Nous présentons ici un protocole d’utilisation d’un système à haut débit qui permet de surveiller et de quantifier les effets neuromodulateurs des ultrasons focalisés sur les neurones des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HiPSC).
Les effets neuromodulateurs des ultrasons focalisés (FUS) ont été démontrés dans des modèles animaux, et FUS a été utilisé avec succès pour traiter les troubles du mouvement et psychiatriques chez l’homme. Cependant, malgré le succès de la FUS, le mécanisme sous-jacent à ses effets sur les neurones reste mal compris, ce qui rend difficile l’optimisation du traitement par l’ajustement des paramètres FUS. Pour combler cette lacune dans les connaissances, nous avons étudié des neurones humains in vitro à l’aide de neurones cultivés à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HiPSC). L’utilisation des HiPSC permet d’étudier les comportements neuronaux spécifiques à l’homme dans les états physiologiques et pathologiques. Ce rapport présente un protocole d’utilisation d’un système à haut débit qui permet de surveiller et de quantifier les effets neuromodulateurs de FUS sur les neurones HiPSC. En faisant varier les paramètres FUS et en manipulant les neurones HiPSC par des modifications pharmaceutiques et génétiques, les chercheurs peuvent évaluer les réponses neuronales et élucider les effets neuromodulateurs de FUS sur les neurones HiPSC. Cette recherche pourrait avoir des implications importantes pour le développement de thérapies sûres et efficaces à base de FUS pour une gamme de troubles neurologiques et psychiatriques.
Les ultrasons focalisés (FUS) sont une modalité de neuromodulation prometteuse qui permet une stimulation non invasive à des profondeurs centimétriques avec une résolution submillimétrique 1,2,3. Malgré ces atouts, l’impact clinique de la FUS est limité, en partie en raison d’un manque de connaissances sur son mécanisme d’action. En l’absence d’une base théorique solide, les chercheurs et les cliniciens ont du mal à adapter la thérapie pour répondre aux besoins spécifiques de chaque patient dans des conditions variables. Une théorie importante proposée par Yoo et al.4 suggère que les canaux ioniques mécanosensibles sont responsables de l’activation des neurones. Cependant, cette théorie ne parvient pas à expliquer l’activation de FUS dans les neurones cérébraux humains, qui sont dépourvus de ces canaux5. Cette ambiguïté limite l’utilisation de FUS en clinique, car elle empêche le réglage des paramètres FUS pour optimiser les résultats du traitement.
Des études antérieures connexes ont utilisé une gamme d’approches pour étudier les mécanismes physiologiques sous-jacents à la FUS et pour déterminer les paramètres de stimulation optimaux. Une étape cruciale de ce processus consiste à surveiller les réponses neuronales sous forme de rétroaction, ce qui peut être réalisé grâce à des méthodes impliquant la surveillance de la porte ionique, telles que l’imagerie ioniquecalcium 4, l’imagerie optique1 et l’enregistrement électrophysiologique ex vivo (par exemple, l’électromyographie6 ou l’électrophysiologie peau-nerf7). Cependant, la plupart de ces études utilisent des neurones non humains ou des approches in vivo, ce qui peut introduire des variances supplémentaires en raison de contrôles sous-optimaux. En revanche, l’utilisation d’électrodes pour mesurer les signaux neuronaux dans les neurones des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HiPSC) in vitro offre des mesures plus sensibles et un meilleur contrôle de l’environnement expérimental. Dans ce travail, un système in vitro a été développé à l’aide de réseaux de micro-électrodes (MEA) pour mesurer les réponses électriques des neurones HiPSC après une stimulation FUS, comme le montre la figure 1. Ce système permet aux chercheurs de la communauté de surveiller les réponses neuronales lorsqu’ils font varier les paramètres de l’échographie (p. ex., fréquence, durée de la rafale, intensité). De plus, ce système permet un haut niveau de contrôle de la sensibilité neuronale aux stimuli physiques (par exemple, la température, la pression et la cavitation)8,9, car la fonctionnalité des canaux ioniques des neurones peut être manipulée génétiquement et pharmaceutiquement (par exemple, en utilisant du gadolinium pour inhiber les canaux ioniques)10,11,12. Ce contrôle au niveau moléculaire peut aider à élucider les mécanismes à l’origine des effets neuromodulateurs du FUS.
1. Préparation du matériel
2. Connexion et configuration des périphériques
3. Stimulation et acquisition de signaux neuronaux
4. Traitement et analyse des données
5. Nettoyage et réutilisation des plaques MEA multi-puits
En résumé, nous présentons un protocole qui permet le suivi in vitro de la neuromodulation FUS à l’aide de neurones cultivés à partir de HiPSCs. La figure 1 présente la plate-forme globale du système permettant de stimuler les neurones induits par HiPSC et d’enregistrer les réponses électriques correspondantes à des fins d’analyse. Cette étude se concentre sur la stimulation FUS des neurones et l’enregistrement des réponses électriques dans un système MEA, comme le montre la figure 2. Les composants périphériques des systèmes FUS et MEA et leurs connexions sont illustrés à la figure 3.
La caractérisation du point focal est effectuée avant les expériences neuronales pour s’assurer que le fond du puits est entièrement recouvert par le point focal FUS. La visualisation de la tache focale sur des feuilles thermochromiques, comme le montre la figure 4, doit être effectuée pour évaluer le système FUS. Après la caractérisation des points focaux, les étapes de post-traitement, y compris le filtrage, le seuillage et le calcul de la cadence de tir, doivent être effectuées, et elles sont résumées dans les figures 5 et 6. Ces étapes sont essentielles pour récupérer des signaux utiles en filtrant le bruit de l’environnement et, ainsi, pour mieux comprendre les changements d’activité neuronale causés par le FUS. Les diagrammes raster de la figure 6A-B montrent les pics détectés dans chaque canal. Comme tout le fond du puits se trouve à l’intérieur du point focal du transducteur FUS, on s’attend à ce que le FUS modifie la cadence de mise à feu de toutes les électrodes. Ce changement de cadence de déclenchement est visualisé dans le graphique de la cadence de tir de la figure 6C, qui montre que les paramètres de stimulation choisis ont entraîné une augmentation de la cadence de déclenchement neuronal. Plus précisément, la cadence de tir pré-FUS (c’est-à-dire de base) était de 140 Hz ± 116,7 Hz, tandis que la cadence de tir post-FUS était de 786 Hz ± 419,4 Hz avec FUS à ondes continues. De plus, la figure 6C montre comment la modification des paramètres FUS (par exemple, en utilisant un FUS à ondes pulsées au lieu d’ondes continues) peut modifier l’ampleur du changement de la fréquence de déclenchement, ainsi que le temps avant que les neurones ne reviennent à leur état de base. Les ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU) ne provoquent pas de réchauffement significatif des cultures, en particulier par rapport aux ultrasons focalisés de haute intensité, qui visent à obtenir une lésion thermique. L’absence de changement de température ayant un impact clinique est étayée par des calculs théoriques et des simulations (figure supplémentaire 2). Même dans les cas extrêmes des paramètres FUS expérimentaux énumérés dans le tableau 1, seule une augmentation minime de la température a pu être observée d’environ 0,04 °C.
L’utilisation d’un diagramme de fréquence de tir permet de quantifier les effets neuromodulateurs de FUS et peut être utilisé pour différencier les réponses excitatrices et inhibitrices. Un avantage significatif de la plaque MEA multi-puits est qu’elle peut être réutilisée plusieurs fois pour étudier différents états neuronaux et paramètres de stimulation à haut débit.
Figure 1 : Vue d’ensemble de la plateforme in vitro pour la neuromodulation par ultrasons focalisés (FUS) des neurones dans un puits et la mesure de leur activité neuronale à l’aide d’un réseau de microélectrodes. Chaque électrode (lignes rouges, vertes et bleues) enregistre à partir d’une population de neurones à l’intérieur d’un seul puits. Un pipeline de traitement est mis en œuvre pour convertir les enregistrements électriques neuronaux bruts en la détection de modèles de décharge neuronale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Neuromodulation FUS avec un réseau de microélectrodes multi-puits (MEA). (A) Schéma de la configuration de la neuromodulation FUS avec un MEA multi-puits. Les ondes acoustiques générées par le transducteur FUS se propagent à travers un cône FUS rempli d’eau dégazée et sont couplées à l’aide d’un gel à ultrasons. Le parafilm est fixé au puits à l’aide d’un élastique pour éviter toute contamination. La plaque MEA envoie des enregistrements électriques des neurones au système MEA. (B) Une photographie du transducteur FUS sur la plaque multipuits contenue dans le système MEA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Configuration de la plate-forme in vitro. (A) L’avant de la configuration de la plate-forme in vitro. La puissance de sortie du transducteur (TPO ; gauche) est utilisée pour programmer les paramètres FUS. Le système MEA (à droite) enregistre l’activité électrique des neurones de la plaque du puits, qui sont neuromodulés par le transducteur FUS. (B) L’arrière de la plate-forme in vitro avec des connexions du réseau correspondant (1) au TPO et (2) au transducteur. (3) La connexion du système MEA au TPO synchronise l’acquisition des données. (4) La connexion du système MEA à l’ordinateur pour le transfert de données. (5) La connexion d’alimentation au système MEA. (6) La connexion d’alimentation au système FUS. (7) Le bouton de sonication. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Caractérisation du transducteur FUS. (A) Une carte de pression du point focal à l’aide des paramètres FUS détaillés dans le tableau 1 mesurés par le système AMPLITUDE15. (B) Pré- et post-sonication d’une feuille thermochromique placée au fond d’un puits à l’aide du dispositif expérimental représenté à la figure 3. La feuille thermochromique change de couleur en réponse aux changements de température, ce qui fournit une validation visuelle de la stimulation réussie à l’emplacement des neurones. L’intensité moyenne maximale de l’impulsion de crête spatiale (ISPPA) de 30 W/cm2 et la sonication continue de 3 min ont été ajustées pour modifier radicalement la température locale afin de mieux visualiser un tel point focal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Pipeline de traitement. Étape 1 : Les enregistrements électriques bruts sont capturés à partir de N = 16 canaux. Les étapes suivantes montrent le processus à l’aide du canal 16 (encadré en rouge). Étape 2 : Pour chaque canal, un filtre passe-bande de Butterworth (passe-bande de 5 Hz à 3 kHz) est appliqué, suivi d’un filtre gaussien (σ = 3). Un seuil est fixé à cinq fois l’écart-type du signal dans une fenêtre de 2 s centrée au début de la sonication. Étape 3 : Les signaux au-dessus ou au-dessous du seuil sont caractérisés comme des pics. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Tracés de trame et de cadence de tir. (A) Tracé matriciel des pics détectés à chaque canal en fonction du temps de sonication. L’heure de la stimulation FUS est annotée à l’aide d’une ligne rouge. (B) Tracé matriciel de neurones sous différents paramètres FUS avec FUS continu à des fins de comparaison. (C) La cadence de tir a été calculée à l’aide d’une fenêtre glissante de 50 ms. Les taux moyens de déclenchement avant et après les neuromodulations FUS étaient respectivement de 140 Hz et 786 Hz. Avec le FUS pulsé, les cadences moyennes de tir étaient de 230 Hz et 540 Hz. On a observé qu’une activation plus courte et un changement de vitesse moindre étaient induits par cet ensemble de stimulations FUS variables. Le processus de calcul de la cadence de tir est détaillé dans la figure supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Paramètre | Valeur |
Puissance max. | 1.200 W |
Préel | 0,749 W/canal. |
J’ai SPPA | 10,79 W/cm2 |
ISPTA | 0,05 W/cm2 |
Longueur de rafale | 0,100 ms |
Fréquence | 250.00 kHz |
Foyer | 39.800 millimètre |
Période | 20 000 ms |
Minuteur | 60.000 s |
Tableau 1 : Paramètres des ultrasons focalisés (FUS) réglés sur le TPO pour l’étude présentée à la figure 4.
Figure supplémentaire 1 : Traitement du tracé raster à la cadence de tir. Étape 1 : Comptez les pointes parmi tous les canaux pour obtenir le nombre de comptages dans une fenêtre coulissante donnée. Remarque : Ici, une fenêtre coulissante plus grande (réglée sur 0,1 s) a été choisie pour une meilleure illustration. Étape 2 : Convertissez les pics par longueur de fenêtre en pics par seconde (par exemple, ici, multipliez les nombres par 10 pour les convertir en hertz [Hz], puis divisez-les par 1 000 pour obtenir la valeur en kilohertz [kHz]). Etape 3 : La courbe de cadence de tir acquise en conséquence. Une boîte à outils open source, ainsi que des exemples de données, sont disponibles sur GitHub (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Profil de température du résultat de la simulation de l’onde K du LIFU16. Sur la base de la carte d’intensité acoustique présentée à la figure 4, le résultat de la simulation de l’onde K suggère une augmentation maximale de la température de 0,04 °C dans la région centrale de la zone focale (rayon : 2 mm) en utilisant le cas extrême des paramètres FUS expérimentaux énumérés dans le tableau 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Ce manuscrit décrit une nouvelle méthode qui peut être utilisée pour enregistrer l’activité neuronale dans les HiPSCs au cours de la neuromodulation FUS. Ce protocole est généralisable à différents transducteurs FUS et systèmes MEA. Pour reproduire les résultats observés avec le protocole décrit, le chercheur doit s’assurer que le point focal du transducteur est plus grand que la surface du fond du puits MEA. De plus, si différentes lignées de cellules neuronales sont utilisées, les paramètres du filtre doivent être ajustés à la réponse en fréquence attendue pour les cellules du puits. S’il n’est pas possible d’obtenir des résultats représentatifs, il faut envisager de modifier les paramètres susmentionnés (par exemple, la durée de l’éclatement, l’intensité, le rapport cyclique, etc.).
Bien que ces travaux aient démontré une augmentation de la cadence de déclenchement après la stimulation FUS, davantage de données doivent être recueillies pour démontrer la répétabilité de ce résultat avant de tirer des conclusions. Ce protocole hérite des limites des systèmes MEA, qui présentent généralement des faiblesses provenant de l’enregistrement direct du signal de courant de microélectrode. Bien que le contact direct avec le neurone offre une meilleure sensibilité, il peut altérer la cellule et affecter la précision de la mesure. De plus, en raison de la petite taille des puits, notre système n’inclut pas de tissu périphérique, qui peut également jouer un rôle dans la neuromodulation17. Cela peut limiter l’applicabilité des conclusions tirées de cette configuration aux environnements in vivo . Pour étudier des réponses de réseau plus complexes, un système MEA à densité de canaux plus élevée doit être conçu pour améliorer sa sensibilité18. Plusieurs orientations futures pour ce système proposé ont été identifiées, y compris l’utilisation d’un portique 3D pour maintenir le transducteur et assurer un placement précis19. D’autres améliorations pourraient être apportées à l’algorithme de post-traitement, notamment l’utilisation d’un algorithme de tri par pics20 pour classer les neurones individuels. Ce processus serait bénéfique pour démêler les réponses des neurones multi-unités dans de futures études sur les mécanismes de la FUS. Plus important encore, il est essentiel d’incorporer des modalités de stimulation supplémentaires, telles que des stimuli chimiques, électriques et optiques, pour élucider les mécanismes sous-jacents. Ces méthodes peuvent modifier les propriétés et les comportements neuronaux, par exemple en inhibant des canaux ioniques spécifiques15 ou en modifiant les caractéristiques de la membrane21. En modulant les principaux facteurs au sein de la voie de signalisation hypothétique, les chercheurs peuvent identifier les contributions de chaque facteur dans des environnements contrôlés et, en fin de compte, faire la lumière sur les interactions complexes en jeu.
La stimulation électrique22 est l’une des techniques de neuromodulation les plus établies, avec une longue histoire d’applications réussies dans les milieux cliniques et de recherche. En revanche, la FUS et l’optogénétique23 sont des modalités relativement nouvelles qui ont attiré l’attention ces dernières années. Les principaux avantages du FUS sont son caractère non invasif et sa capacité à stimuler les neurones à des profondeurs qui peuvent être difficiles à atteindre avec d’autres techniques, y compris la stimulation électrique et l’optogénétique. Cependant, comme l’optogénétique24, FUS présente certaines limites liées à la modélisation de la propagation des ondes et des réponses neuronales associées. Saisir la complexité des propriétés acoustiques hétérogènes des tissus in vivo peut être difficile, ce qui entraîne des incertitudes dans le champ de pression et, par conséquent, dans les réponses neuronales. Cette difficulté à modéliser avec précision ces propriétés représente un défi lors de l’optimisation de la technique pour des applications spécifiques dans le monde réel. Les complexités inhérentes soulignent l’importance des systèmes in vitro comme celui de cette étude, car ils permettent l’étude directe des réponses dans des conditions d’intensité acoustique contrôlée.
En conclusion, ce système fournit une plate-forme in vitro à haut débit pour étudier les effets neuro-modulateurs de FUS sur les neurones humains. Avec ce système, les mécanismes d’action de FUS peuvent être explorés en mesurant les réponses électriques des neurones humains lorsqu’ils sont exposés à différents niveaux et types de stimulation dans un environnement contrôlé. Il s’agit donc d’un outil complémentaire précieux aux modèles humains et animaux couramment utilisés sur le terrain.
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel. Amir Manbachi enseigne et est consultant pour BK Medical (GE Healthcare) et Neurosonics Medical et est l’inventeur d’un certain nombre de technologies FUS en instance de brevet. Betty Tyler bénéficie d’un financement de recherche du NIH et est copropriétaire d’Accelerating Combination Therapies (y compris des actions ou des options). Ashvattha Therapeutics Inc. a obtenu une licence pour l’un de ses brevets et elle est actionnaire de Peabody Pharmaceuticals.
Amir Manbachi et Nitish Thakor reconnaissent le soutien financier de la Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA, Contrat d’attribution : N660012024075. En outre, Amir Manbachi remercie le soutien financier du programme de bourses de recherche clinique (KL2) de l’Institut Johns Hopkins pour la recherche clinique et translationnelle (ICTR), administré par le National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) des National Institutes of Health (NIH). Nitish Thakor remercie les National Institutes of Health (NIH) pour leur soutien financier : R01 HL139158-01A1 et R01 HL071568-15.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MEA System | Axion Biosystem Inc. | Maestro Edge | Sampling Rate: 11500 Hz |
MEA Plate | Axion Biosystem Inc. | CytoView MEA | Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells |
Well plate Interface | Amcor Inc. | Parafilm PM996; P7793 | Thickness: 127 µm |
CO2 Tank and Regulator for culture | AirGas Inc./ Harris Inc. | 9296NC | Concentration: 5% |
Culture Media | ThermoFisher Inc. | Laminin; 23017-015 | Concentration: 1 µg/mL |
HiPSC Neurons | Peprotech | CIPS and GM01582 Derived; 450-10 | Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13) |
Transducer | Sonic Concepts Inc. | CTX250; 008 | Center Frequency: 250 kHz |
Matching Network | Sonic Concepts Inc. | CTX250; NFS102v2 | Impedance: 50 Ω |
Transducer Power Output (TPO) | Sonic Concepts Inc. | Version 4.1; 020 | Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz |
Membrane | McMaster Inc. | Silicone Rubber; 5542N115 | Thickness: 0.0127 cm |
Coupling Gel | Parker Laboratory Inc. | Aquasonic 100; B08DDWG GXB | Viscosity: 130,000–185,000 cops |
Connection to Probe holder | McMaster Inc. | Steal Threaded Rod; 90322A661 | Length: 1–1/2" Long |
Centrifuge | ThermoFisher Inc. | Sorvall Legend X1R; 75004261 | Max acceleration: 10–25,830 x g |
Hydrophone | Sonic Concepts Inc. | Y-104; 009 | Range: 50 kHz–1.9 MHz |
Water Tank | Sonic Concepts Inc. | WT | Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm |
Water Conditioning Unit | Sonic Concepts Inc. | WCU; SN006 | Flow Velocity: 50 mL/s maximum |
Oscilloscope | Rohde-Schwarz Inc. | RTC1002 | Sampling rate: Up to 50 MHz |
Stage | Sonic Concepts Inc. | MicroStage; 2 | Accuracy: 1 µm |
Thermochromic sheet | TIPTEMP Inc. | Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337 | Range: 22–24 °C |
Computer | Microsoft Surface | Surface Pro | CPU i5 1035G4: 3.7 GHz |
Data Transfer Software | Mathworks Inc. | MATLAB | Version 2021b |
Processing Software | Python Software Foundation | Python | Version 3.7.10 |
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