Um modelo de roedor induzido pela TNBS para estudar o papel patogênico do estresse mecânico na doença de Crohn

Resumo

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de colite semelhante a Crohn em roedores. A inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS, e o alargamento mecânico é observado no segmento proximal à estenose. Essas mudanças permitem estudar o estresse mecânico na colite.

Resumo

Doenças inflamatórias intestinais (DII) como a doença de Crohn (CD) são doenças inflamatórias crônicas do trato gastrointestinal que afetam aproximadamente 20 por 1.00.000 na Europa e nos EUA. O CD é caracterizado por inflamação transmural, fibrose intestinal e estenose luminal. Embora terapias anti-inflamatórias possam ajudar a controlar a inflamação, elas não têm eficácia na fibrose e estenose em CD. A patogênese do CD não é bem compreendida. Os estudos atuais se concentram principalmente na delineação de mecanismos de resposta imune intestinal desregulados. Embora a inflamação transmural associada ao CD, a fibrose intestinal e a estenose luminal representem estresse mecânico na parede intestinal, o papel do estresse mecânico no CD não é bem definido. Para determinar se o estresse mecânico desempenha um papel patogênico independente no CD, um protocolo do modelo de colite induzida por TNBS em roedores foi desenvolvido. Este modelo de inflamação transmural e fibrose induzido pelo TNBS se assemelha a marcas patológicas do CD no cólon. É induzida pela instilação intracolônica de TNBS no cólon distal de ratos adultos Sprague-Dawley. Neste modelo, a inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS (Site I). A distensão mecânica é observada na porção proximal ao local de instilação (Local P), representando estresse mecânico, mas não inflamação visível. A porção córica distal à inflamação (Local D) não apresenta inflamação nem estresse mecânico. Foram observadas alterações distintas da expressão genética, resposta imune, fibrose e crescimento muscular suave em diferentes locais (P, I e D), destacando um profundo impacto do estresse mecânico. Portanto, este modelo de colite semelhante a CD nos ajudará a entender melhor os mecanismos patogênicos do CD, particularmente o papel do estresse mecânico e da expressão genética induzida pelo estresse mecânico na desregulação imunológica, fibrose intestinal e remodelação tecidual em CD.

Introdução

A doença inflamatória intestinal (DII), incluindo colite ulcerativa (UC) e doença de Crohn (CD), é caracterizada por inflamação crônica no trato gastrointestinal (GI). Afeta ~1-2 milhões de americanos¹. Os custos anuais estimados para os cuidados com o IBD nos EUA são de US$ 11,8 bilhões. Ao contrário da UC, o CD é caracterizado pela inflamação transmural e formação de rigidridade ^2,3. A formação rigorosa (estenose) ocorre em até 70% dos pacientes com CD³ e pode ser causada por inflamação transmural (estenose inflamatória) ou fibrose intestinal (estenose fibrosa)^4,5. A fibrose intestinal é caracterizada pela deposição excessiva de colágeno e outras matrizes extracelulares (ECM) com células musculares lisas (SMC) como um dos principais tipos de células mesenquimais envolvidas no processo ^3,4. A hiperplasia muscular lisa associada à hipertrofia é outra mudança histológica significativa na estenose fibrosa no CD⁶. Embora a formação de rigor em CD esteja associada à inflamação crônica, nenhum tratamento anti-inflamatório é eficaz, exceto o tratamento cirúrgico ^2,6. No entanto, as recidivas pós-cirurgia são quase 100%, dado tempo suficiente ^2,7. Como resposta inflamatória, a fibrose e a hiperplasia SMC também podem desenvolver-se em condições não inflamatórias (ou seja, obstrução intestinal) no intestino ^8,9; acredita-se que tanto mecanismos dependentes da inflamação quanto independentes estejam envolvidos na formação rigorosa ^3,4. Dado que uma extensa pesquisa sobre os mecanismos dependentes da inflamação não se traduziu em nenhuma terapia eficaz para a formação de estritos, são necessários estudos sobre o possível papel de mecanismos independentes da inflamação na fibrose intestinal.

Como fator não inflamatório, o estresse mecânico (EM) associado ao edema, infiltração de células inflamatórias, deformação tecidual, fibrose e estenose 10,11,12,13 é comumente encontrado no DIB, especialmente o CD, que é caracterizado por inflamação transmural. O estresse mecânico é mais notável no CD estenético, onde a estenose (inflamatória ou fibrosa) no local da inflamação apresenta estresse mecânico no tecido local e leva à distensão do lúmen no segmento proximal ao local da obstrução^10,14. Estudos in vitro anteriores demonstraram que o estresse mecânico altera a expressão genética de mediadores inflamatórios específicos (ou seja, COX-2, IL-6)^8,14,15 e fatores de crescimento (ou seja, TGF-β) nos tecidos gastrointestinais, especialmente células musculares lisas do intestino (SMC)¹⁶. Estudos recentes também descobriram que a expressão de mediadores pró-fibrosos específicos, como o fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) é altamente sensível ao estresse mecânico^17,18. Foi a hipótese de que o estresse mecânico poderia desempenhar um papel patogênico independente na inflamação associada ao CD, fibrose e remodelagem tecidual. No entanto, a significância patogênica do estresse mecânico na inflamação intestinal, fibrose e hiperplasia muscular lisa em CD permanece em grande parte inexplorada. Isso pode ser em parte porque a inflamação é um processo mais visível e melhor estudado do que o estresse mecânico. Mais importante, não houve nenhum modelo animal bem definido de IBD para distinguir o efeito do estresse mecânico do da inflamação.

O trabalho atual descreve um modelo de roedor da colite semelhante a Crohn induzida pela injeção intracolônica de reagente hapten 2,4,6-6-trinitrobenzeno ácido sulfônico (TNBS)^19,20, que pode servir para estudar o papel do estresse mecânico em CD. Verificou-se que a instilação TNBS induziu uma inflamação transmural localizada (~2 cm de comprimento) com estreitamento de lúmen (estenose) no cólon distal. A estenose leva à distensão intestinal marcada (estresse mecânico)^14,15, mas não inflamação visível no segmento cólon proximal ao local de instilação. Pelo contrário, o segmento de cólon distal ao local da estenose não apresenta inflamação nem estresse mecânico. Foram observadas alterações significativas na expressão genética, inflamação, fibrose e hiperplasia SMC nos três locais diferentes. Os resultados sugerem que o estresse mecânico, particularmente a expressão genética induzida pelo estresse mecânico, pode desempenhar um papel crítico no desenvolvimento de fibrose e hiperplasia na colite de Crohn.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o comitê institucional de cuidados e uso de animais da University of Texas Medical Branch (#0907051C). Ratos de Sprague-Dawley masculinos ou femininos, com ~8-9 semanas de idade, foram usados para o estudo.

1. Preparação animal

1. Ratos rápidos por 24 horas e tratá-los com laxante (limpador de intestino, ver Tabela de Materiais) durante a noite.
2. No dia seguinte, anestesiam ratos usando um sistema de anestesia (ver Tabela de Materiais) expondo-os a 2% de isoflurane, juntamente com 1 L/min de oxigênio durante a administração da TNBS. Verifique se há reflexos ou dedo dos dedo do tom para confirmar a anestesia.
3. Prepare a solução TNBS fresca de acordo com os pesos corporais.
   NOTA: TNBS - 65 mg/kg de peso corporal em 250 μL de 40% de etanol foi utilizado.
4. Coloque ratos em uma posição supina na mesa de anestesia. Para induzir colite, insira através do ânus um cateter de poliuretano de nível médico aberto por ~7-8 cm da beira anal e instile suavemente o TNBS (preparado na etapa 1.3) no cólon¹⁹. Administrar os ratos de controle falso com 250 μL apenas de soro fisiológico.
5. Depois de incutir TNBS ou soro fisiológico, mantenha os ratos na posição supina e ligeiramente para baixo (~30°), com o ânus fechado por 2 minutos para ajudar a distribuição TNBS e evitar derramamentos.
6. Forneça aos ratos alimentos e água ad libitum por 7 dias e observe os ratos diariamente para o peso corporal, absorção de alimentos, fezes e condição geral de saúde.

2. Preparações teciduais

1. No dia da eutanásia, eutanásia os ratos usando inalação de CO₂ e confirmar eutanásia com deslocamento cervical.
2. Abra o abdômen de rato usando tesouras de grau cirúrgico e fórceps.
3. Remova cuidadosamente todo o cólon (acima do canal anal) e transfira o cólon imediatamente para o tampão HBSS 1x gelado.
4. Endireitar o cólon no tampão e medir o comprimento do cólon usando uma régua. Pegue a linha de nylon e circule ao redor do cólon para medir a circunferência externa dos segmentos de cólon em controle e ratos tratados com TNBS. Tome tecidos de espessura total para histologia.
5. Abra o cólon ao longo da placa mesentérica e limpe bem o cólon com tampão HBSS. Avalie o cólon para escore de inflamação macroscópica com base nos critérios descritos anteriormente¹⁹ com modificações mínimas.
   NOTA: 0 = mucosa normal; 1 = hiperemia localizada, mas sem erosões ou úlceras; 2 = úlcera e estenose (área afetada < 5 mm); 3 = úlcera grave, cicatriz e estenose (área afetada > 5 mm).
6. Coletar amostras de tecido cólon do local P (porção de 2-3 cm antes da margem oral do local da inflamação), local I (local de inflamação, tipicamente 4-6 cm da extremidade do cólon, onde o TNBS é incutido) e local D (porção 1-2 cm distal à margem aboral do local de inflamação), respectivamente de ratos tratados com TNBS.
   NOTA: Tecido de cólon de ~1-2 cm de comprimento foi retirado de cada segmento. Além disso, os tecidos de cólon de 2 cm de comprimento (~4-6 cm da extremidade do cólon) dos ratos tratados com soro fisiológico foram tomados como controle falso (S) (Figura 1).
7. Pegue amostras de tecido de cada local para preparação de espessura total e, se desejar, as camadas mucosa/submucosa e muscularis externas, respectivamente, bem como ^21,22.
8. Congele primeiro amostras de tecido em nitrogênio líquido antes de armazená-las a -80 °C para armazenamento até um ano e para fins futuros (ou seja, preparações de RNA).

3. Avaliação histopatológica da inflamação intestinal e fibrose

1. Fixar os tecidos de cólon de espessura total em 10% de formalina por 48 h, depois transferir para 70% de etanol por 24-48 h.
2. Use um microtome para cortar seções de parafina de 5 μm de espessura para Hemaoxilina e eosina (H&E) e as manchas tricromáticas de Masson ^6,19,23 (ver Tabela de Materiais), respectivamente.
3. Adquira e visualize imagens com um microscópio vertical equipado com uma câmera de alta resolução com software compatível (ver Tabela de Materiais).
4. Índices de inflamação e fibrose de grau por dois pesquisadores independentes, incluindo um patologista cirúrgico gastrointestinal de acordo com critérios descritos anteriormente ^6,23 com modificações. Consulte o Arquivo Complementar 1 para obter as pontuações.
5. Meça a espessura e os números celulares das camadas musculares circulares e longitudinais por seção transversal em quatro pontos de vista de cada espécime manchado de H&E e tome a média das quatro medidas para cada espécime.

4. Extração de RNA e RT-PCR quantitativo

1. Homogeneize tecidos de cólon excisados obtidos do controle de sham e três locais (P, I, D) de ratos de colite TNBS no reagente de extração de um kit de extração de RNA (ver Tabela de Materiais).
2. Isole o RNA de cada amostra utilizando o kit. Elute a pelota RNA em 30 μL de água sem RNase.
3. Quantifique a concentração de RNA e verifique se há pureza usando um especttômetro UV-Vis microvolume (ver Tabela de Materiais).
4. Use 1 μg de RNA total para sintetizar cDNA^21,22 utilizando o kit de síntese de RNA (ver Tabela de Materiais).
5. Analise e quantifique os níveis de expressão genética realizando PCR em tempo real com 50 ng de cDNA como modelo, testes de IL-6 e CTGF usando um kit PCR comercial para sistema PCR em tempo real (ver Tabela de Materiais).
6. Use o gene de controle 18S rRNA para normalizar as amostras e quantificar a expressão genética relativa utilizando os valores do Cq obtidos.

5. Análise estatística

1. Utilize software de análise estatística (ver Tabela de Materiais) para comparar o controle de sham e os ratos de colite TNBS.
2. Considere p valor < 0,05 para ser estatisticamente significativo^15,19.
3. Para testar as diferenças entre dois grupos, use a análise t-test do Student e realize um teste ANOVA se as comparações forem superiores a dois grupos^15,19.

Resultados

Visão macroscópica da colite semelhante a Crohn induzida pela instilação intra-cólon do TNBS
Como mostrado na Figura 1, a instilação intracolônica de TNBS em ratos induziu uma inflamação transmural localizada (~2 cm de comprimento) com parede intestinal espessa e lúmen estreito (estenose) no local da instilação no cólon distal (Figura 1A). O site da instilação TNBS é referido como site I. Como resultado de inflamação transm...

Discussão

A colite induzida pelo TNBS foi introduzida em 1989 e tem sido usada como modelo experimental da doença de Crohn desde então 19,20,23. Características significativas deste modelo em roedores incluem o desenvolvimento de uma inflamação transmural que se assemelha muito às lesões histopatológicas desenvolvidas na doença humana de Crohn^19,20. Estudos anteriores sob...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63	Nikon	DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BIO-RAD	1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems	BIO-RAD	1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer	Dako	AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173	Dako	AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera	Nikon	DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control	ThermoFisher Scientific	4352930E
E-Z Anesthesia	E-Z Systems Inc.	EZ-155
GraphPad Prism 9	GraphPad	9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear	BIO-RAD	HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium)	CORNING	21-021-CV
HM 325 Microtome	Thermo Scientific	23-900-667
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System	LI-COR	9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler	Eppendorf	5341
Medical grade open end polyurethane catheter	Covidien	8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope	Nikon	E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm	BIO-RAD	1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative	Miralax	C8175	Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers	QIAGEN	74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System	ThermoFisher Scientific	18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe	ThermoFisher Scientific	4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe	ThermoFisher Scientific	4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher Scientific	4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1	Sakura	6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer	Sakura	6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution)	SIGMA-ALDRICH	92822