쥐의 개방성 척수 손상 모델링을 위한 최소 침습적이고 빠른 척수 측면 반절제 기술

요약

여기에서는 후궁 절제술을 제거하는 쥐의 개방성 척수 손상을 모델링하는 새롭고 빠른 기술에 대해 설명합니다. 측면 반절부는 현미경을 통해 보면서 수행됩니다. 이 기술은 다재다능하며 다른 동물의 척수의 경추, 흉부 및 요추 영역에도 사용할 수 있습니다.

초록

열상과 같은 부상을 모델링하는 개복 척수 손상 기술은 후궁 절제술을 포함하기 때문에 시간이 많이 걸리고 침습적입니다. 이 새로운 기술은 두 개의 가시돌기를 제거하고 꼬리 척추궁을 들어 올린 다음 기울임으로써 후궁 절제술을 제거합니다. 후궁 절제술 없이 수술 부위가 열립니다. 그런 다음 측면 반절부는 현미경으로 직접 육안으로 제어하여 수행됩니다. 외상이 최소화되어 작은 뼈 상처만 있으면 됩니다.

이 기술은 몇 가지 장점이 있습니다 : 더 빠르고, 따라서 동물에게 부담이 적고, 뼈 상처가 더 작습니다. 후궁 절제술이 제거되기 때문에 척수에 원치 않는 손상이 발생할 가능성이 적고 문제를 일으킬 수 있는 뼈 파편이 없습니다(척수에 박힌 뼈 파편은 부종과 2차 손상을 유발할 수 있음). 척추관은 온전하게 남아 있습니다. 주요 제한 사항은 반절제가 추간 공간에서만 수행될 수 있다는 것입니다.

결과는 이 기술이 후궁 절제술을 사용하는 전통적인 수술 방법보다 훨씬 빠르게 수행될 수 있음을 보여줍니다(11분 대 35분). 이 기술은 개방성 척수 손상의 동물 모델을 다루는 연구자들에게 유용할 수 있는데, 이는 광범위하게 적응할 수 있고 추가적인 특수 기구가 필요하지 않기 때문입니다.

서문

척수 손상(SCI)은 불행히도 인간에게 흔한 부상입니다. SCI는 감염과 같은 다양한 방식으로 복잡해질 수 있으며, 이러한 부상을 연구하는 것이 임상적으로 중요합니다¹. SCI에 대한 단일하고 확실한 치료법이 없기 때문에 연구자들의 이해를 높이고 가능한 치료법을 발전시키기 위해서는 동물 모델이 여전히 필요합니다 ^2,3. 폐쇄성 부상이 가장 일반적으로 모델링되지만(압박 및 타박상), 개방성 부상에서만 모델링할 수 있는 열상을 이해하는 것이 임상적으로 중요하다⁴. 절개 또는 반절개를 사용하는 개방성 상처 모델은 부상의 특성(타박상 대 외과적 절단)으로 인해 폐쇄성 부상 모델에 비해 상처의 더 정확한 국소화를 입증하는 데 사용할 수 있습니다. 개방 상처 실험은 통제되고 신뢰할 수 있으며 복제 가능한 방식으로 보다 구체적인 신경 손상에 대한 실마리를 제공할 수 있다⁵. 척수의 전체 또는 부분 절개는 널리 사용되는 개방 상처 기술이며 Brown과 Martinez의 논문에서 자세히 볼 수 있습니다⁶.

쥐의 개방성 척수 손상을 연구할 때, 몇몇 동물은 수술로 인해 발생하는 문제를 제시했습니다: 후궁 절제술로 인한 뼈 파편이 척수에 박혀 부종을 일으켰습니다. 더 큰 뼈 상처는 치유하는 데 오랜 시간이 필요했습니다. 수술이 너무 오래 걸렸다. 이러한 문제를 없애기 위해 대체 수술 기법이 개발되었습니다. 목표는 동물에게 더 부드러운 더 빠른 기술을 개발하는 것이 었습니다. 새로 개발된 이 기술은 기존 SCI 기술보다 훨씬 빠릅니다. 수술적 접근법은 최소 침습적이어서 후궁 절제술로 인해 발생하는 문제를 제거하면서 뼈 상처를 작게 만듭니다.

모든 개방 권선 기술에는 경막^{개방 7}이 포함됩니다. 최근의 여러 연구에서는 이전 방법(^8,9)을 개선하기 위해 새로 개발된 다양한 기술을 조사했습니다. 이 새로운 기술을 사용하여 경막의 개방을 배제할 수는 없지만, 경막에 더 작은 상처를 유발하는 동시에 척수의 안정적이고 통제된 손상을 제공합니다. 척수 손상 기법에 대한 문헌을 참조한 많은 저자들은 원래의 기법에 약간의 변화를 주어 수술 시간을 최소화하려고 노력했다¹⁰. 후궁 절제술은 시간이 많이 걸리고 더 큰 뼈 상처를 만들어야 하지만 항상 이러한 수술 절차의 일부입니다⁶. 이 수술 기법은 개방성 상처 척수 손상 모델, 특히 추간 공간에서 수행되는 완전 절개 또는 외측 반절개를 사용하는 연구자에게 적합할 수 있습니다(그림 1).

프로토콜

모든 동물 시술은 EU 지침(2010/63/EU)에 따라 수행되었으며 헝가리 국립 식품 사슬 안전 사무소(PEI/001/2894-11/2014)의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구 기간 동안 동물의 윤리적 사용에 관한 모든 해당 기관 및 정부 규정을 준수했습니다.

1. 수술 전 준비 사항

1. 절차 중에 사용되는 모든 기구를 소독하고( 재료 표 참조) 절차 전에 작업을 수행할 표면을 소독합니다.
2. 예방적 차원에서 피하 항생제를 1회 투여한다.
   알림: 항생제 투여량에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
3. 수술 전에 동물들이 적응하고 스트레스를 줄일 수 있도록 1시간 동안 수술실에 두십시오.
4. 케타민과 자일라진(케타민 80mg/kg 체중(bw) 및 자일라진 8mg/kg bw)의 조합의 근육 주사를 통해 쥐를 마취합니다.
   알림: 마취 외에도 k에타민-자일라진 조합은 이 절차에 충분한 진통을 제공합니다. 진통 요법은 기관 동물 사용 지침에 따라 수정할 수 있습니다.
5. 가열된 테이블이나 적외선을 사용하여 시술 중에 쥐를 따뜻하게 유지하고 안과 연고를 사용하여 마취 내내 눈을 촉촉하게 유지합니다(필요에 따라 다시 바르십시오).
6. 앞발과 뒷발과 꼬리에 수술용 테이프를 사용하여 동물을 수술대에 고정하고 부상 부위에 따라 목에도 고정합니다. 필요한 경우 쥐를 입체 프레임에 넣어 수술 중에 안정시킵니다.
7. 멸균 수술용 봉합사를 사용하여 쥐의 위쪽 앞니 주위에 고리를 놓고 수술대 가장자리에 고정합니다.
8. 기도 관리를 위해 혀를 옆으로 당깁니다.
9. 절개할 부위의 각 방향으로 최소 2cm 이상 뒷면의 털을 면도합니다.
10. 포비돈 요오드 용액과 멸균 거즈를 사용하여 수술 부위의 피부를 최소 3회 소독합니다. 주변 모피를 적시도록 각별히 주의하십시오. 멸균 드레이프로 수술 부위를 고정합니다.
11. 동물의 발가락과 꼬리를 꼬집어 첫 번째 절개를 하기 전에 마취의 적절성을 평가합니다. 전체 절차 동안 마취의 적절성을 계속 모니터링하십시오.

2. 수술

1. 메스 칼날을 사용하여 피부 절개 부위를 놓습니다 20. 수술 부위를 열려면 척추를 따라 2-2.5cm 길이의 절개를 하여 피부의 모든 층을 절단합니다. L1 척추를 중간점으로 사용하여 이 절개를 척추와 평행하게 배치하여 척추를 따라 두개골과 꼬리 방향으로 ~1cm 확장되도록 합니다.
2. 근육을 둘러싼 결합 조직을 절단하여 상처 측면을 동원합니다.
3. 척추를 따라 두 개의 평행한 절개를 하여 골막을 관통합니다. Th13 척추뼈와 L1 척추뼈 사이의 거리에 걸쳐 양쪽의 척추 돌기 바로 옆에 절개 부위를 배치합니다.
4. 모든 척추 인대가 보일 때까지 raspatorium의 도움으로 척추에 부착 된 근육을 해부합니다. 견인기를 제자리에 놓으십시오.
5. 치과용 뼈 겸자를 사용하여 13번째 흉추와 1^번째 요추의 척추 돌기를 제거하여 전체 수술 영역을 시각화합니다. 이때, 확대된(4x-16x 배율) 현미경 이미지를 보면서 절차를 제어합니다.
6. 필요한 경우 멸균 거즈를 사용하여 시술 전반에 걸쳐 출혈을 조절하십시오.
7. L1 척추 돌기의 나머지 부분을 조심스럽게 들어 올려 L1 척추 아치를 들어 올립니다. 척수에 접근하기 위해 인대 플라붐을 절단합니다. 꼬리 척추 돌기를 더 높여 척추 경막에 접근할 수 있도록 합니다. 꼬리 척추 돌기를 두개골 방향으로 기울여 pia mater를 시각화합니다.
8. 척추의 정중선을 보여주는 후방 정중 정맥을 위해 pia mater를 살펴보십시오.
9. 정맥을 방향성 이등분선으로 사용하여 정맥을 보존하면서 미세 수술 메스를 사용하여 절개합니다. 절개 부위를 정맥 아래, 척수의 전후 직경을 통과하는 횡단면에 놓습니다. 칼날을 중심선에서 옆으로 움직여 척수의 절반을 절단합니다.
   참고: 절개는 오른쪽 4^번째 요추 분절에서 편측입니다.
10. 전방 척추 동맥이 절단되지 않도록 절개 부위를 배치하십시오. 척수를 절단할 때 척수의 복부 쪽에 있는 전방 척추 동맥을 살리기 위해 척추체에 과도한 압력이 가해지지 않도록 하십시오.

그림 1: 쥐를 대상으로 한 새로운 개방형 SCI 기법의 단계를 보여주는 삽화. (A) 노출된 척추뼈. (B) 척추 돌기 제거(Th13 및 L1). (C) L1 척추의 들어 올려지고 기울어진 척추 아치. (D) 오른쪽에서 시행된 반절부는 반절제된 척수를 별도로 확대하여 확대한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

11. 상처를 봉합하는 동안 경막을 직접 닫지 마십시오. 척추 돌기를 따라 근육을 단단히 봉합(봉합사 크기 4-0)하여 경막의 작은 상처를 간접적으로 봉합합니다.
12. 봉합사로 등쪽 결합 조직층을 닫습니다.
13. 마지막으로 절개 부위 주변의 피부를 봉합합니다.

3. 수술 후 관리 및 후속 조치

1. 동물들이 우리 안에서 깨어날 수 있도록 합니다. 온도 조절이 가능한 방 외에 열 램프를 사용하여 동물을 따뜻하게 유지하십시오. 수술 후 깨어난 쥐를 혼자 두지 말고, 다른 쥐와 함께 같은 케이지에 넣지 마십시오.
2. 완전히 깨어날 때까지 최소 10분마다 호흡수를 모니터링하십시오. 필요한 경우 부드러운 자극(예: 머리 문지르기)을 가하여 마취에서 깨어날 수 있도록 돕습니다.
3. 동물이 경계하고 적절하게 활동하면 안전하게 동물 집으로 다시 이송하십시오.
4. 수술 후 처음 24시간 동안 쥐를 면밀히 관찰하십시오. 수술 후 첫 24시간 이후, 실험이 끝날 때까지 적어도 하루에 두 번 동물을 검사하여 고통의 징후를 모니터링하십시오.
5. 관련 기관 동물 복지 프로토콜을 사용하여 하루에 한 번 고통의 징후가 있는지 철저히 평가하고 상처에 감염 및 염증 징후가 있는지 확인하는 데 특별한 주의를 기울이십시오.
   참고: 스트레스와 감염은 동물의 복지와 실험 결과에 영향을 미칩니다.
6. 실험이 끝날 때까지 매일 항생제를 피하 투여합니다. 동물을 무균 케이지에 보관하고, 케이지 당 한 마리를 사육하고, 이전과 마찬가지로 음식과 물을 즉시 제공합니다. 실험이 끝날 때(또는 실험 기간 동안 심각한 부작용이 관찰되는 경우) 관련 기관 동물 복지 프로토콜에 따라 동물을 인도적으로 안락사시킵니다.
   참고: 여기서, 동물은 먼저 생리식염수 관류(1/3mL/g bw)를 투여한 후 4% 파라포름알데히드 관류(1mL/g bw)를 투여하여 안락사시켰다(케타민-자일라진의 조합에 의해 유도된 깊은 수면 상태에서).

결과

반절개 후 쥐는 동측 뒷다리에 마비를 보입니다(성공적인 반절부 증거). 철저한 검체 평가는 척수를 제거한 후에만 수행할 수 있습니다(제거된 척수가 복쪽과 등쪽 모두에서 볼 수 있는 그림 2 참조).

그림 2: 반절개 후 제거된 척수...

토론

이 최소 침습적 척수 손상 기술은 척수 손상 쥐를 연구할 때 개발되었으며, 연구팀은 수술 자체에서 발생하는 문제(후궁 절제술로 인한 뼈 파편이 압박을 유발하고 척수를 손상시키거나, 수술이 너무 오래 걸리거나, 큰 뼈 상처의 치유가 느림)에 직면했습니다. 후궁 절제술을 없앰으로써 시술이 훨씬 빨라졌고(11분 대 35분), 척추관의 구조가 온전하게 유지되었으며, 뼈 상처가 훨씬 작아졌으며, 척?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Augmentin (1,000 mg/200 mg powder)	GlaxoSmithKline, UK		One-time dose of s.c. antibiotics prophylactically (10 mg of amoxicillin and 2 mg clavulanic acid; Augmentin 1,000 mg/200 mg powder). Every day following surgery, 10 mg of amoxicillin and 2 mg of clavulanic acid (Augmentin 1,000 mg/200 mg powder) per day per animal
Betadine	EGIS, Hungary		Disinfect the skin of the surgical area using a povidone-iodine solution
Calypsol (50 mg/mL)	Richter Gedeon, Hungary		Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly
CP XYLAZIN 2% (20 mg/mL)	Produlab Pharma B.V., the Netherlands		Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly
Dental bone forceps	Dentech, Hungary	BS 0127	Remove the spinous processes of the 13th thoracic vertebra and the 1st lumbar vertebra using dental bone forceps
dental surgical micromotor	W&H, Austria	MF-TECTORQUE	Using a dental surgical micromotor, a laminectomy is performed at the L1 vertebra
optical microscope	Zeiss, Germany	OPMI19-FC	Control the procedure by viewing an enlarged (16x magnification) microscopic image
physiological saline solution (0.9% NaCl)	Fresenius Kabi, Germany		Keep the rat's eyes moist throughout the entire anesthesia using physiological saline solution drops (reapply as necessary)
raspatorium	Dentech, Hungary	FK 1164	Dissect the muscles attached to the vertebrae with the aid of a raspatorium, until all the spinal ligaments are visible.
retractor	Dentech, Hungary	RT 1253
scalpel	Dentech, Hungary	BB 173
scalpel	Dentech, Hungary	BB 184
scalpel blade 12	B. Braun, Germany	12
scalpel blade 20	B. Braun, Germany	20
sterile cut gauze 10 x 10 cm	Sterilux, Hartmann, Germany
sutures (monofilament, synthetic; absorbable and nonabsorbable), size: 4-0	B. Braun, Germany
tweezer (13 cm)	Dentech, Hungary	BD 1555
tweezer (delicate tissue forceps)	Dentech, Hungary	BD 1670