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요약

환자 유래 난소암 오가노이드로 치료 약물 테스트를 수행하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

초록

난소암은 치명적인 부인과 암이며 미국 여성의 암 사망 원인 중 5위를 차지합니다. 신약 치료법 개발은 의료 서비스를 발전시키고 환자 결과를 개선하는 데 매우 중요합니다. 오가노이드는 체외 3차원 다세포 소형 장기입니다. 난소암의 환자 유래 오가노이드(PDO) 모델은 2차원 세포 배양 모델보다 관심 조직을 더 정확하게 재현하고 환자 유래 이종이식에 비해 저렴하기 때문에 약물 스크리닝에 최적일 수 있습니다. 또한 난소암 PDO는 난소암에서 일반적으로 관찰되는 다양한 종양 미세환경 및 유전적 배경을 모방합니다. 여기에서, 난소암 조직 및 복수로부터 유래된 PDO에 대한 종래의 약물 및 신규약을 시험하는데 사용될 수 있는 방법이 설명된다. 발광 기반 아데노신 삼인산(ATP) 분석은 생존율, 성장률 및 약물 민감도를 측정하는 데 사용됩니다. PDO의 약물 스크리닝은 오가노이드 형성 속도 및 약물 치료에 따라 7-10일 이내에 완료될 수 있습니다.

서문

드물기는 하지만 난소암은 가장 치명적인 부인과 암중 하나입니다 1,2. 새로운 치료법 개발의 어려움은 난소암이 이질적이고 종양 미세환경이 환자마다 크게 다르다는 것입니다. 또한 많은 난소암에서 백금계 화학요법 및 폴리(ADP-리보스) 중합효소 억제제에 대한 내성이 발생하여 더 많은 치료 옵션이 필요함을 강조합니다 3,4,5.

새로운 치료제를 식별하는 데 유용할 수 있는 한 가지 접근법은 환자 유래 오가노이드(PDO)를 사용하는 것입니다. 오가노이드는 자가 조직화되어 체외 "미니 장기"를 형성하는 여러 세포 유형의 3차원 클러스터입니다6,7,8,9,10. 오가노이드는 중요한 조직 형태 및 유전자 발현 프로파일을 재현할 수 있습니다11,12. 최초의 오가노이드 중 일부는 생쥐와 인간 모두의 장암, 위암 및 대장암 세포에서 파생되었습니다 8,9,13. 수명이 긴 오가노이드 배양은 방광, 결장, 위, 췌장, 뇌, 망막 및 간을 포함한 광범위한 양성 및 악성 조직에서 확립되었습니다 14,15,16. 우리는 이전에 난소암 종양 및 복수 샘플에서 PDO를 확립하는 방법을 시연했다17. PDO는 분자 특성, 세포 메커니즘 및 새로운 약물 치료를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 18,19,20. PDO는 약물 스크리닝을 위한 기존의 2차원 1차 세포 배양에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 1차 2차원 배양은 약물 스크리닝을 위한 저비용 방법이지만, 1차 세포 배양은 단일 세포 유형이며 종양 21,22,23의 3차원 구조가 부족합니다. 그럼에도 불구하고 PDO는 귀중한 자원이며, 치료 약물 스크리닝에서 PDO의 사용을 최적화하기 위해서는 비용 효율적인 프로토콜이 필요합니다.

이 글에서는 난소암 PDO를 사용하여 알려진 약물 또는 후보 약물의 효과를 테스트하는 in vitro 방법에 대해 설명합니다. PDO를 사용하는 현재의 중처리량 및 고처리량 약물 스크리닝에는 고가의 자동 분주 기기(24,25,26)가 필요하지만, 이 비용 효율적인 방법은 쉽게 구할 수 있는 기본 실험실 용품과 표준 96웰 플레이트 형식의 ATP 기반 세포 생존도 분석을 사용합니다(그림 1A). 이 방법은 더 큰 스크린으로 확장하기 전에 새로운 난소암 약물의 예비 테스트를 용이하게 할 것이다 27,28. 여기서는 난소암 PDO를 사용하지만, 이 방법은 다른 암 오가노이드 모델에도 적용할 수 있다.

프로토콜

이 연구를 위한 인체 표본 수집은 Washington University School of Medicine Institutional Review Board의 승인을 받았습니다. 18세 이상의 모든 적격 환자는 고등급 장액성 난소암 진단을 받았거나 추정 진단을 받았으며 정보에 입각한 동의를 제공할 의사와 능력이 있었습니다. 복수 및 흉수액 외에도 원발성 또는 전이성 부위의 종양 조직은 치료 당시 동의한 환자로부터 얻었다.

1. 생존도 분석을 위한 확립된 PDO 선택

참고: 일반적으로 이러한 오가노이드는 처음 5개 구절 내에 있습니다. 앞서 설명한 바와 같이, 난소암 PDO는 Cultrex 또는 Matrigel17 과 같은 기저막 추출물(BME)에서 일차 세포 현탁액을 재현탁시킴으로써 형성된다( 재료 표 참조).

  1. PDO는 분석의 최상의 효율성을 위해 24-72시간의 인지된 배증 시간을 가져야 합니다. passaging/plating 후 오가노이드가 형성되는 데 걸리는 일수를 시각적으로 결정하여 인지된 배증 시간을 추정합니다.
    참고: 경험상 형성에 3일 이상 걸리는 오가노이드는 이 성장 억제 분석에 사용할 수 없습니다.
  2. 약물을 식별하고 테스트할 농도 범위를 선택합니다(예: 카보플라틴, 0-50μM, 재료 표 참조).
  3. 플레이트 설정을 결정합니다. 이 분석은 세 번에 걸쳐 수행되어 한 플레이트에서 테스트할 수 있는 약물의 수와 농도를 제한합니다.
    알림: 분석을 수행하기 전에 선택한 PDO 라인을 주의 깊게 관찰해야 합니다. 확립된 난소암 PDO는 종양과 같은 싹을 틔우는 모양을 가진 다세포 고체 및 속이 빈 구체를 형성합니다(그림 1B). PDO 형태, 게놈 프로파일 등은 분석을 수행하기 전에 환자 샘플(가능한 경우)의 형태와 비교해야 합니다29-33. 난소암 PDO는 원발성 및 전이성 종양 샘플과 복수로부터 생성할 수 있다17.

2. 생존도 분석을 위한 시약 준비

  1. 기본 배지: 고급 DMEM/F12에 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신, 1x 글루타맥스 및 1% (v/v)HEPES17 을 추가합니다( 재료 표 참조).
  2. 이전에 발표된 보고서17에 따라 난소암 오가노이드를 위한 사전 오가노이드 배지를 준비합니다.

3. 오가노이드 도금 (~Day -2)

알림: 이 단계는 약물을 추가하기 1-3일 전에 수행해야 합니다. 시작하기 전에 모든 시약(기본 배지, Advance 오가노이드 배지 및 오가노이드 해리 시약, 재료 표 참조)을 수조에서 37°C로 데우십시오. BME를 얼음물 욕조에서 해동합니다.

  1. 명시야 현미경을 사용하여 관심 오가노이드가 70%-90% 합류하는지 확인합니다.
    NOTE: 나중에 참조할 수 있도록 오가노이드 이미지를 저장하는 것이 좋습니다.
  2. 오가노이드가 들어 있는 웰에 따뜻하게 데워진 베이스 배지 1-2mL를 추가하고 피펫을 위아래로 피펫하여 BME 함유 오가노이드를 기계적으로 해리합니다. 전체 용액을 15mL 코니컬 튜브(17)로 옮깁니다.
    참고: 일반적으로 1-2mL의 배지는 BME를 적절하게 희석하기에 충분합니다. 동일한 환자와 통로의 오가노이드를 결합할 수 있습니다.
  3. 세포를 더 해리시키기 위해 5-10초 동안 와류하고 실온(RT)에서 1107 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  4. 단일 채널 피펫으로 상층액을 제거하고 폐기합니다. 오가노이드를 1mL 오가노이드 해리 시약( 재료 표 참조)에 재현탁시키고 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 37 °C에서 7 분 동안 배양합니다.
    1. 남은 BME로 인해 펠릿이 여전히 젤라틴 같으면 1mL의 베이스 배지를 추가하고 5-10초 동안 소용돌이치고 원심분리를 반복합니다.
  5. 상층액을 1107 x g 에서 상온에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 폐기하고 세포 펠릿을 1mL의 기본 배지에 재현탁시킵니다.
  6. 자동 세포 계수기( 재료 표 참조) 또는 혈구계를 사용하여 각 PDO 배양의 세포 수를 계산합니다.
  7. 25% 기본 배지 및 75% BME의 10μL당 20,000개 세포에서 세포를 재현탁시킵니다. 매체에서 오가노이드를 재현탁하고 BME와 혼합하여 이를 수행합니다.
  8. 재현탁된 BME + PDO 세포의 3μL 액적 1개를 검은색 불투명 96웰 플레이트의 웰 1개에 플레이트합니다( 재료 표 참조). 각 웰의 중앙에 물방울을 놓습니다. 각 약물 농도를 세 배로 도금합니다.
    참고: 세포 생존도 분석은 발광 기반이므로 배경을 피하기 위해 검은색 불투명 플레이트를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 분석 중에 투명 플레이트를 사용하여 오가노이드를 시각화할 수 있지만 발광을 측정하기 전에 플레이트 바닥을 불투명 테이프로 덮어야 합니다.
  9. 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 15분 동안 배양합니다.
  10. 각 웰에 100μL의 Advance Organoid Media를 추가합니다. 24-72 시간 동안 플레이트를 배양합니다 (지각 된 PDO 배증 시간에 따라 결정). Advance Organoid Media 100μL를 빈 웰에 추가하여 블랭크로 사용합니다.
    참고: 목표는 오가노이드가 형성될 수 있도록 하는 것입니다.
  11. 선택 사항: 성장률 분석을 위해 추가 삼중 PDO를 별도의 플레이트에 플레이트합니다. 이것은 Time = 0에서 세포를 계수하는 데 사용되며 섹션 5에 설명된 생존도 분석을 사용하여 0일에 분석해야 합니다.

4. 0일째 생존도 분석을 위한 약물 추가

NOTE: 0일은 약물이 완전히 형성된 오가노이드에 첨가되는 날을 나타냅니다.

  1. Advance Organoid Media에서 선택한 약물을 원하는 농도로 희석합니다. 희석액은 1.5mL 튜브 또는 사전 설정된 96웰 플레이트에서 수행할 수 있으며, 이를 통해 다중 채널 피펫을 사용하여 배지를 분주할 수 있습니다.
    알림: 약물은 dimethyl sulfoxide와 같이 제조업체에서 제안한 용매에 재현탁되어야 합니다. 이 연구를 위해 Advance Organoid Media에서 카보플라틴을 1, 5, 10, 25, 50 및 75μM로 희석했습니다.
  2. 단일 또는 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 배지를 제거하고 PDO/BME 방울을 만지거나 방해하지 않도록 주의합니다.
  3. 100μL의 Advance Organoid 배지와 원하는 약물을 각 웰에 추가합니다. 3개의 제어 웰에 새 매체를 추가해야 합니다.
    참고: 약물 농도는 과학적 질문과 약물 작용 메커니즘에 따라 다양합니다. 어떤 농도를 사용할지 결정할 때는 비교 가능한 2D 세포주(예: 불멸화된 난소암 세포주)에서 이전에 확립된 약물 농도부터 시작합니다. 오가노이드에 대한 효과가 관찰되지 않는 경우 농도를 높여야 할 수 있습니다.
  4. 필요에 따라 미디어와 약물을 새로 고칩니다(4.1-4.3단계 반복). 배지를 새로 고쳐야 하는지 여부는 분석 기간, 약물의 생물학적 활성 및 약물의 반감기에 따라 다릅니다. 일주일 이상 분석하려면 배지를 한 번 이상 새로 고쳐야 합니다.

5. 판독을 위한 생존도 분석 종료(~7일차)

알림: 이 단계는 7-10일에 수행할 수 있습니다. 분석 기간은 테스트 중인 약물의 반감기 및 약력학에 따라 결정되어야 합니다.

  1. 생존도 분석 시약이 어두운 곳에서 실온에 도달하도록 합니다. 시약을 4°C에서 밤새 보관하여(어두운 곳에서) 해동 시간을 줄입니다.
  2. 세포 배양 인큐베이터에서 분석 플레이트를 제거하고 30분 동안 실온에 적응시킵니다. 플레이트는 어둠 속에서 적응할 필요가 없습니다.
  3. 100μL의 생존도 분석 시약( 재료 표 참조)을 각 웰(총 부피 200μL)에 추가하고 플레이트 셰이커에 5분(80rpm) 동안 놓습니다. Shaker에서 플레이트를 제거하고 실온에서 추가로 25분 동안 배양합니다. 플레이트를 호일이나 불투명한 상자로 덮어 항상 빛으로부터 보호하십시오.
  4. 생물 발광 플레이트 리더를 켜고 i-control 소프트웨어를 엽니다( 재료 표 참조).
  5. Connect to: Instrument Name(연결 대상: 악기 이름)에서 infinite 200Pro를 선택합니다.
  6. 발광 및 기본 스크립트를 선택합니다.
  7. 드롭다운 메뉴에서 플레이트 유형 [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black을 선택합니다.
  8. 읽을 웰을 결정하고 플레이트의 일부(Part of Plate)에서 해당 웰을 강조 표시합니다.
  9. 화면 왼쪽의 측정(Measurements )에서 발광(Luminescence) 을 플레이트 부품(Part of Plate) 아래로 끌어다 놓습니다.
  10. 발광 매개변수 선택: 감쇠: 없음; 통합 시간: 1000ms; 정착 시간: 0ms.
  11. 플레이트에서 덮개를 제거하고 플레이트 리더에 장착합니다. 시작하려면 시작 을 누르십시오.
  12. 완료되면 데이터를 내보내고 저장합니다.

6. 데이터 분석

  1. 세포 생존율(%) 을 계산합니다.
    1. Blank Corrected 판독값에 대해 모든 웰에서 "Blank"를 뺍니다. 다음으로, 3개의 대조군의 평균을 구하여 관리 평균을 계산합니다.
    2. 다음 방정식을 사용하여 각 웰에서 생존 가능한 세포의 백분율을 계산합니다. (실험 웰 / 제어 평균) x 100
    3. 해석 소프트웨어에서 결과 데이터를 그래프로 표시합니다( 재료 표 참조).
  2. 성장률(GR) 메트릭을 검토합니다.
    1. 게시된 보고서34에 따라 GR 메트릭을 수동으로 계산합니다.
    2. 대안적으로, 온라인 GR 계산기( 재료 표 참조)를 사용하여 메트릭(35)을 생성한다. Day 0 측정값을 "cell_count_time0"로 사용하여 처리되지 않은 PDO의 성장률을 반영합니다.
    3. 데이터 및 그래프를 내보냅니다.

결과

이 결과는 난소암 치료에 사용되는 화학 요법 약물 카보플라틴에 대한 두 PDO의 반응을 보여줍니다. 오가노이드는 종양 생검(PDO #1) 및 복수(PDO #2)에서 파생되었습니다. 이러한 오가노이드는 인지된 배증 시간(1-2일)과 형태학적 외관(많은 대형 오가노이드 형성)을 기반으로 선택되었습니다. PDO #1 및 PDO #2는 모두 -2일째 2개 통로에서 도금되었고, 0일째에 카보플라틴이 첨가되었습니다. Advance 오가노?...

토론

이 논문에서는 난소암 PDO에 대한 기존 또는 신규 약물의 치료 효과를 평가하는 데 사용할 수 있는 방법을 설명합니다. 연구자는 PDO 모델에서 생존도 분석을 수행하기 전에 몇 가지 문제를 고려해야 합니다.

첫째, 생존도 분석에 사용할 PDO를 선택할 때 필요에 맞는 이상적인 오가노이드 유형(종양 대 복수)과 통로 수를 결정해야 합니다. 경험에 비추어 볼 때, 복수 유래 PD...

공개

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 말

이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립암연구소(National Cancer Institute)의 지원을 받아 R01CA243511번 상을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 저자는 Deborah Frank의 편집 의견에 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Plastic Tubes
15 mL Plastic Tubes
96 well Flat Black PlatesMidSci781968
Advance Organoid Media see Graham et al 2022 (Jove)
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher12634028
Automated Cell CounterThermo FisherAMQAX1000
Brightfield Microscope
Carboplatin Teva Pharmaceuticals USANDC 00703-4246-01
CellTiter-Glo 3D Viability PromegaG9681
CultrexR & D Systems3533-010-02
DMSOSigma AldrichD2650-100ML
GlutamaxLife Technologies35050061
GR Calculator http://www.grcalculator.orgOnline calculator
GraphPad PrismGraphPad Software, Inc.
HEPESLife Technologies15630080
MatrigelCorning354230
Microsoft ExcelMicrosoft
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher15140122
Plate Rocker
Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips
Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes
Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control SoftwareTecan
TrypLEThermo Fisher12605010Organoid dissociation reagent

참고문헌

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