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O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de colite semelhante a Crohn em roedores. A inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS, e o alargamento mecânico é observado no segmento proximal à estenose. Essas mudanças permitem estudar o estresse mecânico na colite.
Doenças inflamatórias intestinais (DII) como a doença de Crohn (CD) são doenças inflamatórias crônicas do trato gastrointestinal que afetam aproximadamente 20 por 1.00.000 na Europa e nos EUA. O CD é caracterizado por inflamação transmural, fibrose intestinal e estenose luminal. Embora terapias anti-inflamatórias possam ajudar a controlar a inflamação, elas não têm eficácia na fibrose e estenose em CD. A patogênese do CD não é bem compreendida. Os estudos atuais se concentram principalmente na delineação de mecanismos de resposta imune intestinal desregulados. Embora a inflamação transmural associada ao CD, a fibrose intestinal e a estenose luminal representem estresse mecânico na parede intestinal, o papel do estresse mecânico no CD não é bem definido. Para determinar se o estresse mecânico desempenha um papel patogênico independente no CD, um protocolo do modelo de colite induzida por TNBS em roedores foi desenvolvido. Este modelo de inflamação transmural e fibrose induzido pelo TNBS se assemelha a marcas patológicas do CD no cólon. É induzida pela instilação intracolônica de TNBS no cólon distal de ratos adultos Sprague-Dawley. Neste modelo, a inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS (Site I). A distensão mecânica é observada na porção proximal ao local de instilação (Local P), representando estresse mecânico, mas não inflamação visível. A porção córica distal à inflamação (Local D) não apresenta inflamação nem estresse mecânico. Foram observadas alterações distintas da expressão genética, resposta imune, fibrose e crescimento muscular suave em diferentes locais (P, I e D), destacando um profundo impacto do estresse mecânico. Portanto, este modelo de colite semelhante a CD nos ajudará a entender melhor os mecanismos patogênicos do CD, particularmente o papel do estresse mecânico e da expressão genética induzida pelo estresse mecânico na desregulação imunológica, fibrose intestinal e remodelação tecidual em CD.
A doença inflamatória intestinal (DII), incluindo colite ulcerativa (UC) e doença de Crohn (CD), é caracterizada por inflamação crônica no trato gastrointestinal (GI). Afeta ~1-2 milhões de americanos1. Os custos anuais estimados para os cuidados com o IBD nos EUA são de US$ 11,8 bilhões. Ao contrário da UC, o CD é caracterizado pela inflamação transmural e formação de rigidridade 2,3. A formação rigorosa (estenose) ocorre em até 70% dos pacientes com CD3 e pode ser causada por inflamação transmural (estenose inflamatória) ou fibrose intestinal (estenose fibrosa)....
Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o comitê institucional de cuidados e uso de animais da University of Texas Medical Branch (#0907051C). Ratos de Sprague-Dawley masculinos ou femininos, com ~8-9 semanas de idade, foram usados para o estudo.
1. Preparação animal
Visão macroscópica da colite semelhante a Crohn induzida pela instilação intra-cólon do TNBS
Como mostrado na Figura 1, a instilação intracolônica de TNBS em ratos induziu uma inflamação transmural localizada (~2 cm de comprimento) com parede intestinal espessa e lúmen estreito (estenose) no local da instilação no cólon distal (Figura 1A). O site da instilação TNBS é referido como site I. Como resultado de inflamação transm.......
A colite induzida pelo TNBS foi introduzida em 1989 e tem sido usada como modelo experimental da doença de Crohn desde então 19,20,23. Características significativas deste modelo em roedores incluem o desenvolvimento de uma inflamação transmural que se assemelha muito às lesões histopatológicas desenvolvidas na doença humana de Crohn19,20. Estudos anteriores sob.......
Os autores não relatam conflito de interesses e não têm nada a revelar.
Este trabalho é apoiado em parte por subvenções do NIH (R01 DK124611 para XZS) e do Departamento de Defesa dos EUA (W81XWH-20-1-0681 para XZS). O trabalho de histologia foi feito com a ajuda do Laboratório de Patologia Cirúrgica da UTMB.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers | QIAGEN | 74106 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
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