Eine minimal-invasive, schnelle laterale Hemisektionstechnik des Rückenmarks zur Modellierung offener Rückenmarksverletzungen bei Ratten

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine neue, schnelle Technik, die eine offene Rückenmarksverletzung bei Ratten modelliert und die Laminektomie eliminiert. Die laterale Hemisektion wird unter dem Mikroskop durchgeführt. Die Technik ist vielseitig einsetzbar und kann auch im Hals-, Brust- und Lendenwirbelbereich des Rückenmarks anderer Tiere angewendet werden.

Zusammenfassung

Offene Rückenmarksverletzungstechniken, die rissartige Verletzungen modellieren, sind zeitaufwändig und invasiv, da sie eine Laminektomie beinhalten. Diese neue Technik eliminiert die Laminektomie, indem zwei Dornfortsätze entfernt und der kaudale Wirbelbogen angehoben und dann gekippt wird. Das Operationsgebiet öffnet sich, ohne dass eine Laminektomie erforderlich ist. Die laterale Hemisektion wird dann unter direkter Sichtkontrolle unter dem Mikroskop durchgeführt. Das Trauma wird minimiert, es ist nur eine kleine Knochenwunde erforderlich.

Diese Technik hat mehrere Vorteile: Sie ist schneller und damit weniger belastend für das Tier und die Knochenwunde ist kleiner. Da die Laminektomie eliminiert wird, ist die Wahrscheinlichkeit einer unerwünschten Verletzung des Rückenmarks geringer und es gibt keine Knochensplitter, die Probleme verursachen können (Knochensplitter, die in das Rückenmark eingebettet sind, können Schwellungen und Folgeschäden verursachen). Der Wirbelkanal bleibt intakt. Die Haupteinschränkung besteht darin, dass die Hemisektion nur in den Zwischenwirbelräumen durchgeführt werden kann.

Die Ergebnisse zeigen, dass diese Technik viel schneller durchgeführt werden kann als der traditionelle chirurgische Ansatz mit Laminektomie (11 min vs. 35 min). Diese Technik kann für Forscher nützlich sein, die mit Tiermodellen für offene Rückenmarksverletzungen arbeiten, da sie weitgehend anpassungsfähig ist und keine zusätzlichen Spezialinstrumente erfordert.

Einleitung

Rückenmarksverletzungen (SCIs) sind leider weit verbreitete Verletzungen beim Menschen. Querschnittlähmungen können auf unterschiedliche Weise kompliziert sein, z. B. durch Infektionen, und es ist klinisch wichtig, diese Verletzungen zu untersuchen¹. Da es kein einziges, definitives Heilmittel für Querschnittlähmungen gibt, werden Tiermodelle immer noch benötigt, um das Verständnis der Forscher zu verbessern und mögliche Behandlungen voranzutreiben ^2,3. Obwohl am häufigsten geschlossene Verletzungen modelliert werden (Kompression und Prellung), ist es klinisch wichtig, Risswunden zu verstehen, die nur bei offenen Verletzungen modelliert werden können⁴. Offene Wundmodelle mittels Durchtrennung oder Hemisektion können verwendet werden, um eine genauere Lokalisation einer Wunde im Vergleich zu geschlossenen Verletzungsmodellen aufgrund der Art der Verletzung (Prellung vs. chirurgischer Schnitt) zu demonstrieren. Experimente mit offenen Wunden können auf kontrollierte, zuverlässige und replizierbare Weise Aufschluss über spezifischere neuronale Verletzungen geben⁵. Die vollständige oder partielle Durchtrennung des Rückenmarks ist eine weit verbreitete offene Wundtechnik und kann im Artikel von Brown und Martinez⁶ ausführlich betrachtet werden.

Bei der Untersuchung einer offenen Rückenmarksverletzung bei Ratten zeigten mehrere Tiere Probleme, die durch die Operation entstanden waren: Knochensplitter aus der Laminektomie wurden in das Rückenmark eingebettet und verursachten Schwellungen; Die größere Knochenwunde brauchte lange, um zu heilen; Die Operation dauerte zu lange. Um diese Probleme zu beseitigen, wurde eine alternative Operationstechnik entwickelt. Ziel war es, eine schnellere Technik zu entwickeln, die für das Tier schonender ist. Diese neu entwickelte Technik ist viel schneller als herkömmliche SCI-Techniken. Der chirurgische Ansatz ist minimalinvasiv, was zu einer kleineren Knochenwunde führt und gleichzeitig Probleme beseitigt, die durch die Laminektomie entstehen.

Bei allen offenen Wundtechniken wird die Dura⁷ geöffnet. Mehrere neuere Studien haben verschiedene, neu entwickelte Techniken untersucht, die darauf abzielen, die bisherigen Methoden zu verbessern ^8,9. Auch wenn die Öffnung der Dura mit dieser neuen Technik nicht ausgeschlossen werden kann, bewirkt sie eine kleinere Wunde an der Dura und bietet gleichzeitig eine zuverlässige, kontrollierte Verletzung des Rückenmarks. In der Literatur über Techniken zur Rückenmarksverletzung versuchten viele Autoren, die Operationszeit zu minimieren, indem sie geringfügige Änderungen an der ursprünglichen Technik vornahmen¹⁰. Die Laminektomie ist immer Teil dieser chirurgischen Eingriffe, obwohl sie zeitaufwändig ist und eine größere Knochenwunde^erfordert6. Diese Operationstechnik kann für Forscher geeignet sein, die Modelle für Rückenmarksverletzungen mit offenen Wunden verwenden, insbesondere für eine vollständige Durchtrennung oder laterale Hemisektion, die in den Zwischenwirbelräumen durchgeführt wird (Abbildung 1).

Protokoll

Alle Tierbehandlungen wurden gemäß der EU-Richtlinie (2010/63/EU) durchgeführt und von der Tierethikkommission des ungarischen Nationalen Amtes für die Sicherheit der Lebensmittelkette genehmigt (PEI/001/2894-11/2014). Alle geltenden institutionellen und behördlichen Vorschriften bezüglich der ethischen Verwendung von Tieren wurden während dieser Studie befolgt.

1. Vorbereitung vor der Operation

1. Sterilisieren Sie alle Instrumente, die während des Eingriffs verwendet werden (siehe Materialtabelle) und desinfizieren Sie die Oberflächen, auf denen die Arbeiten durchgeführt werden sollen, vor dem Eingriff.
2. Injizieren Sie prophylaktisch eine Einzeldosis subkutaner Antibiotika.
   HINWEIS: Details zur Antibiotikadosierung finden Sie in der Materialtabelle.
3. Lassen Sie die Tiere 1 Stunde im Operationssaal, um sie zu akklimatisieren und ihren Stress vor der Operation zu verringern.
4. Betäubung der Ratte durch intramuskuläre Injektion einer Kombination aus Ketamin und Xylazin (Ketamin 80 mg/kg Körpergewicht (KG) und Xylazin 8 mg/kg KG).
   HINWEIS: Zusätzlich zur Anästhesiebietet die k-Etamin-Xylazin-Kombination eine ausreichende Analgesie für dieses Verfahren. Das Analgesie-Schema kann gemäß den institutionellen Richtlinien für die Verwendung von Tieren geändert werden.
5. Halten Sie die Ratte während des Eingriffs mit einem beheizten Tisch oder Infrarotlicht warm und halten Sie die Augen während der gesamten Anästhesie mit Augensalbe feucht (bei Bedarf erneut auftragen).
6. Fixieren Sie das Tier auf dem Operationstisch mit chirurgischem Klebeband an den Vorder- und Hinterpfoten und am Schwanz sowie je nach Verletzungsstelle auch am Hals. Falls erforderlich, legen Sie die Ratte in einen stereotaktischen Rahmen, um sie während der Operation zu stabilisieren.
7. Legen Sie mit sterilem chirurgischem Nahtmaterial eine Schlaufe um die oberen Frontzähne der Ratte und fixieren Sie diese an der Kante des Operationstisches.
8. Ziehen Sie die Zunge seitlich heraus, um die Atemwege zu regulieren.
9. Rasieren Sie das Fell auf dem Rücken, mindestens 2 cm in jede Richtung, in die der Schnitt gemacht werden soll.
10. Desinfizieren Sie die Haut des Operationsgebiets mindestens dreimal mit einer Povidon-Jod-Lösung und steriler Gaze. Achten Sie besonders darauf, das Fell in der Umgebung einzuweichen. Sichern Sie die Operationsstelle mit einem sterilen Tuch.
11. Beurteilen Sie die Angemessenheit der Anästhesie, bevor Sie den ersten Schnitt setzen, indem Sie die Zehen und den Schwanz des Tieres einklemmen. Überwachen Sie weiterhin die Angemessenheit der Anästhesie während des gesamten Eingriffs.

2. Chirurgie

1. Platzieren Sie den Hautschnitt mit einer Skalpellklinge 20. Um das Operationsgebiet zu öffnen, setzen Sie einen 2-2,5 cm langen Schnitt entlang der Wirbelsäule, der alle Hautschichten durchschneidet. Positionieren Sie diesen Schnitt parallel zur Wirbelsäule mit dem L1-Wirbel als Mittelpunkt, so dass er sich ~1 cm sowohl in kranialer als auch kaudaler Richtung entlang der Wirbelsäule erstreckt.
2. Mobilisieren Sie die Seiten der Wunde, indem Sie das Bindegewebe durchschneiden, das die Muskeln umgibt.
3. Platzieren Sie zwei parallele Schnitte entlang der Wirbelsäule, die in die Knochenhaut eindringen. Platzieren Sie die Schnitte direkt neben den Wirbelsäulenfortsätzen auf beiden Seiten und überbrücken Sie den Abstand zwischen den Wirbeln Th13 und L1.
4. Präparieren Sie die an den Wirbeln befestigten Muskeln mit Hilfe eines Raspatoriums, bis alle Wirbelsäulenbänder sichtbar sind. Setzen Sie einen Retraktor ein.
5. Entfernen Sie die Wirbelsäulenfortsätze des 13. Brustwirbels und des 1. Lendenwirbels mit einer Zahnknochenzange, um das gesamte Operationsgebiet zu visualisieren^. Kontrollieren Sie hierauf die Prozedur, indem Sie ein vergrößertes (4x-16x Vergrößerung) mikroskopisches Bild betrachten.
6. Verwenden Sie bei Bedarf sterile Gaze, um Blutungen während des gesamten Eingriffs zu kontrollieren.
7. Heben Sie vorsichtig den Rest der L1-Wirbelsäulenfortsätze an und heben Sie den L1-Wirbelbogen an. Durchtrennen Sie das Ligamentum flavum, um Zugang zum Rückenmark zu erhalten. Heben Sie die kaudalen Wirbelsäulenfortsätze weiter an, um den Zugang zur Dura mater spinalis zu ermöglichen, die ebenfalls durchtrennt wird. Kippen Sie die kaudalen Wirbelsäulenfortsätze in kraniale Richtung, um die Pia mater sichtbar zu machen.
8. Suchen Sie durch die Pia mater nach der hinteren Medianvene, die die Mittellinie der Wirbelsäule zeigt.
9. Verwenden Sie die Vene als gerichtete Winkelhalbierende, und setzen Sie einen Schnitt mit einem mikrochirurgischen Skalpell, während Sie die Vene schonen. Platzieren Sie den Schnitt unter der Vene in der Transversalebene durch den anteroposterioren Durchmesser des Rückenmarks. Durchtrennen Sie die Hälfte des Rückenmarks, indem Sie die Klinge seitlich von der Mittellinie wegbewegen.
   HINWEIS: Der Schnitt erfolgt einseitig, auf der rechten Seite, am 4^. Lendensegment.
10. Versuchen Sie, den Schnitt zu setzen, um zu vermeiden, dass die vordere Spinalarterie durchtrennt wird. Achten Sie darauf, dass beim Durchtrennen des Rückenmarks kein übermäßiger Druck auf den Wirbelkörper ausgeübt wird, um die vordere Rückenmarksarterie auf der ventralen Seite des Rückenmarks zu schonen.

Abbildung 1: Kunstwerk, das die Schritte der neuen offenen SCI-Technik bei Ratten zeigt. (A) Die freigelegten Wirbel. (B) Spinalfortsätze entfernt (Th13 und L1). (C) Der angehobene und gekippte Wirbelbogen des L1-Wirbels. (D) Hemisektion auf der rechten Seite, wobei das gehämmerte Rückenmark separat dargestellt und vergrößert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

11. Verschließen Sie die Dura mater nicht direkt während des Wundverschlusses. Die Muskeln entlang der Wirbelsäulenfortsätze straff vernähen (Nahtgröße 4-0) und die kleine Wunde an der Dura mater indirekt verschließen.
12. Verschließen Sie die dorsale Bindegewebsschicht mit Nähten.
13. Zum Schluss nähen Sie die Haut um die Einschnittsstelle herum.

3. Nachsorge und Nachsorge

1. Lassen Sie die Tiere in ihren Käfigen erwachen. Halten Sie das/die Tier(e) zusätzlich zum temperierten Raum mit einer Wärmelampe warm. Lassen Sie die Ratten nach dem Aufwachen nach der Operation nicht allein und setzen Sie sie nicht zusammen mit anderen Ratten in denselben Käfig.
2. Überwachen Sie ihre Atemfrequenz mindestens alle 10 Minuten, bis sie vollständig wach sind. Wenden Sie bei Bedarf eine sanfte Stimulation an (z. B. den Kopf reiben), um das Erwachen aus der Narkose zu unterstützen.
3. Wenn die Tiere wach und entsprechend aktiv sind, transportieren Sie sie sicher zurück ins Tierhaus.
4. Halten Sie die Ratten in den ersten 24 Stunden nach der Operation unter strenger Beobachtung. Nach den ersten 24 Stunden nach der Operation sollten die Tiere bis zum Ende des Versuchs mindestens zweimal täglich auf Anzeichen von Stress untersucht werden.
5. Untersuchen Sie sie einmal täglich gründlich auf Anzeichen von Stress anhand des entsprechenden institutionellen Tierschutzprotokolls und achten Sie besonders darauf, ihre Wunden auf Anzeichen von Infektionen und Entzündungen zu untersuchen.
   HINWEIS: Stress und Infektionen beeinträchtigen das Wohlergehen der Tiere und das Ergebnis von Versuchen.
6. Verabreichen Sie Antibiotika täglich subkutan bis zum Ende der Experimente. Halten Sie die Tiere in sterilen Käfigen, ein Tier pro Käfig, und geben Sie Futter und Wasser nach Belieben, wie zuvor. Am Ende der Versuche (oder wenn während des Zeitraums des Versuchs eine schwerwiegende Nebenwirkung beobachtet wird) werden die Tiere auf humane Weise und in Übereinstimmung mit dem einschlägigen institutionellen Tierschutzprotokoll eingeschläfert.
   ANMERKUNG: Hier wurden die Tiere euthanasiert (in einem Tiefschlaf, der durch die Kombination von Ketamin und Xylazin induziert wurde), indem zuerst eine physiologische Kochsalzperfusion (1/3 ml/g Körpergewicht) verabreicht wurde, gefolgt von einer 4%igen Paraformaldehydperfusion (1 ml/g Körpergewicht).

Ergebnisse

Nach der Hemisektion zeigen die Ratten eine Lähmung der ipsilateralen Hintergliedmaße (in vivo Nachweis einer erfolgreichen Hemisektion). Eine gründliche Probenuntersuchung kann erst nach der Entfernung des Rückenmarks durchgeführt werden (siehe Abbildung 2, wo das entfernte Rückenmark sowohl von der ventralen als auch von der dorsalen Seite zu sehen ist).

Diskussion

Diese minimal-invasive Technik der Rückenmarksverletzung wurde bei der Untersuchung von rückenmarksverletzten Ratten entwickelt, und das Team sah sich mit Problemen konfrontiert, die sich aus der Operation selbst ergaben (Knochensplitter aus der Laminektomie, die Kompression verursachen und das Rückenmark schädigen, zu lange Operation, langsame Heilung einer großen Knochenwunde). Durch die Eliminierung der Laminektomie wurde der Eingriff viel schneller (11 min vs. 35 min), die Struktur des Wirbelkanals blieb intakt,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Augmentin (1,000 mg/200 mg powder)	GlaxoSmithKline, UK		One-time dose of s.c. antibiotics prophylactically (10 mg of amoxicillin and 2 mg clavulanic acid; Augmentin 1,000 mg/200 mg powder). Every day following surgery, 10 mg of amoxicillin and 2 mg of clavulanic acid (Augmentin 1,000 mg/200 mg powder) per day per animal
Betadine	EGIS, Hungary		Disinfect the skin of the surgical area using a povidone-iodine solution
Calypsol (50 mg/mL)	Richter Gedeon, Hungary		Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly
CP XYLAZIN 2% (20 mg/mL)	Produlab Pharma B.V., the Netherlands		Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly
Dental bone forceps	Dentech, Hungary	BS 0127	Remove the spinous processes of the 13th thoracic vertebra and the 1st lumbar vertebra using dental bone forceps
dental surgical micromotor	W&H, Austria	MF-TECTORQUE	Using a dental surgical micromotor, a laminectomy is performed at the L1 vertebra
optical microscope	Zeiss, Germany	OPMI19-FC	Control the procedure by viewing an enlarged (16x magnification) microscopic image
physiological saline solution (0.9% NaCl)	Fresenius Kabi, Germany		Keep the rat's eyes moist throughout the entire anesthesia using physiological saline solution drops (reapply as necessary)
raspatorium	Dentech, Hungary	FK 1164	Dissect the muscles attached to the vertebrae with the aid of a raspatorium, until all the spinal ligaments are visible.
retractor	Dentech, Hungary	RT 1253
scalpel	Dentech, Hungary	BB 173
scalpel	Dentech, Hungary	BB 184
scalpel blade 12	B. Braun, Germany	12
scalpel blade 20	B. Braun, Germany	20
sterile cut gauze 10 x 10 cm	Sterilux, Hartmann, Germany
sutures (monofilament, synthetic; absorbable and nonabsorbable), size: 4-0	B. Braun, Germany
tweezer (13 cm)	Dentech, Hungary	BD 1555
tweezer (delicate tissue forceps)	Dentech, Hungary	BD 1670