Fokussierte Ultraschall-Neuromodulation von humanen In-vitro-Neuralkulturen in Multi-Well-Mikroelektroden-Arrays

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Verwendung eines Hochdurchsatzsystems vor, das die Überwachung und Quantifizierung der neuromodulatorischen Effekte von fokussiertem Ultraschall auf humane induzierte pluripotente Stammzellen (HiPSC) ermöglicht.

Zusammenfassung

Die neuromodulatorische Wirkung von fokussiertem Ultraschall (FUS) wurde in Tiermodellen nachgewiesen, und FUS wurde erfolgreich zur Behandlung von Bewegungs- und psychiatrischen Störungen beim Menschen eingesetzt. Trotz des Erfolgs von FUS ist der Mechanismus, der seinen Auswirkungen auf Neuronen zugrunde liegt, nach wie vor unzureichend verstanden, was die Optimierung der Behandlung durch die Abstimmung der FUS-Parameter erschwert. Um diese Wissenslücke zu schließen, untersuchten wir menschliche Neuronen in vitro mit Neuronen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) kultiviert wurden. Die Verwendung von HiPS-Zellen ermöglicht die Untersuchung menschenspezifischer neuronaler Verhaltensweisen sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Zuständen. In diesem Bericht wird ein Protokoll für die Verwendung eines Hochdurchsatzsystems vorgestellt, das die Überwachung und Quantifizierung der neuromodulatorischen Effekte von FUS auf HiPSC-Neuronen ermöglicht. Durch die Variation der FUS-Parameter und die Manipulation der HiPSC-Neuronen durch pharmazeutische und genetische Modifikationen können die Forscher die neuronalen Reaktionen bewerten und die neuromodulatorischen Auswirkungen von FUS auf HiPSC-Neuronen aufklären. Diese Forschung könnte erhebliche Auswirkungen auf die Entwicklung sicherer und wirksamer FUS-basierter Therapien für eine Reihe von neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen haben.

Einleitung

Fokussierter Ultraschall (FUS) ist eine vielversprechende Neuromodulationsmodalität, die eine nicht-invasive Stimulation in Zentimetertiefen mit einer Auflösung von unter einem Millimeter^{ermöglicht 1,2,3}. Trotz dieser Stärken ist die klinische Wirkung von FUS begrenzt, was zum Teil auf mangelndes Wissen über den Wirkmechanismus zurückzuführen ist. Ohne eine solide theoretische Grundlage haben Forscher und Kliniker Schwierigkeiten, die Therapie auf die spezifischen Bedürfnisse der einzelnen Patienten unter unterschiedlichen Bedingungen zuzuschneiden. Eine prominente Theorie, die von Yoo et ^al.4 vorgeschlagen wurde, besagt, dass mechanosensitive Ionenkanäle für die Aktivierung von Neuronen verantwortlich sind. Diese Theorie kann jedoch die FUS-Aktivierung in menschlichen Gehirnneuronen nicht erklären, denen diese Kanäle fehlen⁵. Diese Mehrdeutigkeit schränkt den Einsatz von FUS in der Klinik ein, da sie die Abstimmung von FUS-Parametern zur Optimierung der Behandlungsergebnisse ausschließt.

Frühere verwandte Studien haben eine Reihe von Ansätzen verwendet, um die physiologischen Mechanismen, die FUS zugrunde liegen, zu untersuchen und die optimalen Stimulationsparameter zu bestimmen. Ein entscheidender Schritt in diesem Prozess ist die Überwachung neuronaler Antworten als Feedback, die durch Methoden der Ionen-Gate-Überwachung erreicht werden kann, wie z. B. Kalziumionen-Bildgebung⁴, optische Bildgebung¹ und elektrophysiologische Ex-vivo-Aufzeichnung (z. B. Elektromyographie⁶ oder Haut-Nerven-Elektrophysiologie⁷). Die meisten dieser Studien verwenden jedoch nicht-menschliche Neuronen oder In-vivo-Ansätze, die aufgrund suboptimaler Kontrollen zu zusätzlichen Abweichungen führen können. Im Gegensatz dazu bietet die Verwendung von Elektroden zur Messung neuronaler Signale in In-vitro-Neuronen humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (HiPSC) empfindlichere Messungen und eine bessere Kontrolle über die experimentelle Umgebung. In dieser Arbeit wurde ein In-vitro-System entwickelt, das Mikroelektroden-Arrays (MEAs) verwendet, um die elektrischen Reaktionen von HiPSC-Neuronen nach FUS-Stimulation zu messen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Dieses System ermöglicht es Forschern in der Gemeinschaft, neuronale Reaktionen zu überwachen, wenn die Ultraschallparameter (z. B. Frequenz, Burst-Länge, Intensität) variiert werden. Darüber hinaus ermöglicht dieses System ein hohes Maß an Kontrolle der neuronalen Empfindlichkeit gegenüber physikalischen Reizen (z. B. Temperatur, Druck und Kavitation)^8,9, da die Ionenkanalfunktionalität der Neuronen genetisch und pharmazeutisch manipuliert werden kann (z. B. durch die Verwendung von Gadolinium zur Hemmung von Ionenkanälen)10,11,12. Diese Kontrolle auf molekularer Ebene könnte dazu beitragen, die Mechanismen hinter den neuromodulatorischen Effekten von FUS aufzuklären.

Protokoll

1. Vorbereitung der Materialien

1. Saugen Sie das Nährmedium an und füllen Sie damit eine einzelne Vertiefung in einer 24-Well-Neuronenkulturplatte mit eingebetteter MEA (Abbildung 2A). Kultur und Induktion der Neuronen gemäß dem veröffentlichten Protokoll von Taga et ^al.13.
2. Sterilisieren Sie die Parafilm-Grenzfläche, das Gummiband und den FUS-Konus mit seiner Gummimembran mit 70%igem Ethanol für 10 Minuten und legen Sie sie zur späteren Montage in den Abzug.
3. Entgasen Sie 300 ml deionisiertes Wasser und 50 ml Kopplungsgel. Das Wasser und das Gel werden 5 min bei 160 x g zentrifugiert, um Kavitation im Kupplungsmedium zu vermeiden.
   HINWEIS: Die ursprüngliche Quelle der HiPSCs stammt aus GM01582- und CIPS-Zelllinien. Im Mittel kann eine Dichte von 5 x 10⁴ Motoneuronen und 2,5 x 10⁴ Astrozyten pro Well erreicht werden¹⁴.

2. Anschluss und Einrichtung der Peripherie

1. Befestigen Sie den FUS-Konus mit Schrauben am Wandler und dichten Sie den Konus mit einer flexiblen Gummimembran in einer belüfteten sterilen Haube ab. Füllen Sie den Kegel mit dem entgasten und entionisierten Wasser (DG-DI) aus Schritt 1.3 und stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen im Kegel bilden, um Kavitation zu vermeiden.
2. Verwenden Sie eine kundenspezifische Gewindestange, um die 3D-gedruckte Halterung an einem Rahmen zu befestigen (Abbildung 2B). Positionieren Sie den Rahmen so, dass sich der Kopf des FUS-Wandlers über der Vertiefung befindet, die stimuliert werden soll.
3. Verwenden Sie ein Gummiband, um den Parafilm über der Vertiefung auf der 24-Well-MEA-Platte zu befestigen, die das Medium und die HiPSCs enthält.
4. Bereiten Sie das FUS-System vor, indem Sie die Back-End-Treiberelektronik des Ultraschallwandlers anschließen, in diesem Fall die Ausgangsleistung des Schallkopfes (TPO; Abbildung 3A), an eine 100-240-V-Steckdose (Abbildung 3B, Anschluss 6) und Anschließen des Anpassungsnetzwerks an den TPO und den FUS-Wandler (Abbildung 3B, Anschluss 1 bzw. Anschluss 2). Das Anpassungsnetzwerk sorgt für eine effiziente elektrische Kopplung zwischen dem Wandler und dem TPO.
5. Schließen Sie das MEA-System an eine Steckdose (100-240 V) an (Abbildung 3B, Anschluss 5). Verbinden Sie den Synchronisierungsport des MEA-Systems mit dem TPO (Abbildung 3B, Verbindung 3). Diese Verbindung synchronisiert die Datenerfassung durch das MEA-System mit der FUS-Stimulation.
6. Setzen Sie die 24-Well-MEA-Platte in das MEA-System ein und entfernen Sie den Deckel, um einen direkten Kontakt zwischen dem Wandler und dem Well zu ermöglichen. Platzieren Sie den Messkopf 5-10 mm über der Well-Platte, um Platz für das entgaste Kopplungsgel zu schaffen, wie in Schritt 3.2 beschrieben (Abbildung 3A und Abbildung 2B).

3. Stimulation und neuronale Signalerfassung

1. Stellen Sie die FUS-Parameter auf dem TPO-Bedienfeld ein (Tabelle 1).
2. Tragen Sie das Kopplungsgel auf den Parafilm auf und senken Sie den FUS-Schallkopf in das Kopplungsgel ab, wobei Sie den Kontakt mit dem Gel mit minimalen Luftblasen sicherstellen müssen (Abbildung 2A).
3. Starten Sie die MEA-Systemaufzeichnung, indem Sie auf der Benutzeroberfläche auf die Schaltfläche Start klicken.
4. Starten Sie die FUS-Beschallung, indem Sie die untere rechte Taste am TPO drücken (Abbildung 3A, Etikett 7), und warten Sie mindestens 5 Minuten zwischen jeder Beschallungsrunde, damit die Neuronen in einen Ausgangszustand zurückkehren können.
5. Verwenden Sie den vom FUS-System erzeugten Triggerimpuls, um die FUS-Stimulationssequenz an die MEA-Aufzeichnung anzupassen (Abbildung 3B, Anschluss 3).

4. Datenverarbeitung und -analyse

1. Übertragen Sie die Daten vom MEA-System über eine USB-Verbindung auf den Computer (Abbildung 3B, Anschluss 4). Beginnen Sie dies, indem Sie auf den Bereich "Experiment einrichten " klicken. Wählen Sie als Nächstes den Datentyp aus, den Sie aufzeichnen möchten. In diesem Fall werden rohe Spikes empfohlen. Benennen Sie abschließend die Datei und wählen Sie den gewünschten Speicherort innerhalb des Laufwerks aus, um die Übertragung abzuschließen.
   Hinweis: Die folgenden Schritte können ausgeführt werden, indem Sie das veröffentlichte Python-Skript in https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod ausführen.
2. Lesen Sie die Daten von jeder der 16 Elektroden ein.
3. Wenden Sie einen Butterworth-Bandpassfilter mit einer Bandbreite von 5 Hz bis 3 kHz mit einer Butterworth-Größenordnung von 8 an.
   HINWEIS: Um diese Werte zu optimieren, ist es entscheidend, die Feuerrate der spezifischen Zellen und die Anzahl der beteiligten Zellen zu berücksichtigen. Durch Multiplikation dieser 2 Werte kann man die Gesamtfeuerrate der Zellpopulation im Experiment abschätzen.
4. Wenden Sie einen Gauß-Filter mit σ = 3 an, um das Signal zu glätten.
   HINWEIS: Der Parameter kann basierend auf den empfohlenen Werten des MEA-Systems optimiert werden, da eine übermäßige Glättung nach der Erfassung zu Datenverzerrungen führen kann und eine zu geringe Glättung zu unerwünschtem Rauschen führen würde.
5. Legen Sie einen Schwellenwert fest, um die potenziellen Spitzen als das 5-fache der Standardabweichung des Gauß-geglätteten Signals zu erkennen.
6. Berechnen Sie die Feuerrate, indem Sie die Anzahl der in einem 50-ms-Fenster registrierten Spitzen über alle 16 Kanäle durch die Länge des Fensters (d. h. 50 ms) dividieren. Verschieben Sie das Fenster entlang des Signals zum nächsten Frame und wiederholen Sie die Berechnung der Feuerrate (ergänzende Abbildung 1).
7. Analysieren Sie das Signal, indem Sie die FUS-Beschallungszeit aus den übertragenen Daten ablesen, basierend auf der Änderung der mit dem FUS verbundenen Feuerrate.

5. Reinigung und Wiederverwendung von Multi-Well-MEA-Platten

1. Sobald die Experimente abgeschlossen sind, verwenden Sie eine Pipette, um das Medium vorsichtig aus den Vertiefungen in der Multi-Well-Platte zu entfernen, wobei Sie darauf achten müssen, die Elektrodenoberfläche zu vermeiden.
2. Geben Sie 2 ml DG-DI-Wasser pro Brunnen hinzu. Absaugen und einmal wiederholen.
3. Um Zellen und Ablagerungen zu entfernen, geben Sie eine Mischung aus 1 g enzymatischem Reinigungsmittel Terg-A-Zyme mit 10 ml sterilem DG-DI-Wasser (0,3 ml pro Well) auf die Platte. Lassen Sie es über Nacht bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
4. Am nächsten Tag wird die Lösung aus den Vertiefungen entnommen und mit 1 ml sterilem DG-DI-Wasser gespült.
5. Inkubieren Sie die Multi-Well-Platte 5-7 Minuten lang und aspirieren Sie. Wiederholen Sie diesen Schritt 5 Mal.
6. Fügen Sie 0,5 ml steriles DG-DI-Wasser pro Vertiefung hinzu. Notieren Sie die Baseline der gereinigten Multi-Well-Platte, um zu überprüfen, ob die MEA-Platte sauber ist. Eine gereinigte Platte sollte Gaußsche Rauschmuster mit niedrigen Intensitätswerten aufweisen.
7. Lagern Sie die gereinigte Multiwell-Platte bei 4 °C, bis sie wieder einsatzbereit ist. Wechseln Sie das Wasser, in dem die MEAs gespeichert werden, mindestens einmal pro Monat.

Ergebnisse

Zusammenfassend stellen wir ein Protokoll vor, das eine in vitro FUS-Neuromodulationsüberwachung mit Neuronen ermöglicht, die aus HiPS-Zellen kultiviert wurden. Die gesamte Systemplattform zur Stimulation von HiPSC-induzierten Neuronen und zur Aufzeichnung der entsprechenden elektrischen Reaktionen für die Analyse ist in Abbildung 1 dargestellt. Diese Studie konzentriert sich auf die FUS-Stimulation von Neuronen und die Aufzeichnung der elektrischen Antworten in einem MEA-System, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die peripheren Komponenten der FUS- und MEA-Systeme und ihre Verbindungen sind in Abbildung 3 dargestellt.

Die Charakterisierung des Fokuspunkts wird vor den neuronalen Experimenten durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Boden des Wells vollständig vom FUS-Brennpunkt abgedeckt wird. Die Visualisierung des Brennflecks auf thermochromen Schichten, wie in Abbildung 4 gezeigt, sollte durchgeführt werden, um das FUS-System zu bewerten. Nach der Charakterisierung des Brennflecks sollten die Nachbearbeitungsschritte, einschließlich Filtern, Schwellwerten und Berechnen der Feuerrate, durchgeführt werden, die in Abbildung 5 und Abbildung 6 zusammengefasst sind. Diese Schritte sind unerlässlich, um nützliche Signale durch Filtern von Rauschen aus der Umgebung zu erhalten und so einen Einblick in die durch FUS verursachten neuronalen Aktivitätsänderungen zu erhalten. Die Raster-Diagramme in Abbildung 6A-B zeigen die erkannten Spitzen in den einzelnen Kanälen. Da sich der gesamte Boden der Vertiefung innerhalb des Brennpunkts des FUS-Wandlers befindet, wird erwartet, dass der FUS die Feuerrate über alle Elektroden hinweg ändern sollte. Diese Änderung der Feuerrate wird in dem in Abbildung 6C gezeigten Feuerratendiagramm visualisiert, das zeigt, dass die gewählten Stimulationsparameter zu einer Erhöhung der neuronalen Feuerrate führten. Konkret betrug die Feuerrate vor FUS (d. h. Baseline) 140 Hz ± 116,7 Hz, während die Feuerrate nach FUS 786 Hz ± 419,4 Hz mit Dauerstrich-FUS betrug. Darüber hinaus zeigt Abbildung 6C, wie die Änderung der FUS-Parameter (z. B. die Verwendung von FUS mit gepulster Welle anstelle von kontinuierlicher Welle) das Ausmaß der Änderung der Feuerrate sowie die Zeitspanne verändern kann, bevor die Neuronen in ihren Ausgangszustand zurückkehren. Fokussierter Ultraschall mit niedriger Intensität (LIFU) verursacht keine signifikante Erwärmung der Kulturen, insbesondere im Vergleich zu hochintensivem fokussiertem Ultraschall, der darauf abzielt, eine thermische Läsion zu erreichen. Das Fehlen klinisch wirksamer Temperaturänderungen wird durch theoretische Berechnungen und Simulationen gestützt (ergänzende Abbildung 2). Selbst in Extremfällen der in Tabelle 1 aufgeführten experimentellen FUS-Parameter konnte nur ein minimaler Temperaturanstieg von ca. 0,04 °C beobachtet werden.

Die Verwendung eines Feuerratendiagramms ermöglicht die Quantifizierung der neuromodulatorischen Effekte von FUS und kann zur Unterscheidung zwischen erregenden und inhibitorischen Reaktionen verwendet werden. Ein wesentlicher Vorteil der Multi-Well-MEA-Platte besteht darin, dass sie mehrfach wiederverwendet werden kann, um unterschiedliche neuronale Zustände und Stimulationsparameter im Hochdurchsatz zu untersuchen.

Abbildung 1: Überblick über die in vitro Plattform für die fokussierte Ultraschall (FUS) Neuromodulation von Neuronen in einem Well und die Messung ihrer neuronalen Aktivität mit Hilfe eines Mikroelektrodenarrays. Jede Elektrode (rote, grüne und blaue Linien) zeichnet aus einer Population von Neuronen in einer einzigen Vertiefung auf. Eine Verarbeitungspipeline wird implementiert, um die rohen neuronalen elektrischen Aufzeichnungen in die Detektion neuronaler Feuermuster umzuwandeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: FUS-Neuromodulation mit einem Multi-Well-Mikroelektroden-Array (MEA). (A) Schematische Darstellung des Aufbaus für die FUS-Neuromodulation mit einer Multi-Well-MEA. Die vom FUS-Wandler erzeugten akustischen Wellen breiten sich durch einen mit entgastem Wasser gefüllten FUS-Kegel aus und werden mit Ultraschallgel gekoppelt. Der Parafilm wird mit einem Gummiband an der Vertiefung befestigt, um eine Kontamination zu verhindern. Die MEA-Platte sendet elektrische Aufzeichnungen von den Neuronen an das MEA-System. (B) Ein Foto des FUS-Wandlers auf der Multi-Well-Platte, die im MEA-System enthalten ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Aufbau der In-vitro-Plattform . (A) Die Vorderseite des In-vitro-Plattformaufbaus . Der Leistungsausgang des Wandlers (TPO; links) dient zur Programmierung der FUS-Parameter. Das MEA-System (rechts) zeichnet die elektrische Aktivität der Neuronen in der Well-Platte auf, die durch den FUS-Wandler neuromoduliert werden. (B) Die Rückseite des In-vitro-Plattformaufbaus mit Verbindungen von dem Anpassungsnetzwerk (1) zum TPO und (2) zum Wandler. (3) Die Verbindung vom MEA-System zum TPO synchronisiert die Datenerfassung. (4) Die Verbindung vom MEA-System zum Computer für die Datenübertragung. (5) Der Stromanschluss an das MEA-System. (6) Der Stromanschluss an das FUS-System. (7) Die Beschallungstaste. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Charakterisierung des FUS-Wandlers. (A) Druckkarte des Brennflecks unter Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten FUS-Parameter, gemessen mit dem AMPLITUDE-System¹⁵. (B) Vor- und Nachbeschallung einer thermochromen Folie, die am Boden eines Wells platziert wurde, unter Verwendung des in Abbildung 3 gezeigten Versuchsaufbaus. Die thermochrome Schicht ändert ihre Farbe als Reaktion auf Temperaturänderungen, was eine visuelle Bestätigung für eine erfolgreiche Stimulation an der Stelle der Neuronen bietet. Die maximale mittlere Intensität des räumlichen Spitzenpulses (I_SPPA) von 30 W/^cm2 und die kontinuierliche Beschallung von 3 min wurden angepasst, um die lokale Temperatur drastisch zu ändern, um einen solchen Brennpunkt besser sichtbar zu machen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Verarbeitungspipeline. Schritt 1: Elektrische Rohaufnahmen werden von N = 16 Kanälen aufgenommen. Die zukünftigen Schritte zeigen den Prozess mit Kanal 16 (rot umrandet). Schritt 2: Für jeden Kanal wird ein Butterworth-Bandpassfilter (5 Hz bis 3 kHz Bandpass) angewendet, gefolgt von einem Gauß-Filter (σ = 3). Ein Schwellenwert wird auf das Fünffache der Standardabweichung des Signals innerhalb eines 2-s-Fensters festgelegt, das zu Beginn der Beschallung zentriert ist. Schritt 3: Signale, die über oder unter dem Schwellenwert liegen, werden als Spikes bezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Raster- und Feuerratendiagramme. (A) Rasterdiagramm der detektierten Spitzen an jedem Kanal in Abhängigkeit von der Beschallungszeit. Der Zeitpunkt der FUS-Stimulation wird mit einer roten Linie markiert. (B) Rasterdiagramm von Neuronen unter verschiedenen FUS-Einstellungen mit kontinuierlicher FUS zum Vergleich. (C) Die Feuerrate wurde unter Verwendung eines gleitenden Fensters von 50 ms berechnet. Die mittleren Feuerraten vor und nach FUS-Neuromodulationen betrugen 140 Hz bzw. 786 Hz. Bei gepulstem FUS betrugen die mittleren Feuerraten 230 Hz und 540 Hz. Es wurde beobachtet, dass eine kürzere Aktivierung und eine geringere Geschwindigkeitsänderung durch diese variable FUS-Stimulation induziert wurden. Das Verfahren zur Berechnung der Feuerrate ist in der ergänzenden Abbildung 1 beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Parameter	Wert
Max. Leistung/Kanal	1.200 W
Ptatsächlich	0,749 W/Kanal.
ISPPA	10.79 W/cm2
ISPTA	0,05 W/cm2
Burst-Länge	0,100 ms
Frequenz	250,00 kHz
Brennpunkt	39.800 Millimeter
Periode	20.000 ms
Zeitschaltuhr	60.000 s

Tabelle 1: Fokussierter Ultraschall (FUS) für die in Abbildung 4 dargestellte Studie.

Ergänzende Abbildung 1: Verarbeitung vom Rasterdiagramm bis zur Feuerrate. Schritt 1: Zählen Sie die Spitzen unter allen Kanälen, um die Anzahl innerhalb eines bestimmten gleitenden Fensters zu erhalten. Hinweis: Hier wurde zur besseren Veranschaulichung ein größeres Schiebefenster (auf 0,1 s eingestellt) gewählt. Schritt 2: Konvertieren Sie die Spitzen pro Fensterlänge in Spitzen pro Sekunde (multiplizieren Sie hier z. B. die Anzahl mit 10, um sie in Hertz [Hz] umzuwandeln, und dividieren Sie dann durch 1.000, um den Wert in Kilohertz [kHz] zu erhalten). Schritt 3: Die dadurch gewonnene Feuerratenkurve. Ein Open-Source-Toolkit ist zusammen mit Beispieldaten auf GitHub (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod) verfügbar. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Temperaturprofil des K-Wellen-Simulationsergebnisses von LIFU¹⁶. Basierend auf der in Abbildung 4 gezeigten akustischen Intensitätskarte deutet das Ergebnis der K-Wellen-Simulation auf einen maximalen Temperaturanstieg von 0,04 °C im mittleren Bereich der Fokuszone (Radius: 2 mm) unter Verwendung des Extremfalls der in Tabelle 1 aufgeführten experimentellen FUS-Parameter hin. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt eine neuartige Methode, mit der neuronale Aktivität in HiPS-Zellen während der FUS-Neuromodulation aufgezeichnet werden kann. Dieses Protokoll ist auf verschiedene FUS-Wandler und MEA-Systeme verallgemeinerbar. Um die mit dem beschriebenen Protokoll beobachteten Ergebnisse zu replizieren, sollte der Forscher sicherstellen, dass der Brennpunkt des Wandlers größer ist als die Fläche des Bodens der MEA-Vertiefung. Wenn verschiedene neuronale Zelllinien verwendet werden, müssen die Filterparameter auf den erwarteten Frequenzgang für die Zellen innerhalb des Wells abgestimmt werden. Wenn keine repräsentativen Ergebnisse erzielt werden können, sollte eine Modifikation der oben genannten Parameter (z. B. Burstlänge, Intensität, Einschaltdauer usw.) in Betracht gezogen werden.

Obwohl diese Arbeit einen Anstieg der Feuerrate nach FUS-Stimulation zeigte, müssen weitere Daten gesammelt werden, um die Wiederholbarkeit dieses Ergebnisses zu demonstrieren, bevor irgendwelche Schlussfolgerungen gezogen werden. Dieses Protokoll erbt die Einschränkungen von MEA-Systemen, die in der Regel Schwächen aufweisen, die sich aus der direkten Mikroelektrodenstromsignalaufzeichnung ergeben. Obwohl der direkte Kontakt mit dem Neuron eine bessere Empfindlichkeit bietet, kann er die Zelle verändern und die Messgenauigkeit beeinträchtigen. Darüber hinaus enthält unser System aufgrund der geringen Größe der Wells kein peripheres Gewebe, das ebenfalls eine Rolle bei der Neuromodulation spielen könnte¹⁷. Dies kann die Anwendbarkeit von Schlussfolgerungen, die aus diesem Aufbau gezogen werden, auf In-vivo-Umgebungen einschränken. Um komplexere Netzwerkreaktionen zu untersuchen, muss ein MEA-System mit höherer Kanaldichte entwickelt werden, um seine Empfindlichkeit zu verbessern¹⁸. Es wurden mehrere zukünftige Richtungen für dieses vorgeschlagene System identifiziert, einschließlich der Verwendung eines 3D-Portals, um den Wandler zu halten und eine genaue Platzierung zu gewährleisten¹⁹. Zusätzliche Verbesserungen könnten hinsichtlich des Nachbearbeitungsalgorithmus vorgenommen werden, einschließlich der Verwendung eines Spiking-Sortieralgorithmus²⁰ zur Klassifizierung einzelner Neuronen. Dieser Prozess wäre von Vorteil, um die Reaktionen von Neuronen mit mehreren Einheiten in zukünftigen Studien zu den Mechanismen von FUS zu entwirren. Am wichtigsten ist es, zusätzliche Stimulationsmodalitäten wie chemische, elektrische und optische Reize einzubeziehen, um die zugrunde liegenden Mechanismen aufzuklären. Diese Verfahren können neuronale Eigenschaften und Verhaltensweisen verändern, beispielsweise durch Hemmung spezifischer Ionenkanäle¹⁵ oder Modifikation der Membraneigenschaften²¹. Durch die Modulation der Hauptfaktoren innerhalb des hypothetischen Signalwegs können die Forscher die Beiträge jedes Faktors in kontrollierten Umgebungen identifizieren und letztendlich Licht auf die komplexen Wechselwirkungen werfen, die im Spiel sind.

Die Elektrostimulation²² ist eine der etabliertesten Techniken zur Neuromodulation mit einer langen Geschichte erfolgreicher Anwendungen in Kliniken und Forschungen. Im Gegensatz dazu sind FUS und Optogenetik²³ relativ neue Modalitäten, die in den letzten Jahren an Aufmerksamkeit gewonnen haben. Die Hauptvorteile von FUS sind seine Nicht-Invasivität und seine Fähigkeit, Neuronen in Tiefen zu stimulieren, die mit anderen Techniken, einschließlich Elektrostimulation und Optogenetik, möglicherweise schwer zu erreichen sind. Wie die Optogenetik²⁴ hat FUS jedoch einige Einschränkungen in Bezug auf die Modellierung der Wellenausbreitung und der damit verbundenen neuronalen Antworten. Die Komplexität der heterogenen akustischen Eigenschaften des Gewebes in vivo zu erfassen, kann eine Herausforderung sein, was zu Unsicherheiten im Druckfeld und damit in den neuronalen Reaktionen führt. Diese Schwierigkeit bei der genauen Modellierung dieser Eigenschaften stellt eine Herausforderung dar, wenn die Technik für bestimmte reale Anwendungen optimiert wird. Die inhärente Komplexität unterstreicht die Bedeutung von In-vitro-Systemen wie dem in dieser Studie, da sie die direkte Untersuchung von Reaktionen unter kontrollierten akustischen Intensitätsbedingungen ermöglichen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses System eine In-vitro-Plattform mit hohem Durchsatz für die Untersuchung der neuromodulatorischen Effekte von FUS auf menschliche Neuronen darstellt. Mit diesem System können die Wirkmechanismen von FUS erforscht werden, indem die elektrischen Reaktionen menschlicher Neuronen gemessen werden, wenn sie in einer kontrollierten Umgebung unterschiedlichen Intensitäten und Arten von Stimulation ausgesetzt sind. Daher bietet es ein wertvolles ergänzendes Werkzeug zu den in diesem Bereich üblichen Human- und Tiermodellen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEA System	Axion Biosystem Inc.	Maestro Edge	Sampling Rate: 11500 Hz
MEA Plate	Axion Biosystem Inc.	CytoView MEA	Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells
Well plate Interface	Amcor Inc.	Parafilm PM996; P7793	Thickness: 127 µm
CO2 Tank and Regulator for culture	AirGas Inc./ Harris Inc.	9296NC	Concentration: 5%
Culture Media	ThermoFisher Inc.	Laminin; 23017-015	Concentration: 1 µg/mL
HiPSC Neurons	Peprotech	CIPS and GM01582 Derived; 450-10	Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13)
Transducer	Sonic Concepts Inc.	CTX250; 008	Center Frequency: 250 kHz
Matching Network	Sonic Concepts Inc.	CTX250; NFS102v2	Impedance: 50 Ω
Transducer Power Output (TPO)	Sonic Concepts Inc.	Version 4.1; 020	Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz
Membrane	McMaster Inc.	Silicone Rubber; 5542N115	Thickness: 0.0127 cm
Coupling Gel	Parker Laboratory Inc.	Aquasonic 100; B08DDWG GXB	Viscosity: 130,000–185,000 cops
Connection to Probe holder	McMaster Inc.	Steal Threaded Rod; 90322A661	Length: 1–1/2" Long
Centrifuge	ThermoFisher Inc.	Sorvall Legend X1R; 75004261	Max acceleration: 10–25,830 x g
Hydrophone	Sonic Concepts Inc.	Y-104; 009	Range: 50 kHz–1.9 MHz
Water Tank	Sonic Concepts Inc.	WT	Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm
Water Conditioning Unit	Sonic Concepts Inc.	WCU; SN006	Flow Velocity: 50 mL/s maximum
Oscilloscope	Rohde-Schwarz Inc.	RTC1002	Sampling rate: Up to 50 MHz
Stage	Sonic Concepts Inc.	MicroStage; 2	Accuracy: 1 µm
Thermochromic sheet	TIPTEMP Inc.	Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337	Range: 22–24 °C
Computer	Microsoft Surface	Surface Pro	CPU i5 1035G4: 3.7 GHz
Data Transfer Software	Mathworks Inc.	MATLAB	Version 2021b
Processing Software	Python Software Foundation	Python	Version 3.7.10