É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de colite semelhante a Crohn em roedores. A inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS, e o alargamento mecânico é observado no segmento proximal à estenose. Essas mudanças permitem estudar o estresse mecânico na colite.

Resumo

Doenças inflamatórias intestinais (DII) como a doença de Crohn (CD) são doenças inflamatórias crônicas do trato gastrointestinal que afetam aproximadamente 20 por 1.00.000 na Europa e nos EUA. O CD é caracterizado por inflamação transmural, fibrose intestinal e estenose luminal. Embora terapias anti-inflamatórias possam ajudar a controlar a inflamação, elas não têm eficácia na fibrose e estenose em CD. A patogênese do CD não é bem compreendida. Os estudos atuais se concentram principalmente na delineação de mecanismos de resposta imune intestinal desregulados. Embora a inflamação transmural associada ao CD, a fibrose intestinal e a estenose luminal representem estresse mecânico na parede intestinal, o papel do estresse mecânico no CD não é bem definido. Para determinar se o estresse mecânico desempenha um papel patogênico independente no CD, um protocolo do modelo de colite induzida por TNBS em roedores foi desenvolvido. Este modelo de inflamação transmural e fibrose induzido pelo TNBS se assemelha a marcas patológicas do CD no cólon. É induzida pela instilação intracolônica de TNBS no cólon distal de ratos adultos Sprague-Dawley. Neste modelo, a inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS (Site I). A distensão mecânica é observada na porção proximal ao local de instilação (Local P), representando estresse mecânico, mas não inflamação visível. A porção córica distal à inflamação (Local D) não apresenta inflamação nem estresse mecânico. Foram observadas alterações distintas da expressão genética, resposta imune, fibrose e crescimento muscular suave em diferentes locais (P, I e D), destacando um profundo impacto do estresse mecânico. Portanto, este modelo de colite semelhante a CD nos ajudará a entender melhor os mecanismos patogênicos do CD, particularmente o papel do estresse mecânico e da expressão genética induzida pelo estresse mecânico na desregulação imunológica, fibrose intestinal e remodelação tecidual em CD.

Introdução

A doença inflamatória intestinal (DII), incluindo colite ulcerativa (UC) e doença de Crohn (CD), é caracterizada por inflamação crônica no trato gastrointestinal (GI). Afeta ~1-2 milhões de americanos1. Os custos anuais estimados para os cuidados com o IBD nos EUA são de US$ 11,8 bilhões. Ao contrário da UC, o CD é caracterizado pela inflamação transmural e formação de rigidridade 2,3. A formação rigorosa (estenose) ocorre em até 70% dos pacientes com CD3 e pode ser causada por inflamação transmural (estenose inflamatória) ou fibrose intestinal (estenose fibrosa)....

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o comitê institucional de cuidados e uso de animais da University of Texas Medical Branch (#0907051C). Ratos de Sprague-Dawley masculinos ou femininos, com ~8-9 semanas de idade, foram usados para o estudo.

1. Preparação animal

  1. Ratos rápidos por 24 horas e tratá-los com laxante (limpador de intestino, ver Tabela de Materiais) durante a noite.
  2. No dia seguinte, anestesiam ratos usando um sistema de anestesia (ver Tabela de Materiais) expondo-os a 2% de isoflurane, juntamente com 1 L/min de oxigênio durante a a....

Resultados

Visão macroscópica da colite semelhante a Crohn induzida pela instilação intra-cólon do TNBS
Como mostrado na Figura 1, a instilação intracolônica de TNBS em ratos induziu uma inflamação transmural localizada (~2 cm de comprimento) com parede intestinal espessa e lúmen estreito (estenose) no local da instilação no cólon distal (Figura 1A). O site da instilação TNBS é referido como site I. Como resultado de inflamação transm.......

Discussão

A colite induzida pelo TNBS foi introduzida em 1989 e tem sido usada como modelo experimental da doença de Crohn desde então 19,20,23. Características significativas deste modelo em roedores incluem o desenvolvimento de uma inflamação transmural que se assemelha muito às lesões histopatológicas desenvolvidas na doença humana de Crohn19,20. Estudos anteriores sob.......

Divulgações

Os autores não relatam conflito de interesses e não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado em parte por subvenções do NIH (R01 DK124611 para XZS) e do Departamento de Defesa dos EUA (W81XWH-20-1-0681 para XZS). O trabalho de histologia foi feito com a ajuda do Laboratório de Patologia Cirúrgica da UTMB.

....

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
ACT-1 Control Software Ver2.63NikonDXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction ModuleBIO-RAD1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR SystemsBIO-RAD1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainerDakoAR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173DakoAR173
DXM1200 Digital Color HR CameraNikonDXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous ControlThermoFisher Scientific4352930E
E-Z AnesthesiaE-Z Systems Inc.EZ-155
GraphPad Prism 9GraphPad9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clearBIO-RADHSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium)CORNING21-021-CV
HM 325 MicrotomeThermo Scientific23-900-667
IsofluranePiramalNDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging SystemLI-COR9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal CyclerEppendorf5341
Medical grade open end polyurethane catheterCovidien8890703013
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometersThermo Fisher ScientificND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright MicroscopeNikonE800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cmBIO-RAD1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic LaxativeMiralaxC8175Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers
QIAGEN74106
SuperScript III First-Strand Synthesis SystemThermoFisher Scientific18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF ProbeThermoFisher Scientific4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 ProbeThermoFisher Scientific4331182
TaqMan Fast Advanced Master MixThermoFisher Scientific4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1Sakura6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide StainerSakura6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution)SIGMA-ALDRICH92822

Referências

  1. Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
  2. Hwang, J. M., Varma, M. G.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Imunologia e Infec oQuest o 181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Pesquisa

Educação

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados