JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем протокол, который может быть использован для проведения терапевтического тестирования лекарственных препаратов с органоидами рака яичников, полученными от пациенток.

Аннотация

Рак яичников является смертельным гинекологическим раком и пятой по значимости причиной смерти от рака среди женщин в Соединенных Штатах. Разработка новых лекарственных препаратов имеет решающее значение для развития здравоохранения и улучшения результатов лечения пациентов. Органоиды – это трехмерные многоклеточные миниатюрные органы, созданные in vitro. Органоидные модели рака яичников, полученные от пациента, могут быть оптимальными для медикаментозного скрининга, поскольку они более точно повторяют интересующие ткани, чем двумерные модели клеточных культур, и стоят недорого по сравнению с ксенотрансплантатами, полученными от пациента. Кроме того, PDO при раке яичников имитируют вариабельное опухолевое микроокружение и генетический фон, обычно наблюдаемые при раке яичников. Здесь описан метод, который может быть использован для тестирования традиционных и новых лекарств на ЗОП, полученных из ткани рака яичников и асцита. Люминесцентный анализ аденозинтрифосфата (АТФ) используется для измерения жизнеспособности, скорости роста и чувствительности к лекарственным препаратам. Скрининг на наркотики в ЗОП может быть завершен в течение 7-10 дней, в зависимости от скорости образования органоидов и медикаментозного лечения.

Введение

Несмотря на то, что рак яичников встречается редко, он является одним из самых смертоносных гинекологических онкологических заболеваний 1,2. Сложность в разработке новых методов лечения заключается в том, что рак яичников неоднороден, и микроокружение опухоли сильно различается у разных пациенток. Кроме того, у многих видов рака яичников развивается резистентность к химиотерапии на основе платины и ингибиторам поли(АДФ-рибозы) полимеразы, что подчеркивает необходимость расширения терапевтических возможностей 3,4,5.

Одним из подходов, который может быть полезен при выявлении новых терапевтических средств, является использование органоидов, полученных от пациентов (PDO). Органоиды представляют собой трехмерные кластеры нескольких типов клеток, которые самоорганизуются и образуют in vitro «мини-органы»6,7,8,9,10. Органоиды могут повторять важные профили морфологии тканей и экспрессии генов11,12. Некоторые из первых органоидов были получены из клеток рака кишечника, желудка и толстой кишки как мышей, так и людей 8,9,13. Установлены долгоживущие органоидные культуры из широкого спектра доброкачественных и злокачественных тканей, включая мочевой пузырь, толстую кишку, желудок, поджелудочную железу, головной мозг, сетчатку и печень 14,15,16. Ранее мы продемонстрировали методы установления ЗОП по образцам опухолей рака яичников и асцита17. PDO могут быть использованы для изучения молекулярных характеристик, клеточных механизмов и новых лекарственных препаратов 18,19,20. PDO имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными двумерными первичными клеточными культурами для скрининга лекарственных препаратов. Несмотря на то, что первичные двумерные культуры являются недорогим методом скрининга лекарственных препаратов, первичные клеточные культуры относятся к одноклеточным типам и не имеют трехмерной архитектуры опухолей 21,22,23. Тем не менее, ЗОП являются ценным ресурсом, и для оптимизации их использования в терапевтическом скрининге лекарственных средств необходимы экономически эффективные протоколы.

В этой статье описывается метод in vitro с использованием PDO при раке яичников для проверки эффектов известных или потенциальных препаратов. В то время как в настоящее время для скрининга лекарств со средней и высокой пропускной способностью с использованием PDO требуются дорогостоящие автоматизированные дозирующие приборы 24,25,26, этот экономически эффективный метод использует легкодоступные основные лабораторные материалы и анализ жизнеспособности клеток на основе АТФ в стандартном формате 96-луночного планшета (рис. 1A). Этот метод облегчит предварительные испытания новых препаратов для лечения рака яичников перед масштабированием до более крупных экранов27,28. Несмотря на то, что здесь используются PDO при раке яичников, этот метод может быть применен и к другим моделям органоидов рака.

протокол

Коллекция образцов человека для этого исследования была одобрена Институциональным наблюдательным советом Медицинской школы Вашингтонского университета. Все пациентки в возрасте старше 18 лет, отвечающие критериям отбора, имели диагноз или предположительно диагноз серозного рака яичников высокой степени злокачественности и были готовы и могли предоставить информированное согласие. Опухолевая ткань из первичных или метастатических локализаций, в дополнение к асциту и плевральной жидкости, была получена от пациентов, давших согласие на лечение.

1. Выбор установленных PDO для анализа жизнеспособности

ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, эти органоиды находятся в пределах первых пяти проходов. Как было описано ранее, PDO при раке яичников образуются путем ресуспендирования первичной клеточной суспензии в экстракте базальной мембраны (BME), таком как Cultrex или Matrigel17 (см. таблицу материалов).

  1. Для достижения наилучшей эффективности анализа ЗОП должны иметь воспринимаемое время удвоения 24-72 ч. Оцените предполагаемое время удвоения, визуально определив количество дней, необходимых органоидам для образования после пассажа/покрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, органоиды, которые формируются дольше трех дней, не могут быть использованы для этого анализа ингибирования роста.
  2. Определите лекарственные препараты и выберите диапазон концентраций для тестирования (например, карбоплатин, 0-50 мкМ, см. Таблицу материалов).
  3. Определите настройку пластины. Этот анализ будет проводиться в трех экземплярах, что ограничивает количество лекарств и концентраций, которые могут быть протестированы на одной планшете.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением анализа необходимо тщательно наблюдать за выбранными линиями PDO. Установленные PDO рака яичников образуют многоклеточные твердые и полые сферы с опухолевидными почковающимися формами (рис. 1B). Морфология PDO, геномный профиль и т.д. должны быть сравнены с таковыми образца пациента (когда это возможно) перед проведением анализа29-33. ЗОП при раке яичников могут быть получены из образцов первичных и метастатических опухолей и асцита17.

2. Подготовка реагента для определения жизнеспособности

  1. Основная среда: К расширенному DMEM/F12 добавьте 1% (v/v) пенициллина-стрептомицина, 1x глутамакс и 1% (v/v)HEPES17 (см. таблицу материалов).
  2. Подготовьте предварительную органоидную среду для органоидов рака яичников в соответствии с ранее опубликованным отчетом17.

3. Покрытие органоидов (~День -2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен за 1-3 дня до добавления препаратов. Перед началом работы нагрейте все реагенты (базовую среду, передовую органоидную среду и реагент органоидной диссоциации; см. таблицу материалов) до 37 °C на водяной бане. Разморозьте БМЭ на водяной бане с ледяной водой.

  1. Используйте светлопольный микроскоп, чтобы убедиться, что интересующие органоиды сливаются на 70%-90%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сохранять изображения органоидов для дальнейшего использования.
  2. Добавьте 1-2 мл подогретой основной среды в лунку, содержащую органоиды, и пипетку вверх и вниз, чтобы механически диссоциировать органоиды, содержащие BME. Перелейте весь раствор в коническую пробирку17 объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 1-2 мл среды достаточно для правильного разбавления BME. Органоиды одного и того же пациента и пассажа могут быть объединены.
  3. Вихрь в течение 5-10 с для дальнейшей диссоциации клеток и центрифуга при 1107 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
  4. Удалите надосадочную жидкость с помощью одноканальной пипетки и выбросьте. Ресуспендировать органоиды в реагенте для диссоциации органоидов объемом 1 мл (см. таблицу материалов) и переложить в пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Выдерживать 7 мин при температуре 37 °C.
    1. Если гранула все еще желеобразна из-за оставшегося BME, добавьте дополнительно 1 мл основной среды, перемешайте в течение 5-10 секунд и повторите центрифугирование.
  5. Центрифуга при 1107 x g в течение 5 мин при RT. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл основной среды.
  6. Подсчитайте количество клеток в каждой культуре PDO с помощью автоматического счетчика клеток (см. Таблицу материалов) или гемоцитометра.
  7. Ресуспендирование ячеек при 20 000 клеток на 10 мкл 25% основной среды и 75% BME. Для этого органоиды в среде ресуспендируют и смешивают с БМЭ.
  8. Поместите капли 3 мкл ресуспендированных клеток BME + PDO в одну лунку черной непрозрачной 96-луночной пластины (см. таблицу материалов). Поместите капли в центр каждой лунки. Напечатайте концентрацию каждого препарата в трех экземплярах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку анализ жизнеспособности клеток основан на люминесценции, лучше всего использовать черные непрозрачные пластины, чтобы избежать фона. Прозрачные планшеты можно использовать для визуализации органоидов во время анализа, но дно планшетов должно быть закрыто непрозрачной лентой перед измерением люминесценции.
  9. Инкубируйте планшет в инкубаторе клеточных культур при 37 °C в течение 15 мин.
  10. Добавьте 100 мкл Advance Organoid Media в каждую лунку. Инкубируйте планшет в течение 24-72 ч (определяйте в соответствии с предполагаемым временем удвоения PDO). Добавьте 100 мкл Advance Organoid Media в пустую лунку для использования в качестве заготовки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы позволить органоидам сформироваться.
  11. Опционально: Для анализа скорости роста поместите дополнительные тройные PDO в отдельную пластину. Он будет использоваться для подсчета клеток в момент Time = 0 и должен быть проанализирован в день 0 с помощью анализа жизнеспособности, описанного в разделе 5.

4. Добавление препаратов для определения жизнеспособности на 0-й день

ПРИМЕЧАНИЕ: День 0 относится к дню, когда препараты добавляются к полностью сформированным органоидам.

  1. Разбавьте выбранные лекарственные средства в среде Advance Organoid до желаемых концентраций. Разведение может производиться в пробирках объемом 1,5 мл или в предварительно настроенной 96-луночной планшете, что позволяет использовать многоканальную пипетку для дозирования среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лекарственные препараты должны быть ресуспендированы в растворителе, рекомендованном производителем, например, в диметилсульфоксиде. Для этого исследования были сделаны следующие разведения карбоплатина в Advance Organoid Media: 1, 5, 10, 25, 50 и 75 мкМ.
  2. Удаляйте среду из каждой лунки с помощью одноканальной или многоканальной пипетки, стараясь не прикасаться к капле PDO/BME и не беспокоить ее.
  3. Добавьте в каждую лунку 100 мкл Advance Organoid Media и желаемый препарат(ы). Обязательно добавьте свежую среду в три контрольных лунки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация препарата будет варьироваться и зависеть от научного вопроса и механизма действия препарата. При принятии решения о том, какие концентрации использовать, мы начинаем с ранее установленных концентраций лекарств в сопоставимых 2D-клеточных линиях (например, иммортализированных клеточных линиях рака яичников). Возможно, потребуется увеличить концентрацию, если не наблюдается влияния на органоиды.
  4. При необходимости обновляйте носители и лекарства (повторите шаги 4.1-4.3). Необходимость обновления среды зависит от продолжительности анализа, биологической активности препарата и периода полувыведения препарата. Для анализов продолжительностью более одной недели носитель необходимо обновить по крайней мере один раз.

5. Окончание анализа жизнеспособности для считывания (~День 7)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно выполнить на 7-10 день. Продолжительность анализа должна определяться в соответствии с периодом полувыведения и фармакодинамикой тестируемых препаратов.

  1. Дайте реагентам для анализа жизнеспособности нагреться до комнатной температуры в темноте. Храните реагенты при температуре 4 °C в течение ночи (в темноте), чтобы сократить время оттаивания.
  2. Извлеките планшет из инкубатора для клеточных культур и дайте ему акклиматизироваться до комнатной температуры в течение 30 минут. Пластине не придется акклиматизироваться в темноте.
  3. Добавьте 100 мкл реагента для анализа жизнеспособности (см. таблицу материалов) в каждую лунку (для общего объема 200 мкл) и поместите на шейкер на 5 минут (80 об/мин). Выньте тарелку из шейкера и инкубируйте еще 25 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что тарелка всегда защищена от света, накрыв ее фольгой или непрозрачной коробкой.
  4. Включите считыватель биолюминесцентных пластин и откройте программное обеспечение i-control (см. Таблицу материалов).
  5. В разделе Connect to: Instrument Name (Подключиться к: Имя инструмента) выберите infinite 200Pro.
  6. Выберите «Люминесценция» и «Сценарий по умолчанию».
  7. В раскрывающемся меню выберите тип пластины [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black.
  8. Определите, какие лунки нужно считывать, и выделите соответствующие лунки в разделе Часть пластины.
  9. В разделе «Измерения» в левой части экрана перетащите «Люминесценцию » под «Деталь пластины».
  10. Выберите параметры люминесценции: Затухание: НЕТ; Время интегрирования: 1000 мс; Время установления: 0 мс.
  11. Снимите крышку с пластины и загрузите ее в считывающее устройство. Нажмите кнопку Старт , чтобы начать.
  12. По завершении экспортируйте данные и сохраните.

6. Анализ данных

  1. Рассчитайте процент жизнеспособности клеток.
    1. Вычтите «Бланк» из каждой лунки для показаний Blank Corrected. Затем рассчитайте контрольное среднее путем усреднения трех контрольных скважин.
    2. Используйте следующее уравнение для расчета процента жизнеспособных клеток в каждой скважине: (Экспериментальная скважина / Контрольное среднее) x 100
    3. Постройте график полученных данных в аналитическом программном обеспечении (см. Таблицу материалов).
  2. Изучите метрики Growth Rate (GR).
    1. Вручную рассчитать показатели GR в соответствии с опубликованным отчетом34.
    2. В качестве альтернативы можно использовать онлайн-калькулятор GR (см. Таблицу материалов) для формирования метрики35. Используйте измерения 0-го дня в качестве «cell_count_time0», которые отражают скорость роста необработанных PDO.
    3. Экспорт данных и графиков.

Результаты

Эти результаты иллюстрируют реакцию двух PDO на химиотерапевтический препарат карбоплатин, который используется для лечения рака яичников. Органоиды были получены из биопсии опухоли (PDO #1) и асцита (PDO #2). Эти органоиды были отобраны на основе их воспринимаемого времени удвоения (1-2 дня) и ...

Обсуждение

В данной статье описан метод, который может быть использован для оценки терапевтических эффектов традиционных или новых препаратов при раке яичников. Исследователи должны рассмотреть несколько вопросов, прежде чем проводить анализ жизнеспособности в модели PDO.

Во-перв?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано Национальным институтом рака Национальных институтов здравоохранения под номером R01CA243511. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Авторы благодарят Дебору Франк за ее редакционные комментарии.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Plastic Tubes
15 mL Plastic Tubes
96 well Flat Black PlatesMidSci781968
Advance Organoid Media see Graham et al 2022 (Jove)
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher12634028
Automated Cell CounterThermo FisherAMQAX1000
Brightfield Microscope
Carboplatin Teva Pharmaceuticals USANDC 00703-4246-01
CellTiter-Glo 3D Viability PromegaG9681
CultrexR & D Systems3533-010-02
DMSOSigma AldrichD2650-100ML
GlutamaxLife Technologies35050061
GR Calculator http://www.grcalculator.orgOnline calculator
GraphPad PrismGraphPad Software, Inc.
HEPESLife Technologies15630080
MatrigelCorning354230
Microsoft ExcelMicrosoft
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher15140122
Plate Rocker
Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips
Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes
Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control SoftwareTecan
TrypLEThermo Fisher12605010Organoid dissociation reagent

Ссылки

  1. Matulonis, U. A., Sood, A. K., Fallowfield, L., Howitt, B. E., Sehouli, J. m., Karlan, B. Y. Ovarian cancer. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16061 (2016).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  3. Christie, E. L., Bowtell, D. D. L. Acquired chemotherapy resistance in ovarian cancer. Annals of Oncology. 28 (suppl_8), viii13-viii15 (2017).
  4. Wang, L., Wang, Q., Xu, Y., Cui, M., Han, L. Advances in the treatment of ovarian cancer using PARP inhibitors and the underlying mechanism of resistance. Current Drug Targets. 21 (2), 167-178 (2020).
  5. Wang, Q., Peng, H., Qi, X., Wu, M., Zhao, X. Targeted therapies in gynecological cancers: a comprehensive review of clinical evidence. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 137 (2020).
  6. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).
  7. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  8. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  11. Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: Tools for understanding biology and treating diseases. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 211-234 (2020).
  12. Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
  13. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  14. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
  15. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  16. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  17. Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 191, e64878 (2023).
  18. Liu, C., Qin, T., Huang, Y., Li, Y., Chen, G., Sun, C. Drug screening model meets cancer organoid technology. Translational Oncology. 13 (11), 100840 (2020).
  19. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  20. Zhou, Z., Cong, L., Cong, X. Patient-derived organoids in precision medicine: drug screening, organoid-on-a-chip and living organoid biobank. Frontiers in Oncology. 11, 762184 (2021).
  21. Costa, E. C., Moreira, A. F., de Melo-Diogo, D., Gaspar, V. M., Carvalho, M. P., Correia, I. J. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  22. Foo, M. A., et al. Clinical translation of patient-derived tumour organoids- bottlenecks and strategies. Biomarker Research. 10 (1), 10 (2022).
  23. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  24. Bergdorf, K., et al. High-throughput drug screening of fine-needle aspiration-derived cancer organoids. STAR Protocols. 1 (3), 100212 (2020).
  25. Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Communications Biology. 2 (1), 78 (2019).
  26. Putker, M., et al. Medium-throughput drug- and radiotherapy screening assay using patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 170, e62495 (2021).
  27. Dahlin, J. L., Inglese, J., Walters, M. A. Mitigating risk in academic preclinical drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 279-294 (2015).
  28. Honkala, A., Malhotra, S. V., Kummar, S., Junttila, M. R. Harnessing the predictive power of preclinical models for oncology drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (2), 99-114 (2022).
  29. de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Reports. 31 (11), 107762 (2020).
  30. Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
  31. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  32. Maenhoudt, N., Vankelecom, H. Protocol for establishing organoids from human ovarian cancer biopsies. STAR Protocols. 2 (2), 100429 (2021).
  33. Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10 (1), 12581 (2020).
  34. Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
  35. Clark, N. A., et al. GRcalculator: an online tool for calculating and mining dose-response data. BMC Cancer. 17 (1), 698 (2017).
  36. Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Developmental Cell. 58 (12), 1106.e7-1121.e7 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

In vitroPDO

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены