von ~ 1-2 cm Länge entnommen. Zusätzlich wurden die 2 cm langen Dickdarmgewebe (~4-6 cm vom Ende des Dickdarms) der mit Kochsalzlösung behandelten Ratten als Scheinkontrolle (S) entnommen (Abbildung 1).
7. Entnehmen Sie Gewebeproben von jeder Stelle für die Präparation in voller Dicke und, falls gewünscht, Schleimhaut-/Submukosa- bzw. Muscularis externa-Schichten sowie^21,22.
8. Gewebeproben zunächst in flüssigem Stickstoff einfrieren, bevor sie bei -80 °C gelagert werden, um sie bis zu einem Jahr und für zukünftige Zwecke (z. B. RNA-Präparate) zu lagern.

3. Histopathologische Beurteilung von Darmentzündungen und Fibrose

1. Fixieren Sie das Dickdarmgewebe in voller Dicke in 10% Formalin für 48 h und übertragen Sie es dann für 24-48 h auf 70% Ethanol.
2. Verwenden Sie ein Mikrotom, um Paraffinabschnitte von 5 μm Dicke für Hämatoxylin und Eosin (H & E) bzw. Massons Trichromflecken ^6,19,23 (siehe Materialtabelle) zu schneiden.
3. Erfassen und betrachten Sie Bilder mit einem aufrechten Mikroskop, das mit einer hochauflösenden Kamera mit kompatibler Software ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
4. Grad Entzündungs- und Fibroseindizes von zwei unabhängigen Prüfärzten, darunter ein gastrointestinaler chirurgischer Pathologe nach zuvor beschriebenen Kriterien ^6,23 mit Modifikationen. Siehe Ergänzende Datei 1 für die Partituren.
5. Messen Sie die Dicke und Zellzahl der kreisförmigen und longitudinalen Muskelschichten pro Querschnitt in vier Ansichten jeder H & E-gefärbten Probe und nehmen Sie den Mittelwert der vier Messungen für jede Probe.

4. RNA-Extraktion und quantitative RT-PCR

1. Homogenisieren Sie herausgeschnittenes Dickdarmgewebe, das aus der Scheinkontrolle und drei Stellen (P, I, D) von TNBS-Colitis-Ratten im Extraktionsreagenz eines RNA-Extraktionskits gewonnen wurde (siehe Materialtabelle).
2. Isolieren Sie RNA aus jeder Probe mit dem Kit. Eluieren Sie das RNA-Pellet in 30 μL RNase-freiem Wasser.
3. Quantifizieren Sie die RNA-Konzentration und überprüfen Sie die Reinheit mit einem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).
4. Verwenden Sie 1 μg Gesamt-RNA, um cDNA^21,22 mit dem RNA-Synthese-Kit zu synthetisieren (siehe Materialtabelle).
5. Analysieren und quantifizieren Sie die Genexpression durch Durchführung einer Echtzeit-PCR mit 50 ng cDNA als Vorlage, Sonden von IL-6 und CTGF unter Verwendung eines kommerziellen PCR-Kits für ein Echtzeit-PCR-System (siehe Materialverzeichnis).
6. Verwenden Sie das Kontrollgen 18S rRNA, um die Proben zu normalisieren und die relative Genexpression unter Verwendung der erhaltenen Cq-Werte zu quantifizieren.

5. Statistische Auswertung

1. Verwenden Sie statistische Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien), um Scheinkontroll- und TNBS-Colitis-Ratten zu vergleichen.
2. Betrachten Sie den p-Wert < 0,05 als statistisch signifikant^15,19.
3. Um die Unterschiede zwischen zwei Gruppen zu testen, verwenden Sie die t-Test-Analyse von Student und führen Sie einen ANOVA-Test durch, wenn die Vergleiche mehr als zwei Gruppen^{umfassen 15,19}.

Ergebnisse

Makroskopische Ansicht der Morbus-Crohn-ähnlichen Colitis, induziert durch intrakolonische Instillation von TNBS
Wie in Abbildung 1 gezeigt, induzierte die intrakolone Instillation von TNBS bei Ratten eine lokalisierte transmurale Entzündung (~ 2 cm lang) mit verdickter Darmwand und verengtem Lumen (Stenose) an der Instillationsstelle im distalen Dickdarm (Abbildung 1A). Der Ort der TNBS-Instillation wird als Standort I bezeichnet. Als Folg...

Diskussion

TNBS-induzierte Kolitis wurde 1989 eingeführt und wird seit 19,20,23 als experimentelles Modell für Morbus Crohn verwendet. Wesentliche Merkmale dieses Modells bei Nagetieren sind die Entwicklung einer transmuralen Entzündung, die den histopathologischen Läsionen, die bei menschlichem Morbus Crohn entwickelt wurden, sehr ähnlich ist^19,20. Frühere Studien zum Modell...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63	Nikon	DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BIO-RAD	1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems	BIO-RAD	1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer	Dako	AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173	Dako	AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera	Nikon	DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control	ThermoFisher Scientific	4352930E
E-Z Anesthesia	E-Z Systems Inc.	EZ-155
GraphPad Prism 9	GraphPad	9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear	BIO-RAD	HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium)	CORNING	21-021-CV
HM 325 Microtome	Thermo Scientific	23-900-667
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System	LI-COR	9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler	Eppendorf	5341
Medical grade open end polyurethane catheter	Covidien	8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope	Nikon	E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm	BIO-RAD	1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative	Miralax	C8175	Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers	QIAGEN	74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System	ThermoFisher Scientific	18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe	ThermoFisher Scientific	4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe	ThermoFisher Scientific	4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher Scientific	4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1	Sakura	6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer	Sakura	6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution)	SIGMA-ALDRICH	92822