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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll vor, mit dem therapeutische Arzneimitteltests mit Patientinnen-Ovarialkarzinom-Organoiden durchgeführt werden können.

Zusammenfassung

Eierstockkrebs ist eine tödliche gynäkologische Krebserkrankung und die fünfthäufigste Krebstodesursache bei Frauen in den Vereinigten Staaten. Die Entwicklung neuer medikamentöser Behandlungen ist von entscheidender Bedeutung, um die Gesundheitsversorgung voranzubringen und die Behandlungsergebnisse für Patienten zu verbessern. Organoide sind in vitro dreidimensionale mehrzellige Miniaturorgane. Patient-derived organoid (PDO)-Modelle von Eierstockkrebs können optimal für das Arzneimittel-Screening sein, da sie die interessierenden Gewebe genauer rekapitulieren als zweidimensionale Zellkulturmodelle und im Vergleich zu patienteneigenen Xenotransplantaten kostengünstig sind. Darüber hinaus ahmen Eierstockkrebs-PDOs die variable Tumormikroumgebung und den genetischen Hintergrund nach, die typischerweise bei Eierstockkrebs beobachtet werden. Hier wird eine Methode beschrieben, mit der konventionelle und neuartige Medikamente an PDOs getestet werden können, die aus Eierstockkrebsgewebe und Aszites gewonnen werden. Ein Lumineszenz-basierter Adenosintriphosphat (ATP)-Assay wird verwendet, um die Lebensfähigkeit, die Wachstumsrate und die Arzneimittelempfindlichkeit zu messen. Drogenscreenings bei PDOs können in 7-10 Tagen abgeschlossen werden, abhängig von der Rate der Organoidbildung und der medikamentösen Behandlung.

Einleitung

Obwohl selten, ist Eierstockkrebs eine der tödlichsten gynäkologischen Krebsarten 1,2. Eine Herausforderung bei der Entwicklung neuer Therapien besteht darin, dass Eierstockkrebs heterogen ist und die Mikroumgebung des Tumors von Patientin zu Patientin sehr unterschiedlich ist. Darüber hinaus entwickeln viele Eierstockkrebserkrankungen eine Resistenz gegen platinbasierte Chemotherapie und Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase-Inhibitoren, was die Notwendigkeit größerer therapeutischer Optionen unterstreicht 3,4,5.

Ein Ansatz, der bei der Identifizierung neuer Therapeutika nützlich sein kann, ist die Verwendung von patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs). Organoide sind dreidimensionale Cluster aus mehreren Zelltypen, die sich selbst organisieren und in vitro "Mini-Organe" bilden6,7,8,9,10. Organoide können wichtige Gewebemorphologie- und Genexpressionsprofile rekapitulieren11,12. Einige der ersten Organoide wurden aus Darm-, Magen- und Darmkrebszellen von Mäusen und Menschen gewonnen 8,9,13. Langlebige Organoidkulturen wurden aus einer Vielzahl von gutartigen und bösartigen Geweben hergestellt, darunter Blase, Dickdarm, Magen, Bauchspeicheldrüse, Gehirn, Netzhaut und Leber 14,15,16. Wir haben bereits Methoden zur Etablierung von PDOs aus Ovarialkarzinomtumoren und Aszitesproben demonstriert17. PDOs können verwendet werden, um molekulare Eigenschaften, zelluläre Mechanismen und neuartige medikamentöse Behandlungen zu untersuchen 18,19,20. PDOs haben mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen zweidimensionalen Primärzellkulturen für das Wirkstoff-Screening. Obwohl primäre zweidimensionale Kulturen eine kostengünstige Methode für Wirkstoff-Screenings sind, handelt es sich bei primären Zellkulturen um Einzelzelltypen, denen die dreidimensionale Architektur von Tumoren fehlt 21,22,23. Nichtsdestotrotz sind PDOs eine wertvolle Ressource, und es werden kostengünstige Protokolle benötigt, um ihren Einsatz im therapeutischen Wirkstoffscreening zu optimieren.

Dieser Artikel beschreibt eine In-vitro-Methode zur Verwendung von PDOs bei Eierstockkrebs, um die Wirkung bekannter oder in Frage kommender Medikamente zu testen. Während derzeitige Arzneimittelscreenings mit mittlerem und hohem Durchsatz unter Verwendung von PDOs teure automatisierte Dosierinstrumente erfordern 24,25,26, verwendet diese kostengünstige Methode leicht verfügbare grundlegende Labormaterialien und einen ATP-basierten Zellviabilitätsassay in einem Standard-96-Well-Plattenformat (Abbildung 1A). Diese Methode wird die vorläufige Erprobung neuartiger Medikamente gegen Eierstockkrebs erleichtern, bevor sie auf größere Bildschirme hochskaliert werden27,28. Obwohl hier PDOs für Eierstockkrebs verwendet werden, kann diese Methode auch auf andere Krebsorganoidmodelle angewendet werden.

Protokoll

Die Entnahme menschlicher Proben für diese Forschung wurde vom Washington University School of Medicine Institutional Review Board genehmigt. Alle in Frage kommenden Patientinnen über 18 Jahre hatten die Diagnose oder vermutete Diagnose eines hochgradigen serösen Ovarialkarzinoms und waren bereit und in der Lage, eine Einwilligung nach Aufklärung zu geben. Das Tumorgewebe von primären oder metastasierten Stellen sowie Aszites und Pleuraflüssigkeit wurde von Patienten gewonnen, die zum Zeitpunkt der Behandlung einwilligten.

1. Auswahl etablierter PDOs für Viabilitätstests

HINWEIS: In der Regel befinden sich diese Organoide innerhalb der ersten fünf Passagen. Wie bereits beschrieben, werden Eierstockkrebs-PDOs durch Resuspendierung der primären Zellsuspension in Basalmembranextrakt (BME) wie Cultrex oder Matrigel17 gebildet (siehe Materialtabelle).

  1. PDOs sollten eine wahrgenommene Verdopplungszeit von 24-72 h haben, um die beste Effizienz des Assays zu erzielen. Schätzen Sie die wahrgenommene Verdopplungszeit, indem Sie visuell bestimmen, wie viele Tage es dauert, bis sich Organoide nach dem Passieren/Plattieren bilden.
    HINWEIS: Unserer Erfahrung nach können Organoide, die länger als drei Tage brauchen, um sich zu bilden, nicht für diesen Wachstumshemmungsassay verwendet werden.
  2. Identifizieren Sie Arzneimittel und wählen Sie einen Bereich der zu testenden Konzentrationen aus (z. B. Carboplatin, 0-50 μM, siehe Materialtabelle).
  3. Bestimmen Sie den Plattenaufbau. Dieser Assay wird in dreifacher Ausführung durchgeführt, wodurch die Anzahl der Arzneimittel und Konzentrationen, die auf einer Platte getestet werden können, begrenzt wird.
    HINWEIS: Ausgewählte PDO-Linien müssen vor der Durchführung des Assays sorgfältig beobachtet werden. Etablierte Ovarialkarzinom-PDOs bilden mehrzellige feste und hohle Kugeln mit tumorartigen Knospenformen (Abbildung 1B). Die PDO-Morphologie, das genomische Profil usw. müssen vor der Durchführung des Assays (wenn möglich) mit der der Patientenprobe verglichen werden29-33. Ovarialkarzinom-PDOs können aus primären und metastasierten Tumorproben und Aszites erzeugt werden17.

2. Reagenzienvorbereitung für den Viabilitäts-Assay

  1. Basismedien: Zu fortgeschrittenem DMEM/F12 fügen Sie 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin, 1x Glutamax und 1 % (v/v) HEPES17 hinzu (siehe Materialtabelle).
  2. Vorbereitung von Advance Organoid Media für Eierstockkrebs-Organoide gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht17.

3. Beschichtung von Organoiden (~Tag -2)

HINWEIS: Dieser Schritt muss 1-3 Tage vor der Zugabe der Medikamente durchgeführt werden. Bevor Sie beginnen, erwärmen Sie alle Reagenzien (Basismedien, fortgeschrittene organoide Medien und organoide Dissoziationsreagenz; siehe Materialtabelle) in einem Wasserbad auf 37 °C. BME im Eiswasserbad auftauen.

  1. Verwenden Sie ein Hellfeldmikroskop, um zu bestätigen, ob die interessierenden Organoide zu 70 % bis 90 % konfluent sind.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, Bilder der Organoide zum späteren Nachschlagen zu speichern.
  2. Geben Sie 1-2 ml erwärmtes Basismedium in die Vertiefung, die Organoide enthält, und pipettieren Sie sie auf und ab, um die BME-haltigen Organoide mechanisch zu dissoziieren. Die gesamte Lösung wird in ein konisches 15-ml-Röhrchen17 überführt.
    HINWEIS: In der Regel reichen 1-2 ml Medien aus, um den BME richtig zu verdünnen. Organoide desselben Patienten und derselben Passage können kombiniert werden.
  3. 5-10 s vortexieren, um die Zellen weiter zu dissoziieren, und bei 1107 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren.
  4. Entfernen Sie den Überstand mit einer Einkanalpipette und entsorgen Sie ihn. Organoide in 1 ml Organoid-Dissoziationsreagenz resuspendieren (siehe Materialtabelle) und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. 7 min bei 37 °C inkubieren.
    1. Wenn das Pellet aufgrund des verbleibenden BME immer noch gallertartig ist, fügen Sie zusätzlich 1 ml Basismedium hinzu, wirbeln Sie 5-10 s lang vor und wiederholen Sie die Zentrifugation.
  5. Bei 1107 x g für 5 min bei RT zentrifugieren. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Basismedium.
  6. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in jeder PDO-Kultur mit einem automatischen Zellzähler (siehe Materialtabelle) oder einem Hämozytometer.
  7. Resuspendieren Sie Zellen bei 20.000 Zellen pro 10 μl mit 25 % Basismedien und 75 % BME. Tun Sie dies, indem Sie die Organoide im Medium resuspendieren und mit BME mischen.
  8. Platte mit 3 μl Tröpfchen resuspendierter BME + PDO-Zellen in eine Vertiefung einer schwarzen, undurchsichtigen 96-Well-Platte (siehe Materialtabelle). Platzieren Sie die Tröpfchen in der Mitte jeder Vertiefung. Jede Wirkstoffkonzentration in dreifacher Ausführung auftragen.
    HINWEIS: Da der Zellviabilitätstest auf Lumineszenz basiert, ist es am besten, schwarze, undurchsichtige Platten zu verwenden, um einen Hintergrund zu vermeiden. Transparente Platten können verwendet werden, um Organoide während des Assays sichtbar zu machen, aber die Unterseite der Platten sollte vor der Messung der Lumineszenz mit undurchsichtigem Klebeband abgedeckt werden.
  9. Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C für 15 Minuten.
  10. Geben Sie 100 μl Advance Organoid Media in jede Vertiefung. Platte für 24-72 h inkubieren (bestimmen Sie entsprechend der wahrgenommenen PDO-Verdopplungszeit). Geben Sie 100 μl Advance Organoid Media in eine leere Vertiefung, um sie als Leergut zu verwenden.
    HINWEIS: Das Ziel ist es, die Bildung von Organoiden zu ermöglichen.
  11. Optional: Für die Analyse der Wachstumsrate werden zusätzliche dreifache PDOs in einer separaten Platte aufgetragen. Dies wird verwendet, um Zellen zum Zeitpunkt = 0 zu zählen, und sollte am Tag 0 mit dem in Abschnitt 5 beschriebenen Viabilitätstest untersucht werden.

4. Zugabe von Medikamenten für den Viabilitätstest an Tag 0

HINWEIS: Tag 0 bezieht sich auf den Tag, an dem die Medikamente zu den vollständig gebildeten Organoiden hinzugefügt werden.

  1. Verdünnen Sie ausgewählte Arzneimittel in Advance Organoid Media auf die gewünschten Konzentrationen. Verdünnungen können in 1,5-ml-Röhrchen oder in einer voreingestellten 96-Well-Platte vorgenommen werden, was die Verwendung einer Mehrkanalpipette zur Dosierung des Mediums ermöglicht.
    HINWEIS: Arzneimittel müssen in dem vom Hersteller empfohlenen Lösungsmittel, wie z. B. Dimethylsulfoxid, resuspendiert werden. Für diese Studie wurden die folgenden Verdünnungen von Carboplatin in Advance Organoid Media durchgeführt: 1, 5, 10, 25, 50 und 75 μM.
  2. Entnehmen Sie Medien aus jeder Vertiefung mit einer Ein- oder Mehrkanalpipette und achten Sie darauf, das PDO/BME-Tröpfchen nicht zu berühren oder zu stören.
  3. Geben Sie 100 μl Advance Organoid Media und die gewünschten Medikamente in jede Vertiefung. Stellen Sie sicher, dass Sie frische Medien in die drei Kontrollvertiefungen geben.
    HINWEIS: Die Arzneimittelkonzentrationen variieren und hängen von der wissenschaftlichen Fragestellung und dem Wirkmechanismus des Arzneimittels ab. Bei der Entscheidung, welche Konzentrationen verwendet werden sollen, beginnen wir mit zuvor etablierten Wirkstoffkonzentrationen in vergleichbaren 2D-Zelllinien (z. B. immortalisierten Eierstockkrebs-Zelllinien). Die Konzentrationen müssen möglicherweise erhöht werden, wenn keine Wirkung auf Organoide beobachtet wird.
  4. Aktualisieren Sie Medien und Medikamente nach Bedarf (wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.3). Ob das Medium aufgefrischt werden muss, hängt von der Länge des Assays, der biologischen Aktivität des Arzneimittels und der Halbwertszeit des Arzneimittels ab. Bei Assays, die länger als eine Woche dauern, müssen die Medien mindestens einmal aufgefrischt werden.

5. Beendigung des Viabilitäts-Assays für die Auslesung (~Tag 7)

HINWEIS: Dieser Schritt kann an den Tagen 7 bis 10 durchgeführt werden. Die Assay-Länge muss entsprechend der Halbwertszeit und der Pharmakodynamik der zu testenden Arzneimittel bestimmt werden.

  1. Lassen Sie die Viabilitäts-Assay-Reagenzien im Dunkeln Raumtemperatur erreichen. Lagern Sie die Reagenzien über Nacht bei 4 °C (im Dunkeln), um die Auftauzeit zu verkürzen.
  2. Nehmen Sie die Assay-Platte aus dem Zellkultur-Inkubator und lassen Sie sie 30 Minuten lang auf Raumtemperatur akklimatisieren. Die Platte muss sich im Dunkeln nicht akklimatisieren.
  3. Geben Sie 100 μl Viabilitäts-Assay-Reagenz (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung (für ein Gesamtvolumen von 200 μl) und legen Sie es für 5 Minuten (80 U/min) auf einen Plattenschüttler. Nehmen Sie die Platte aus dem Shaker und inkubieren Sie weitere 25 Minuten bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Platte immer vor Licht geschützt ist, indem Sie sie mit Folie oder einer undurchsichtigen Box abdecken.
  4. Schalten Sie den Biolumineszenzplattenleser ein und öffnen Sie die i-control-Software (siehe Materialtabelle).
  5. Wählen Sie unter Verbinden mit: Gerätename die Option unendlich 200Pro aus.
  6. Wählen Sie Lumineszenz und Standardskript aus.
  7. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü den Plattentyp [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black aus.
  8. Bestimmen Sie, welche Vertiefungen gelesen werden sollen, und markieren Sie die entsprechenden Vertiefungen unter Teil der Platte.
  9. Ziehen Sie unter Messungen auf der linken Seite des Bildschirms Lumineszenz per Drag & Drop unter den Teil der Platte.
  10. Wählen Sie die Lumineszenzparameter: Dämpfung: KEINE; Integrationszeit: 1000 ms; Einschwingzeit: 0 ms.
  11. Entfernen Sie die Abdeckung von der Platte und legen Sie sie in den Plattenleser ein. Drücken Sie Start , um zu beginnen.
  12. Exportieren Sie nach Abschluss des Vorgangs Daten und speichern Sie sie.

6. Datenanalyse

  1. Berechnen Sie die prozentuale Viabilität der Zelle.
    1. Subtrahieren Sie den "Leerwert" von jeder Vertiefung, um die leerkorrigierten Messwerte zu erhalten. Berechnen Sie als Nächstes den Kontrolldurchschnitt, indem Sie den Durchschnitt der drei Kontrollvertiefungen bilden.
    2. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um den Prozentsatz der lebensfähigen Zellen in jeder Vertiefung zu berechnen: (Experimentelle Vertiefung / Kontrolldurchschnitt) x 100
    3. Stellen Sie die resultierenden Daten in der Analysesoftware grafisch dar (siehe Materialtabelle).
  2. Untersuchen Sie die Metriken der Wachstumsrate (GR).
    1. Berechnen Sie die GR-Metriken manuell gemäß dem veröffentlichten Bericht34.
    2. Alternativ können Sie den Online-WE-Rechner (siehe Materialtabelle) verwenden, um die Metriken35 zu generieren. Verwenden Sie die Tag-0-Messungen als "cell_count_time0", die die Wachstumsrate der unbehandelten PDOs widerspiegeln.
    3. Exportieren Sie Daten und Grafiken.

Ergebnisse

Diese Ergebnisse verdeutlichen das Ansprechen von zwei PDOs auf das Chemotherapeutikum Carboplatin, das zur Behandlung von Eierstockkrebs eingesetzt wird. Die Organoide wurden aus der Tumorbiopsie (PDO #1) und aus Aszites (PDO #2) gewonnen. Diese Organoide wurden auf der Grundlage ihrer wahrgenommenen Verdopplungszeit (1-2 Tage) und ihres morphologischen Aussehens (Bildung vieler großer Organoide) ausgewählt. Sowohl PDO #1 als auch PDO #2 wurden an Tag -2, bei Passage zwei, plattiert, und Carboplatin wurde an Tag 0 hin...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, mit der die therapeutischen Wirkungen konventioneller oder neuartiger Medikamente auf Eierstockkrebs-PDOs beurteilt werden können. Forscher müssen mehrere Aspekte berücksichtigen, bevor sie den Viabilitätstest im PDO-Modell durchführen.

Zunächst muss man bei der Auswahl eines PDO, das im Viabilitätsassay verwendet werden soll, den idealen Organoidtyp (Tumor vs. Aszites) und die Passagenzahl für seine Bedürfnisse bestimmen. Unserer Erfah...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die in dieser Veröffentlichung vorgestellten Forschungsergebnisse wurden vom National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Preisnummer R01CA243511 unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Die Autoren danken Deborah Frank für ihre redaktionellen Kommentare.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Plastic Tubes
15 mL Plastic Tubes
96 well Flat Black PlatesMidSci781968
Advance Organoid Media see Graham et al 2022 (Jove)
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher12634028
Automated Cell CounterThermo FisherAMQAX1000
Brightfield Microscope
Carboplatin Teva Pharmaceuticals USANDC 00703-4246-01
CellTiter-Glo 3D Viability PromegaG9681
CultrexR & D Systems3533-010-02
DMSOSigma AldrichD2650-100ML
GlutamaxLife Technologies35050061
GR Calculator http://www.grcalculator.orgOnline calculator
GraphPad PrismGraphPad Software, Inc.
HEPESLife Technologies15630080
MatrigelCorning354230
Microsoft ExcelMicrosoft
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher15140122
Plate Rocker
Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips
Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes
Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control SoftwareTecan
TrypLEThermo Fisher12605010Organoid dissociation reagent

Referenzen

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