크론병에서 기계적 스트레스의 병원성 역할을 연구하는 TNBS 유도 설치류 모델

요약

본 프로토콜은 설치류에서 크론과 같은 대장염 모델의 개발을 설명합니다. 경막 염증은 TNBS 점안 부위에서 협착으로 이어지고, 협착증에 근접한 세그먼트에서 기계적 확대가 관찰됩니다. 이러한 변화는 대장염의 기계적 스트레스를 연구 할 수있게합니다.

초록

크론병(CD)과 같은 염증성 장 질환(IBD)은 유럽과 미국에서 1,00,000명당 약 20명에 영향을 미치는 위장관의 만성 염증성 질환이다. CD는 경막 염증, 장 섬유증 및 발광 협착증을 특징으로합니다. 항염증 요법은 염증을 조절하는 데 도움이 될 수 있지만 CD의 섬유증과 협착증에는 효능이 없습니다. CD의 병인은 잘 이해되지 않는다. 현재의 연구는 주로 조절되지 않는 장 면역 반응 메커니즘을 묘사하는 데 중점을 둡니다. CD 관련 경막 염증, 장 섬유증 및 발광 협착증은 모두 장 벽에 대한 기계적 스트레스를 나타내는 반면, CD에서 기계적 스트레스의 역할은 잘 정의되어 있지 않습니다. 기계적 스트레스가 CD에서 독립적 인 병원성 역할을하는지 여부를 결정하기 위해 설치류에서 TNBS 유도 CD 유사 대장염 모델의 프로토콜이 개발되었습니다. 이러한 TNBS-유도된 경막 염증 및 섬유증 모델은 결장에서의 CD의 병리학적 특징과 유사하다. 그것은 성인 Sprague-Dawley 래트의 원위 결장으로의 TNBS의 결장 내 점적에 의해 유도된다. 이 모델에서, 경막 염증은 TNBS 점안 부위 (부위 I)에서 협착을 일으킨다. 기계적 팽만감은 점적 부위(Site P)에 근접한 부분에서 관찰되며, 기계적 응력을 나타내지만 눈에 보이는 염증은 나타낸다. 염증에 원위 결장 부분 (사이트 D)은 염증이나 기계적 스트레스를 나타내지 않습니다. 다른 부위 (P, I 및 D)에서 유전자 발현, 면역 반응, 섬유증 및 평활근 성장의 독특한 변화가 관찰되어 기계적 스트레스의 중대한 영향을 강조했습니다. 따라서이 CD 유사 대장염 모델은 CD의 병원성 메커니즘, 특히 면역 조절 장애, 장 섬유증 및 CD의 조직 리모델링에서 기계적 스트레스 및 기계적 스트레스 유발 유전자 발현의 역할을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

서문

궤양성 대장염(UC) 및 크론병(CD)을 포함하는 염증성 장 질환(IBD)은 위장관(GI) 관에서 만성 염증을 특징으로 한다. 그것은 ~ 1-2 백만 명의 미국인에게 영향을 미칩니다¹. 미국의 IBD 치료에 대한 예상 연간 비용은 $ 11.8 억입니다. UC와는 달리, CD는 경막 염증 및 협착 형성 ^2,3을 특징으로 한다. 협착 형성(stenosis)은 CD 환자3의 최대 70%에서 발생하며, 경막 염증(염증성 협착) 또는 장 섬유증(fibrotic stenosis)^4,5에 의해 유발될 수 있다. 장 섬유증은 공정 ^3,4에 관여하는 주요 중간엽 세포 유형 중 하나로서 평활근 세포 (SMC)와 함께 과도한 콜라겐 침착 및 기타 세포외 매트릭스 (ECM)를 특징으로합니다. 비대와 관련된 평활근 과형성은^CD6에서 섬유성 협착증의 또 다른 중요한 조직학적 변화이다. CD의 협착 형성은 만성 염증과 관련이 있지만, 외과 적 치료 ^2,6을 제외하고는 항 염증 치료가 효과적이지 않습니다. 그러나 수술 후 재발은 충분한 시간 ^2,7을 감안할 때 거의 100 %입니다. 염증 반응으로서, 섬유증 및 SMC 증식은 또한 장^8,9에서 비염증성 상태 (즉^, 장 폐쇄)에서 발생할 수 있다; 염증-의존적 및 독립적인 메카니즘 둘 모두가 협착 형성에 관여하는 것으로 여겨진다 ^3,4. 염증 의존성 메커니즘에 대한 광범위한 연구가 협착 형성을위한 효과적인 치료법으로 번역되지 않았 음을 감안할 때, 장 섬유증에서 염증 독립적 인 메커니즘의 가능한 역할에 대한 연구가 필요합니다.

비염증성 인자로서, 부종, 염증성 세포 침윤, 조직 변형, 섬유증, 및 협착증과 관련된 기계적 스트레스 (MS)^10,11,12,13은 IBD^, 특히 경막 염증을 특징으로 하는 CD에서 흔히 마주친다. 기계적 스트레스는 협착 CD에서 가장 현저하며, 염증 부위의 협착 (염증 또는 섬유성)은 국소 조직에 기계적 스트레스를 제공하고 폐색 부위^10,14에 근접한 세그먼트에서 내강 팽창을 유도합니다. 이전의 시험관내 연구는 기계적 스트레스가 위장 조직, 특히 장 평활근 세포 (SMC)16에서 특정 염증 매개체 (즉, COX-2, IL-6)^8,14,15 및 성장 인자 (즉, TGF-β)의 유전자 발현을 변화시킨다는 것을 입증했다. 최근의 연구는 또한 결합 조직 성장 인자 (CTGF)와 같은 특정 친 섬유성 매개체의 발현이 기계적 스트레스에 매우 민감하다는 것을 발견했다^17,18. 기계적 스트레스가 CD 관련 염증, 섬유증 및 조직 리모델링에서 독립적 인 병원성 역할을 할 수 있다는 가설이 제기되었습니다. 그러나 CD에서 장 염증, 섬유증 및 평활근 증식증에서 기계적 스트레스의 병원성 중요성은 크게 탐구되지 않은 채로 남아 있습니다. 이것은 부분적으로 염증이 기계적 스트레스보다 더 눈에 띄고 더 잘 연구 된 과정이기 때문일 수 있습니다. 더 중요한 것은, 기계적 스트레스의 효과와 염증의 효과를 구별하기 위해 IBD의 잘 정의 된 동물 모델이 없다는 것입니다.

현재의 연구는 CD에서 기계적 스트레스의 역할을 연구하는 목적을 달성 할 수있는 합텐 시약 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산 (TNBS) ^19,20의 결장 내 주사에 의해 유도 된 크론과 같은 대장염의 설치류 모델을 설명합니다. TNBS 점안이 원위 결장에서의 내강 협착(stenosis)과 함께 국소적인(~2 cm 길이) 경막 염증을 유도한다는 것이 밝혀졌다. 협착증은 현저한 장 팽만감 (기계적 스트레스)^14,15로 이어지지만 점안 부위에 인접한 결장 세그먼트에서는 눈에 보이지 않는 염증을 일으킨다. 반대로, 협착 부위의 원위 결장 세그먼트는 염증이나 기계적 스트레스를 나타내지 않습니다. 유전자 발현, 염증, 섬유증, 및 SMC 과형성의 유의한 부위-특이적 변화가 세 개의 상이한 부위에서 관찰되었다. 결과는 기계적 스트레스, 특히 기계적 스트레스로 인한 유전자 발현이 크론 대장염에서 섬유증과 과형성을 일으키는 데 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 텍사스 대학 의료 지부 (#0907051C)의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행되었습니다. ∼8-9주령의 수컷 또는 암컷 Sprague-Dawley 래트를 연구에 사용하였다.

1. 동물 준비

1. 24 시간 동안 빠른 쥐를 하룻밤 동안 완하제 (장 클렌저, 재료 표 참조)로 치료하십시오.
2. 다음날, 마취 시스템을 사용하여 쥐를 마취 ( 재료 표 참조)하여 TNBS 투여 동안 1 L / min의 산소와 함께 2 % 이소 플루란에 노출시킵니다. 마취를 확인하기 위해 반사 신경이나 발가락을 꼬집는 것을 확인하십시오.
3. 체중에 따라 신선한 TNBS 용액을 준비하십시오.
   참고: TNBS - 40% 에탄올 250μL에 체중 65mg/kg이 사용되었다.
4. 쥐를 마취 테이블의 수핀 위치에 두십시오. 대장염을 유도하기 위해, 항문 가장자리로부터 ∼7-8 cm의 의료용 개방형 폴리우레탄 카테터를 항문을 통해 삽입하고 TNBS(단계 1.3에서 제조)를 결장¹⁹에 부드럽게 주입한다. 가짜 대조군 래트를 250 μL의 식염수로만 투여한다.
5. TNBS 또는 식염수를 주입 한 후 쥐를 수핀과 약간 머리 아래로 위치 (~ 30 °)에 보관하고 항문을 2 분 동안 닫아 TNBS 분포를 돕고 유출을 피하십시오.
6. 쥐에게 7 일 동안 음식과 물 광고 리비툼을 제공하고 체중, 음식 섭취량, 대변 및 일반적인 건강 상태에 대해 매일 쥐를 관찰하십시오.

2. 조직 준비

1. 안락사 당일,_CO2 흡입을 사용하여 쥐를 안락사시키고 자궁 경부 탈구로 안락사를 확인하십시오.
2. 외과 용 가위와 집게를 사용하여 쥐 복부를 엽니 다.
3. 조심스럽게 전체 결장 (항문 운하 위)을 제거하고 즉시 결장을 얼음처럼 차가운 1x HBSS 버퍼로 옮깁니다.
4. 버퍼에서 콜론을 곧게 펴고 눈금자를 사용하여 콜론 길이를 측정합니다. 나일론 실을 취하여 결장 주위를 돌면서 대조군 및 TNBS 처리된 래트에서 결장 세그먼트의 외부 둘레를 측정하였다. 조직학을 위해 전체 두께 조직을 가져 가라.
5. 장간막 보드를 따라 결장을 열고 HBSS 버퍼로 결장을 잘 청소하십시오. 최소 변형으로 앞서 기술된 바와 같은 기준에 기초하여 거시적 염증 점수에 대한 결장을 평가한다¹⁹ .
   참고: 0 = 정상 점막; 1 = 국소 충혈이지만 침식이나 궤양 없음; 2 = 궤양 및 협착증 (환부 < 5 mm); 3 = 심한 궤양, 흉터 및 협착 (환부 > 5 mm).
6. TNBS 처리된 래트로부터 각각 부위 P(염증 부위의 구강 여백 전 2-3 cm 전), 부위 I(염증 부위, 전형적으로 TNBS가 주입되는 결장의 끝으로부터 4-6 cm), 및 부위 D(염증 부위의 복부 여백에 원위 부분 1-2 cm)로부터 결장 조직 샘플을 수집한다.
   주: ∼1-2 cm-길이의 결장 조직은 각 세그먼트로부터 취하였다. 또한, 식염수 처리된 래트의 길이 2 cm(결장의 끝으로부터 ∼4-6 cm)의 결장 조직을 가짜 대조군(S)으로 취하였다(도 1).
7. 전체 두께 준비를 위해 각 부위에서 조직 샘플을 채취하고 원하는 경우 점막 / 점막하 및 근육 externa 층뿐만 아니라 각각^21,22 개입니다.
8. 조직 샘플을 액체 질소에서 먼저 동결시킨 후 -80°C에서 보관하여 최대 일년 동안 보관하고 향후 목적(즉, RNA 제제)을 위해 보관합니다.

3. 장내 염증과 섬유증의 조직병리학적 평가

1. 전체 두께의 결장 조직을 48 시간 동안 10 % 포르말린에 고정시킨 다음 24-48 시간 동안 70 % 에탄올로 옮깁니다.
2. 마이크로톰을 사용하여 헤마톡실린과 에오신(H&E) 및 마손의 삼색 염색 ^6,19,23(물질 표 참조)에 대해 각각 5μm 두께의 파라핀 절편을 절단한다.
3. 호환되는 소프트웨어가 장착된 고해상도 카메라가 장착된 직립 현미경으로 이미지를 획득하고 봅니다( 자료표 참조).
4. 등급 염증 및 섬유증 지수^{는 이전에 기술}된 기준에 따라 위장관 외과 병리학자를 포함하는 두 명의 독립적인 조사자에 의해 ^6,23 변형과 함께 지수를 평가한다. 점수는 보충 파일 1을 참조하십시오.
5. 단면당 원형 및 종방향 근육층의 두께와 세포 수를 각 H&E 염색된 표본의 네 가지 뷰로 측정하고 각 표본에 대한 네 가지 측정값의 평균을 취합니다.

4. RNA 추출 및 정량적 RT-PCR

1. RNA 추출 키트의 추출 시약에서 TNBS 대장염 래트의 가짜 대조군 및 세 부위(P, I, D)로부터 수득된 적출된 결장 조직을 균질화 한다(표 참조).
2. 키트를 이용하여 각 샘플로부터 RNA를 분리한다. RNA 펠렛을 30 μL의 RNase-free 물에 희석한다.
3. RNA 농도를 정량화하고 마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 순도를 확인합니다( 자료 표 참조).
4. 총 RNA 1μg을 사용하여 RNA 합성 키트를 사용하여 cDNA^21,22를 합성합니다(표 참조).
5. 실시간 PCR 시스템용 상용 PCR 키트를 사용하여 50 ng의 cDNA, IL-6의 프로브 및 CTGF를 주형으로 하여 실시간 PCR을 수행하여 유전자 발현 수준을 분석 및 정량한다( 표 참조).
6. 대조군 유전자 18S rRNA를 사용하여 샘플을 정상화하고 수득된 Cq 값을 활용하여 상대적 유전자 발현을 정량화한다.

5. 통계 분석

1. 통계 분석 소프트웨어 ( 자료 표 참조)를 사용하여 가짜 대조군과 TNBS 대장염 쥐를 비교하십시오.
2. 0.05< p 값은 통계적으로 유의한^15,19로 간주하십시오.
3. 두 그룹 간의 차이를 테스트하려면 스튜던트 t-검정 분석을 사용하고 비교가 두 그룹^15,19 이상인 경우 ANOVA 테스트를 수행합니다.

결과

TNBS의 결장 내 점적에 의해 유발된 크론유사 대장염의 거시적 관점
도 1에 나타난 바와 같이, 래트에서 TNBS의 결장내 점안은 원위 결장에서의 점적 부위에서 두꺼운 창벽과 좁아진 내강(협착증)으로 국소화된 경막 염증(길이∼2 cm)을 유도하였다(도 1A). TNBS 점안의 부위는 부위 I로 지칭된다. 경막 염증 및 협착증의 결과로, 염증과 기계적 ?...

토론

TNBS 유발 대장염은 1989년에 도입되었으며 그 후 ^19,20,23년 이후 크론병의 실험 모델로 사용되어 왔다. 설치류에서이 모델의 중요한 특징은 인간 크론 병^19,20에서 개발 된 조직 병리학 적 병변과 매우 유사한 경벽 염증의 발달을 포함합니다. 모델에 대한 이전의 연구는 주로 눈에 보이?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63	Nikon	DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BIO-RAD	1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems	BIO-RAD	1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer	Dako	AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173	Dako	AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera	Nikon	DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control	ThermoFisher Scientific	4352930E
E-Z Anesthesia	E-Z Systems Inc.	EZ-155
GraphPad Prism 9	GraphPad	9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear	BIO-RAD	HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium)	CORNING	21-021-CV
HM 325 Microtome	Thermo Scientific	23-900-667
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System	LI-COR	9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler	Eppendorf	5341
Medical grade open end polyurethane catheter	Covidien	8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope	Nikon	E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm	BIO-RAD	1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative	Miralax	C8175	Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers	QIAGEN	74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System	ThermoFisher Scientific	18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe	ThermoFisher Scientific	4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe	ThermoFisher Scientific	4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher Scientific	4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1	Sakura	6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer	Sakura	6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution)	SIGMA-ALDRICH	92822