Modèles organoïdes dérivés de patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire pour les tests précliniques de médicaments

Résumé

Nous présentons un protocole qui peut être utilisé pour effectuer des tests thérapeutiques de médicaments avec des organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patientes.

Résumé

Le cancer de l’ovaire est un cancer gynécologique mortel et la cinquième cause de décès par cancer chez les femmes aux États-Unis. La mise au point de nouveaux traitements médicamenteux est cruciale pour faire progresser les soins de santé et améliorer les résultats pour les patients. Les organoïdes sont des organes miniatures multicellulaires tridimensionnels in vitro. Les modèles organoïdes dérivés de patientes (ODP) du cancer de l’ovaire peuvent être optimaux pour le dépistage de médicaments, car ils récapitulent avec plus de précision les tissus d’intérêt que les modèles de culture cellulaire bidimensionnelle et sont peu coûteux par rapport aux xénogreffes dérivées de patientes. De plus, les AOP du cancer de l’ovaire imitent le microenvironnement tumoral variable et le fond génétique généralement observés dans le cancer de l’ovaire. Ici, une méthode est décrite qui peut être utilisée pour tester des médicaments conventionnels et nouveaux sur des PDO dérivés de tissus cancéreux de l’ovaire et de l’ascite. Un test d’adénosine triphosphate (ATP) basé sur la luminescence est utilisé pour mesurer la viabilité, le taux de croissance et la sensibilité aux médicaments. Les dépistages de drogues dans les AOP peuvent être effectués en 7 à 10 jours, selon le taux de formation d’organoïdes et les traitements médicamenteux.

Introduction

Bien que rare, le cancer de l’ovaire est l’un des cancers gynécologiques les plus mortels ^1,2. L’un des défis du développement de nouveaux traitements est que le cancer de l’ovaire est hétérogène et que le microenvironnement tumoral diffère considérablement d’une patiente à l’autre. De plus, de nombreux cancers de l’ovaire développent une résistance à la chimiothérapie à base de platine et aux inhibiteurs de la polypolymérase (ADP-ribose), ce qui souligne la nécessité de disposer de plus grandes options thérapeutiques ^3,4,5.

Une approche qui peut être utile pour identifier de nouvelles thérapies est l’utilisation d’organoïdes dérivés du patient (PDO). Les organoïdes sont des amas tridimensionnels de plusieurs types de cellules qui s’auto-organisent et forment in vitro des « mini-organes »6,7,8,9,10. Les organoïdes peuvent récapituler la morphologie tissulaire et les profils d’expression génique importants^11,12. Certains des premiers organoïdes ont été dérivés de cellules cancéreuses intestinales, gastriques et du côlon provenant de souris et d’humains ^8,9,13. Des cultures d’organoïdes à longue durée de vie ont été établies à partir d’un large éventail de tissus bénins et malins, notamment la vessie, le côlon, l’estomac, le pancréas, le cerveau, la rétine et le foie 14,15,16. Nous avons précédemment démontré des méthodes pour établir des PDO à partir d’échantillons de tumeurs cancéreuses de l’ovaire et d’ascite¹⁷. Les PDO peuvent être utilisées pour étudier les caractéristiques moléculaires, les mécanismes cellulaires et les nouveaux traitements médicamenteux 18,19,20. Les AOP présentent plusieurs avantages par rapport aux cultures cellulaires primaires bidimensionnelles traditionnelles pour le criblage de médicaments. Bien que les cultures primaires bidimensionnelles soient une méthode peu coûteuse pour les criblages de médicaments, les cultures cellulaires primaires sont des types unicellulaires et n’ont pas l’architecture tridimensionnelle des tumeurs 21,22,23. Néanmoins, les AOP sont une ressource précieuse, et des protocoles rentables sont nécessaires pour optimiser leur utilisation dans le criblage de médicaments thérapeutiques.

Cet article décrit une méthode in vitro permettant d’utiliser des PDO pour le cancer de l’ovaire afin de tester les effets de médicaments connus ou candidats. Alors que les dépistages de médicaments à moyen et à haut débit à moyen et à haut débit à l’aide d’AOP nécessitent des instruments de distribution automatisés coûteux 24,25,26, cette méthode rentable utilise des fournitures de laboratoire de base facilement disponibles et un test de viabilité cellulaire à base d’ATP dans un format standard de plaque à 96 puits (Figure 1A). Cette méthode facilitera les essais préliminaires de nouveaux médicaments contre le cancer de l’ovaire avant leur mise à l’échelle à des écrans plus grands^27,28. Bien que les PDO du cancer de l’ovaire soient utilisés ici, cette méthode peut être appliquée à d’autres modèles d’organoïdes cancéreux.

Protocole

La collecte de spécimens humains pour cette recherche a été approuvée par le Washington University School of Medicine Institutional Review Board. Toutes les patientes admissibles âgées de plus de 18 ans avaient reçu un diagnostic ou un diagnostic présumé de cancer de l’ovaire séreux de haut grade et étaient disposées et capables de donner leur consentement éclairé. Le tissu tumoral des sites primitifs ou métastatiques, en plus de l’ascite et du liquide pleural, a été obtenu à partir de patients consentants au moment des soins.

1. Sélection d’AOP établies pour l’essai de viabilité

REMARQUE : En règle générale, ces organoïdes se trouvent dans les cinq premiers passages. Comme décrit précédemment, les AOP du cancer de l’ovaire sont formées en remettant en suspension la suspension cellulaire primaire dans un extrait de membrane basale (BME) tel que Cultrex ou Matrigel¹⁷ (voir le tableau des matériaux).

1. Les AOP doivent avoir un temps de doublement perçu de 24 à 72 h pour une efficacité optimale de l’essai. Estimez le temps de doublement perçu en déterminant visuellement le nombre de jours qu’il faut pour que les organoïdes se forment après le passage ou le placage.
   REMARQUE : D’après notre expérience, les organoïdes qui prennent plus de trois jours à se former ne peuvent pas être utilisés pour ce test d’inhibition de la croissance.
2. Identifier les drogues et choisir une gamme de concentrations à tester (p. ex., carboplatine, 0 à 50 μM, voir le tableau des matériaux).
3. Déterminez la configuration de la plaque. Ce test sera effectué en trois exemplaires, ce qui limitera le nombre de médicaments et de concentrations pouvant être testés sur une plaque.
   REMARQUE : Les lignes PDO sélectionnées doivent être soigneusement observées avant d’effectuer le test. Les PDO établies pour le cancer de l’ovaire forment des sphères multicellulaires solides et creuses avec des formes bourgeonnantes ressemblant à des tumeurs (Figure 1B). La morphologie de l’AOP, le profil génomique, etc., doivent être comparés à ceux de l’échantillon du patient (si possible) avant d’effectuer le test^29-33. Les AOP du cancer de l’ovaire peuvent être générées à partir d’échantillons de tumeurs primaires et métastatiques et d’ascite¹⁷.

2. Préparation des réactifs pour le test de viabilité

1. Milieu de base : Pour le DMEM/F12 avancé, ajouter 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine, 1x glutamax et 1 % (v/v) HEPES¹⁷ (voir le tableau des matériaux).
2. Préparer les milieux organoïdes avancés pour les organoïdes du cancer de l’ovaire à la suite de la publication précédente^{du rapport 17}.

3. Placage d’organoïdes (~Jour -2)

REMARQUE : Cette étape doit être effectuée 1 à 3 jours avant l’ajout des médicaments. Avant de commencer, réchauffez tous les réactifs (milieu de base, milieu organoïde avancé et réactif de dissociation organoïde ; voir tableau des matériaux) à 37 °C dans un bain-marie. Décongeler le BME dans un bain d’eau glacée.

1. Utilisez un microscope à fond clair pour confirmer si les organoïdes d’intérêt sont confluents à 70 % à 90 %.
   REMARQUE : Il est recommandé d’enregistrer les images des organoïdes pour référence future.
2. Ajouter 1 à 2 mL de milieu de base réchauffé dans le puits contenant les organoïdes et pipeter de haut en bas pour dissocier mécaniquement les organoïdes contenant du BME. Transférer la solution entière dans un tube conique de 15 mL¹⁷.
   REMARQUE : En règle générale, 1 à 2 ml de média suffisent pour diluer correctement le BME. Les organoïdes d’un même patient et d’un même passage peuvent être combinés.
3. Vortex pendant 5 à 10 s pour dissocier davantage les cellules, et centrifuger à 1107 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).
4. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette monocanal et jetez-le. Remettre les organoïdes en suspension dans un réactif de dissociation organoïde de 1 mL (voir le tableau des matériaux) et les transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Incuber 7 min à 37 °C.
   1. Si la pastille est encore gélatineuse à cause de l’EMB restant, ajoutez 1 mL supplémentaire de média de base, un vortex pendant 5 à 10 s et répétez la centrifugation.
5. Centrifuger à 1107 x g pendant 5 min à RT. Retirer et jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de base.
6. Compter le nombre de cellules dans chaque culture d’AOP à l’aide d’un compteur automatique de cellules (voir le tableau des matériaux) ou d’un hémocytomètre.
7. Remettre les cellules en suspension à raison de 20 000 cellules par 10 μL de milieu de base à 25 % et de BME à 75 %. Pour ce faire, remettez les organoïdes en suspension dans le milieu et mélangez-les avec du BME.
8. Plaquer une gouttelette de 3 μL de cellules BME + PDO remises en suspension dans un puits d’une plaque noire opaque à 96 puits (voir le tableau des matériaux). Placez les gouttelettes au centre de chaque puits. Plaquer chaque concentration de médicament en trois exemplaires.
   REMARQUE : Étant donné que le test de viabilité cellulaire est basé sur la luminescence, il est préférable d’utiliser des plaques opaques noires pour éviter l’arrière-plan. Des plaques transparentes peuvent être utilisées pour visualiser les organoïdes pendant le test, mais le fond des plaques doit être recouvert de ruban opaque avant de mesurer la luminescence.
9. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 15 min.
10. Ajouter 100 μL de milieu organoïde avancé dans chaque puits. Incuber l’assiette pendant 24 à 72 h (déterminer en fonction du temps de doublement de l’AOP perçu). Ajouter 100 μL de milieu organoïde Advance dans un puits vide pour l’utiliser comme blanc.
    REMARQUE : L’objectif est de permettre aux organoïdes de se former.
11. Facultatif : Pour l’analyse du taux de croissance, plaquez des PDO triples supplémentaires dans une plaque séparée. Ceci sera utilisé pour compter les cellules à Temps = 0 et devrait être analysé le jour 0 à l’aide du test de viabilité décrit à la section 5.

4. Ajout de médicaments pour le test de viabilité au jour 0

REMARQUE : Le jour 0 fait référence au jour où les médicaments sont ajoutés aux organoïdes entièrement formés.

1. Diluer les médicaments sélectionnés dans le milieu organoïde Advance aux concentrations désirées. Les dilutions peuvent être effectuées dans des tubes de 1,5 ml ou dans une plaque préréglée à 96 puits, ce qui permettrait l’utilisation d’une pipette multicanaux pour distribuer le milieu.
   REMARQUE : Les médicaments doivent être remis en suspension dans le solvant suggéré par le fabricant, comme le diméthylsulfoxyde. Pour cette étude, les dilutions suivantes de carboplatine dans des milieux organoïdes avancés ont été effectuées : 1, 5, 10, 25, 50 et 75 μM.
2. Retirez le milieu de chaque puits à l’aide d’une pipette monocanal ou multicanal, en prenant soin de ne pas toucher ou déranger la gouttelette PDO/BME.
3. Ajouter 100 μL de milieu organoïde avancé et le(s) médicament(s) désiré(s) dans chaque puits. Assurez-vous d’ajouter des milieux frais dans les trois puits de contrôle.
   REMARQUE : Les concentrations de médicaments varient et dépendent de la question scientifique et du mécanisme d’action du médicament. Lorsque nous décidons des concentrations à utiliser, nous commençons par les concentrations de médicaments déjà établies dans des lignées cellulaires 2D comparables (par exemple, des lignées cellulaires de cancer de l’ovaire immortalisées). Il peut être nécessaire d’augmenter les concentrations s’il n’y a pas d’effet observé sur les organoïdes.
4. Actualisez les supports et les médicaments au besoin (répétez les étapes 4.1 à 4.3). La nécessité de rafraîchir le milieu dépend de la durée du test, de l’activité biologique du médicament et de sa demi-vie. Pour les essais de plus d’une semaine, le support devra être rafraîchi au moins une fois.

5. Fin de l’essai de viabilité pour la lecture (~Jour 7)

REMARQUE : Cette étape peut être effectuée les jours 7 à 10. La durée de l’essai doit être déterminée en fonction de la demi-vie et de la pharmacodynamie des médicaments testés.

1. Laisser les réactifs de test de viabilité atteindre la température ambiante dans l’obscurité. Conservez les réactifs à 4 °C pendant la nuit (dans l’obscurité) pour réduire le temps de décongélation.
2. Retirez la plaque de dosage de l’incubateur de culture cellulaire et laissez-la s’acclimater à la température ambiante pendant 30 minutes. La plaque n’a pas besoin de s’acclimater dans l’obscurité.
3. Ajouter 100 μL de réactif d’essai de viabilité (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits (pour un volume total de 200 μL) et placer sur une plaque agitatrice pendant 5 min (80 tr/min). Retirez l’assiette du shaker et incubez pendant 25 minutes supplémentaires à température ambiante. Assurez-vous que la plaque est toujours protégée de la lumière en la recouvrant d’une feuille d’aluminium ou d’une boîte opaque.
4. Allumez le lecteur de plaques de bioluminescence et ouvrez le logiciel i-control (voir Tableau des matériaux).
5. Sous Se connecter à : Nom de l’instrument, sélectionnez infinite 200Pro.
6. Sélectionnez Luminescence et Script par défaut.
7. Dans le menu déroulant, choisissez le type de plaque [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black.
8. Déterminez les puits à lire et mettez en surbrillance les puits correspondants sous Partie de la plaque.
9. Sous Mesures sur le côté gauche de l’écran, faites glisser et déposez Luminescence sous la Partie de la plaque.
10. Sélectionnez les paramètres de luminescence : Atténuation : AUCUNE ; Temps d’intégration : 1000 ms ; Temps de règlement : 0 ms.
11. Retirez le couvercle de la plaque et chargez-le dans le lecteur de plaques. Appuyez sur Démarrer pour commencer.
12. Une fois l’opération terminée, exportez les données et enregistrez-les.

6. Analyse des données

1. Calculez le pourcentage de viabilité de la cellule.
   1. Soustrayez le « blanc » de chaque puits pour les lectures corrigées du blanc. Ensuite, calculez la moyenne de contrôle en faisant la moyenne des trois puits de contrôle.
   2. Utilisez l’équation suivante pour calculer le pourcentage de cellules viables dans chaque puits : (Puits expérimental / Moyenne témoin) x 100
   3. Représenter graphiquement les données résultantes dans le logiciel d’analyse (voir Tableau des matériaux).
2. Examinez les indicateurs de taux de croissance (GR).
   1. Calculez manuellement les mesures GR conformément au rapport publié³⁴.
   2. Vous pouvez également utiliser le calculateur de GR en ligne (voir le tableau des matériaux) pour générer les mesures³⁵. Utilisez les mesures du jour 0 comme « cell_count_time0 », qui reflètent le taux de croissance des AOP non traitées.
   3. Exportez les données et le graphique.

Résultats

Ces résultats illustrent la réponse de deux AOP à l’agent chimiothérapeutique carboplatine, utilisé pour traiter le cancer de l’ovaire. Les organoïdes ont été dérivés de la biopsie tumorale (PDO #1) et de l’ascite (PDO #2). Ces organoïdes ont été sélectionnés en fonction de leur temps de doublement perçu (1 à 2 jours) et de leur aspect morphologique (formation de nombreux grands organoïdes). L’AOP #1 et l’AOP #2 ont été plaquées le jour -2, au deuxième passage, et le carboplatine a été a...

Discussion

Cet article décrit une méthode qui peut être utilisée pour évaluer les effets thérapeutiques de médicaments conventionnels ou nouveaux sur les AOP du cancer de l’ovaire. Les chercheurs doivent tenir compte de plusieurs questions avant d’effectuer l’essai de viabilité dans le modèle PDO.

Tout d’abord, lors de la sélection d’un PDO à utiliser dans le test de viabilité, il faut déterminer le type d’organoïde idéal (tumeur ou ascite) et le numéro de passage pou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Plastic Tubes
15 mL Plastic Tubes
96 well Flat Black Plates	MidSci	781968
Advance Organoid Media			see Graham et al 2022 (Jove)
Advanced DMEM/F12	Thermo Fisher	12634028
Automated Cell Counter	Thermo Fisher	AMQAX1000
Brightfield Microscope
Carboplatin	Teva Pharmaceuticals USA	NDC 00703-4246-01
CellTiter-Glo 3D Viability	Promega	G9681
Cultrex	R & D Systems	3533-010-02
DMSO	Sigma Aldrich	D2650-100ML
Glutamax	Life Technologies	35050061
GR Calculator	http://www.grcalculator.org		Online calculator
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc.
HEPES	Life Technologies	15630080
Matrigel	Corning	354230
Microsoft Excel	Microsoft
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Plate Rocker
Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips
Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes
Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software	Tecan
TrypLE	Thermo Fisher	12605010	Organoid dissociation reagent