Um modelo de roedor induzido pela TNBS para estudar o papel patogênico do estresse mecânico na doença de Crohn

Resumo

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de colite semelhante a Crohn em roedores. A inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS, e o alargamento mecânico é observado no segmento proximal à estenose. Essas mudanças permitem estudar o estresse mecânico na colite.

Resumo

Doenças inflamatórias intestinais (DII) como a doença de Crohn (CD) são doenças inflamatórias crônicas do trato gastrointestinal que afetam aproximadamente 20 por 1.00.000 na Europa e nos EUA. O CD é caracterizado por inflamação transmural, fibrose intestinal e estenose luminal. Embora terapias anti-inflamatórias possam ajudar a controlar a inflamação, elas não têm eficácia na fibrose e estenose em CD. A patogênese do CD não é bem compreendida. Os estudos atuais se concentram principalmente na delineação de mecanismos de resposta imune intestinal desregulados. Embora a inflamação transmural associada ao CD, a fibrose intestinal e a estenose luminal representem estresse mecânico na parede intestinal, o papel do estresse mecânico no CD não é bem definido. Para determinar se o estresse mecânico desempenha um papel patogênico independente no CD, um protocolo do modelo de colite induzida por TNBS em roedores foi desenvolvido. Este modelo de inflamação transmural e fibrose induzido pelo TNBS se assemelha a marcas patológicas do CD no cólon. É induzida pela instilação intracolônica de TNBS no cólon distal de ratos adultos Sprague-Dawley. Neste modelo, a inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS (Site I). A distensão mecânica é observada na porção proximal ao local de instilação (Local P), representando estresse mecânico, mas não inflamação visível. A porção córica distal à inflamação (Local D) não apresenta inflamação nem estresse mecânico. Foram observadas alterações distintas da expressão genética, resposta imune, fibrose e crescimento muscular suave em diferentes locais (P, I e D), destacando um profundo impacto do estresse mecânico. Portanto, este modelo de colite semelhante a CD nos ajudará a entender melhor os mecanismos patogênicos do CD, particularmente o papel do estresse mecânico e da expressão genética induzida pelo estresse mecânico na desregulação imunológica, fibrose intestinal e remodelação tecidual em CD.

Introdução

A doença inflamatória intestinal (DII), incluindo colite ulcerativa (UC) e doença de Crohn (CD), é caracterizada por inflamação crônica no trato gastrointestinal (GI). Afeta ~1-2 milhões de americanos¹. Os custos anuais estimados para os cuidados com o IBD nos EUA são de US$ 11,8 bilhões. Ao contrário da UC, o CD é caracterizado pela inflamação transmural e formação de rigidridade ^2,3. A formação rigorosa (estenose) ocorre em até 70% dos pacientes com CD³ e pode ser causada por inflamação transmural (estenose inflamatória) ou fibrose intestinal (estenose fibrosa)....

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o comitê institucional de cuidados e uso de animais da University of Texas Medical Branch (#0907051C). Ratos de Sprague-Dawley masculinos ou femininos, com ~8-9 semanas de idade, foram usados para o estudo.

1. Preparação animal

1. Ratos rápidos por 24 horas e tratá-los com laxante (limpador de intestino, ver Tabela de Materiais) durante a noite.
2. No dia seguinte, anestesiam ratos usando um sistema de anestesia (ver Tabela de Materiais) expondo-os a 2% de isoflurane, juntamente com 1 L/min de oxigênio durante a a....

Resultados

Visão macroscópica da colite semelhante a Crohn induzida pela instilação intra-cólon do TNBS
Como mostrado na Figura 1, a instilação intracolônica de TNBS em ratos induziu uma inflamação transmural localizada (~2 cm de comprimento) com parede intestinal espessa e lúmen estreito (estenose) no local da instilação no cólon distal (Figura 1A). O site da instilação TNBS é referido como site I. Como resultado de inflamação transm.......

Discussão

A colite induzida pelo TNBS foi introduzida em 1989 e tem sido usada como modelo experimental da doença de Crohn desde então 19,20,23. Características significativas deste modelo em roedores incluem o desenvolvimento de uma inflamação transmural que se assemelha muito às lesões histopatológicas desenvolvidas na doença humana de Crohn^19,20. Estudos anteriores sob.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63	Nikon	DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BIO-RAD	1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems	BIO-RAD	1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer	Dako	AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173	Dako	AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera	Nikon	DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control	ThermoFisher Scientific	4352930E
E-Z Anesthesia	E-Z Systems Inc.	EZ-155
GraphPad Prism 9	GraphPad	9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear	BIO-RAD	HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium)	CORNING	21-021-CV
HM 325 Microtome	Thermo Scientific	23-900-667
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System	LI-COR	9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler	Eppendorf	5341
Medical grade open end polyurethane catheter	Covidien	8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope	Nikon	E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm	BIO-RAD	1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative	Miralax	C8175	Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers	QIAGEN	74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System	ThermoFisher Scientific	18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe	ThermoFisher Scientific	4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe	ThermoFisher Scientific	4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher Scientific	4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1	Sakura	6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer	Sakura	6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution)	SIGMA-ALDRICH	92822