Verwendung des MouseWalkers zur Quantifizierung der Dysfunktion des Bewegungsapparates in einem Mausmodell für Rückenmarksverletzungen

Zusammenfassung

Es wird eine experimentelle Pipeline zur quantitativen Beschreibung des Bewegungsmusters von frei gehenden Mäusen mit der MouseWalker (MW) Toolbox bereitgestellt, die von ersten Videoaufnahmen und Tracking bis hin zur Analyse nach der Quantifizierung reicht. Ein Modell für Rückenmarksprellungen bei Mäusen wird verwendet, um die Nützlichkeit des MW-Systems zu demonstrieren.

Zusammenfassung

Die Ausführung komplexer und hochkoordinierter motorischer Programme, wie Gehen und Laufen, ist abhängig von der rhythmischen Aktivierung von spinalen und supraspinalen Schaltkreisen. Nach einer thorakalen Rückenmarksverletzung ist die Kommunikation mit den vorgelagerten Kreisläufen gestört. Dies wiederum führt zu einem Koordinationsverlust mit begrenztem Erholungspotenzial. Um den Grad der Genesung nach der Verabreichung von Medikamenten oder Therapien besser beurteilen zu können, sind daher neue, detailliertere und genauere Instrumente erforderlich, um den Gang, die Koordination der Gliedmaßen und andere feine Aspekte des Bewegungsverhaltens in Tiermodellen für Rückenmarksverletzungen zu quantifizieren. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Assays entwickelt, um das Freilaufverhalten von Nagetieren quantitativ zu bewerten. Ihnen fehlen jedoch in der Regel direkte Messungen in Bezug auf Schrittschrittstrategien, Fußabdruckmuster und Koordination. Um diese Unzulänglichkeiten zu beheben, wird eine aktualisierte Version des MouseWalkers bereitgestellt, die einen frustrierten Totalreflexions-Laufsteg (fTIR) mit Tracking- und Quantifizierungssoftware kombiniert. Dieses Open-Source-System wurde angepasst, um mehrere grafische Ausgaben und kinematische Parameter zu extrahieren, und eine Reihe von Nachquantifizierungswerkzeugen kann zur Analyse der bereitgestellten Ausgabedaten verwendet werden. Dieses Manuskript zeigt auch, wie diese Methode, verbunden mit bereits etablierten Verhaltenstests, Bewegungsdefizite nach Rückenmarksverletzungen quantitativ beschreibt.

Einleitung

Die effektive Koordination von vier Gliedmaßen ist nicht nur bei vierbeinigen Tieren der Fall. Die Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen beim Menschen ist nach wie vor wichtig, um verschiedene Aufgaben zu erfüllen, wie z. B. Schwimmen und Geschwindigkeitsänderungen beim Gehen¹. Verschiedene gliedmaßenkinematische² und motorische Programme ^1,3,4 sowie propriozeptive Rückkopplungskreise⁵ sind zwischen Menschen und anderen Säugetieren konserviert und sollten bei der Analyse von therapeutischen Optionen für motorische Störungen, wie z. B. Rückenmarksverletzungen (SCI)^{6,7,8, berücksichtigt} werden.

Um gehen zu können, müssen mehrere Wirbelsäulenverbindungen von den Vorder- und Hintergliedmaßen richtig verdrahtet und rhythmisch aktiviert werden, was Inputs des Gehirns und Feedback des somatosensorischen Systems erfordert ^2,9,10. Diese Verbindungen gipfeln in den zentralen Mustergeneratoren (CPGs), die sich auf zervikaler und lumbaler Ebene für die Vorder- bzw. Hintergliedmaßen befinden ^1,9,10. Häufig schränken nach einer Rückenmarksverletzung die Störung der neuronalen Konnektivität und die Bildung einer inhibitorischen Glianarbe¹² die Wiederherstellung der Bewegungsfunktion ein, wobei die Ergebnisse je nach Verletzungsschwere von einer vollständigen Lähmung bis hin zu einer eingeschränkten Funktion einer Gruppe von Gliedmaßen variieren. Instrumente zur präzisen Quantifizierung der Bewegungsfunktion nach einer Rückenmarksverletzung sind entscheidend für die Überwachung der Genesung und die Bewertung der Auswirkungen von Behandlungen oder anderen klinischen Interventionen⁶.

Der standardmäßige metrische Assay für Maus-Prellungsmodelle der Rückenmarksverletzung ist die Basso-Maus-Skala (BMS)^13,14, ein nicht-parametrischer Score, der die Rumpfstabilität, die Schwanzposition^, das Plantartreten und die Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen in einem offenen Feld berücksichtigt. Obwohl das BMS in den meisten Fällen äußerst zuverlässig ist, sind mindestens zwei erfahrene Bewerter erforderlich, um alle Winkel der Tierbewegung zu beobachten, um die natürliche Variabilität zu berücksichtigen und Verzerrungen zu reduzieren.

Es wurden auch andere Assays entwickelt, um die motorische Leistung nach einer Rückenmarksverletzung quantitativ zu bewerten. Dazu gehört der Rotarod-Test, bei dem die Zeit gemessen wird, die an einem rotierenden Zylinder¹⁵ verbracht wird; die horizontale Leiter, die die Anzahl der fehlenden Geländer und der positiven Leitergreifer misst^16,17; und der Beam-Walking-Test, der die Zeit misst, die ein Tier benötigt, und die Anzahl der Fehler, die es beim Überqueren eines schmalen Balkens¹⁸ macht. Obwohl es sich um eine Kombination von motorischen Defiziten handelt, liefert keiner dieser Tests direkte lokomotorische Informationen über die Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen.

Um das Gehverhalten spezifisch und gründlicher zu analysieren, wurden weitere Assays entwickelt, um Schrittzyklen und Gangstrategien zu rekonstruieren. Ein Beispiel ist der Fußabdrucktest, bei dem die eingefärbten Pfoten eines Tieres ein Muster über ein weißes Blatt Papier zeichnen¹⁹. Obwohl es einfach in der Ausführung ist, ist das Extrahieren von kinematischen Parametern wie der Schrittlänge umständlich und ungenau. Darüber hinaus schränkt das Fehlen dynamischer Parameter, wie z. B. die Dauer des Schrittzyklus oder die zeitgesteuerte Koordination der Beine, seine Anwendungen ein. In der Tat können diese dynamischen Parameter nur durch die Analyse von Bild-für-Bild-Videos von Nagetieren erfasst werden, die durch eine transparente Oberfläche laufen. Für SCI-Studien haben die Forscher das Gehverhalten aus seitlicher Sicht mit einem Laufband analysiert, einschließlich der Rekonstruktion des Schrittzyklus und der Messung der Winkelvariationen jedes Beingelenks 4,20,21. Auch wenn dieser Ansatz äußerst informativ sein kann⁶, konzentriert er sich auf eine bestimmte Gruppe von Gliedmaßen und es fehlen zusätzliche Gangmerkmale, wie z. B. Koordination.

Um diese Lücken zu schließen, entwickelten Hamers und Kollegen einen quantitativen Test, der auf einem optischen Berührungssensor basiert, der frustrierte interne Totalreflexion (fTIR) ^verwendet22. Bei dieser Methode breitet sich das Licht durch interne Reflexion durch Glas aus, wird beim Pfotendrücken gestreut und schließlich von einer Hochgeschwindigkeitskamera erfasst. In jüngerer Zeit wurde eine Open-Source-Version dieser Methode namens MouseWalker zur Verfügung gestellt, und dieser Ansatz kombiniert einen fTIR-Laufsteg mit einem Tracking- und Quantifizierungssoftwarepaket²³. Mit dieser Methode kann der Benutzer eine große Anzahl quantitativer Parameter extrahieren, darunter Schritt-, Raum- und Gangmuster, Fußabdruckpositionierung und Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen sowie visuelle Ausgaben, wie z. B. Fußabdruckmuster (in Anlehnung an den eingefärbten Pfoten-Assay⁶) oder Standphasen relativ zur Körperachse. Wichtig ist, dass aufgrund des Open-Source-Charakters neue Parameter durch Aktualisieren des MATLAB-Skriptpakets extrahiert werden können.

Hier wird die zuvor veröffentlichte Zusammenstellung des MouseWalker²³ Systems aktualisiert. Es wird eine Beschreibung der Einrichtung mit allen Schritten bereitgestellt, die erforderlich sind, um die beste Videoqualität, die Tracking-Bedingungen und die Parametererfassung zu erreichen. Zusätzliche Werkzeuge nach der Quantifizierung werden ebenfalls zur Verfügung gestellt, um die Analyse des MouseWalker (MW)-Ausgabedatensatzes zu verbessern. Schließlich wird die Nützlichkeit dieses Instruments demonstriert, indem quantifizierbare Werte für die allgemeine Bewegungsleistung, insbesondere für Schrittzyklen und die Koordination von Vordergliedmaßen und Hintergliedmaßen, im Zusammenhang mit einer Rückenmarksverletzung (SCI) ermittelt werden.

Protokoll

Alle Handhabungs-, chirurgischen und postoperativen Pflegeverfahren wurden vom Instituto de Medicina Molecular Internal Committee (ORBEA) und der portugiesischen Tierethikkommission (DGAV) in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Europäischen Gemeinschaft (Richtlinie 2010/63/EU) und dem portugiesischen Tierhaltungsgesetz (DL 113/2013) unter der Lizenz 0421/000/000/2022 genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden weibliche C57Bl/6J-Mäuse im Alter von 9 Wochen verwendet. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der Tiere zu minimieren und das Leiden der in der Studie verwendeten Tiere zu verringern. Das MATLAB-Skript und die Standalone-Version der MW-Software sind Open Source und stehen auf GitHub zur Verfügung
Repositorium (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Während die MW-Software in MATLAB R2012b entwickelt wurde, wurde sie für die Ausführung in MATLAB R2022b angepasst. Abbildung 1 veranschaulicht den Analyse-Workflow des MW.

1. Einrichten des MouseWalker (MW)-Geräts

1. Die MW-Apparatur ist wie zuvor²³ beschrieben zusammenzubauen oder an die spezifischen Anforderungen des Versuchsaufbaus anzupassen (weitere Einzelheiten zum Aufbau finden Sie in der Materialtabelle und in der ergänzenden Abbildung 1 ).
   Anmerkungen: Die Laufarena kann breiter gemacht werden, um größere Tiere, wie z. B. Ratten, unterzubringen.
2. Stellen Sie sicher, dass das Plexiglas, auf dem die Tiere laufen, sauber und kratzfrei ist. Verwenden Sie ein glattes Reinigungstuch und minimieren Sie die Verwendung organischer Lösungsmittel wie Ammoniak oder Ethanol in hohen Konzentrationen, die das Plexiglas beschädigen können (3 % Wasserstoffperoxid, 7 % Ethanol oder ein anderes kompatibles und geeignetes Desinfektionsmittel für Plexiglas wird empfohlen). Tauschen Sie ggf. das Plexiglas aus.
3. Richten Sie die Hochgeschwindigkeitskamera mit einem lichtstarken Objektiv und einer großen Blende (d. h. kleineren Blendenwerten) ein, um eine große Lichtmenge einzufangen, da dies bei der Aufzeichnung der fTIR-Signale hilft (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Das Objektiv sollte keine optischen Verzerrungen erzeugen, insbesondere nicht an den Rändern des Bildes. Optische Verzerrungen können getestet werden, indem ein bekanntes Muster (z. B. Streifen oder Quadrate) aufgezeichnet und dann die Größe der Blöcke auf ImageJ/FIJI²⁴ gemessen wird (verwenden Sie das Linienwerkzeug und klicken Sie dann auf Analysieren > messen). Zum Beispiel sollte ein Quadrat mit einer Größe von 1 cm sowohl in der Mitte des Bildes als auch an den Rändern die gleichen Pixelabmessungen haben. Variationen sollten kleiner als 5 % sein.
4. Beleuchten Sie den mehrfarbigen LED-Lichtstreifen aus dem Hintergrundbeleuchtungskasten.
5. Beleuchten Sie den weißen LED-Lichtstreifen aus dem Gehweg-Leuchtkasten.
   HINWEIS: Eine farbige LED kann auch²⁵ verwendet werden, um die Unterscheidung von Grundfläche/Körper/Hintergrund zu erleichtern.
6. Überprüfen Sie bei ausgeschalteter Raumbeleuchtung die Lichtintensität des Hintergrundbeleuchtungskastens und des Gehwegs. Stellen Sie die Intensität bei Bedarf mit einem Potentiometer oder halbundurchsichtigem Kunststoff ein. Diese müssen so optimiert werden, dass die Pixelintensität in folgender Reihenfolge zunimmt: Körper < Hintergrund des Tieres < Fußabdrücke.
   1. Um die Pixelintensität des Körpers/Hintergrunds/der Fußabdrücke des Tieres zu überprüfen, öffnen Sie die Bildsequenz auf ImageJ/FIJI²⁴ und klicken Sie auf Analyze > Measure. Das Footprint-Signal sollte nicht übersättigt sein, da dadurch verhindert wird, dass die Grenzen des Footprints (d. h. Zehen und Fußballen) definiert werden (ergänzende Abbildung 2).
7. Passen Sie den Bildkontrast des Gehwegs in der Videoaufzeichnungssoftware an. Der Kontrast kann auf zwei Arten eingestellt werden: durch Dimmen oder Erhöhen der Beleuchtung des LED-Streifens oder durch Einstellen der Blende des Kameraobjektivs.
8. Positionieren Sie das Objektiv richtig, um sich auf gleicher Höhe und in der Mitte des 45° reflektierenden Spiegels und senkrecht (90°) zum Gehweg zu befinden. Dadurch wird ein konstant proportionales Bild entlang des Links-Rechts-Gehwegs erzeugt.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Kameraposition (Abstand, Höhe und Ausrichtung) während mehrerer Aufnahmesitzungen zu ändern. Markieren Sie ggf. den Boden, auf dem das Stativ platziert werden soll. Dadurch bleiben die Bildmerkmale erhalten.
9. Fokussieren Sie das Objektiv auf die Oberfläche des Plexiglases. Dies kann mit einem nicht beschädigenden Gegenstand getestet werden, der die Oberfläche des Plexiglases berührt.
   Anmerkungen: Bei niedrigeren Blendenwerten wird die Schärfentiefe kleiner, wodurch das Fokussieren erschwert wird.
10. Stellen Sie sicher, dass alle Einstellungen während des Assays unverändert bleiben, da sie die Pixelintensität der aufgezeichneten Videos verändern können.

2. Video-Akquisition

1. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse vor dem Testen mit dem Raum und dem Gerät vertraut sind. Bewahren Sie mindestens 1 Tag für die Gewöhnung auf (Tag 0). Um übermäßiges Training zu vermeiden, führen Sie den MW-Test an einem anderen Tag als die anderen Verhaltenstests durch (vorzugsweise am Tag danach).
2. Stellen Sie in der Videoaufzeichnungssoftware sicher, dass mindestens 50 cm des Gehwegs sichtbar sind.
3. Passen Sie die Aufnahmeeinstellungen an, um den Gehwegbereich abzuschneiden. Dadurch wird die Videogröße reduziert und die Videoaufnahme optimiert.
4. Machen Sie vor jeder Sitzung ein Foto oder ein kurzes Video von einem normalen Lineal. Die Anzahl der Pixel pro Zentimeter wird später im "Einstellungsfenster" verwendet, um die Videos zu kalibrieren.
5. Starten Sie die Videoaufnahme und legen Sie das Tier an den Rand des Gehwegs, indem Sie die Basis des Schwanzes greifen, um Verletzungen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass sich die Tiere bis zum äußersten Rand der Plattform vorwärts bewegen. Führen Sie die Videoaufnahmen mit mindestens 100 Bildern/s durch, um reibungslose Gangübergänge zu gewährleisten.
   1. Motivieren Sie die Tiere bei Bedarf, sich zu bewegen, indem Sie sanft auf die Gehwegwand klopfen oder mit den Fingern schnippen/klatschen. Vermeiden Sie jedoch physisches Nudging, da dies die Ergebnisse beeinträchtigen kann.
   2. Speichern Sie die Videos direkt als Bildsequenzen im TIFF- (mit LZW-Komprimierung), JPEG- oder PNG-Format. Falls die Kamera als rohe MOV-Datei aufzeichnet, konvertieren Sie die Videos in Bildsequenzen, indem Sie die Datei in ImageJ/FIJI²⁴ öffnen und auf Datei klicken > Als > Bildsequenz speichern (oder eine andere Software wie LosslessCut²⁵ verwenden).
      HINWEIS: Die meisten Tiere beginnen sofort nach dem Setzen auf den Gehweg zu laufen. Daher wird empfohlen, die Videoaufnahme zu starten, bevor Sie das Tier platzieren.

3. Vorbereiten der Videos für die MW-Tracking-Software

1. Filmen Sie genügend komplette Durchläufe jeder einzelnen Maus. Die Anzahl der Tiere, die pro Bedingung gefilmt werden sollen, und die Anzahl der vollständigen Durchläufe müssen je nach Versuchsplanung festgelegt werden. Ein vollständiger Lauf liegt vor, wenn die Maus die gesamten 50 cm des Laufstegs ohne längere Unterbrechungen zurücklegt (in diesem Experiment wurden drei vollständige Läufe ausgewählt).
   HINWEIS: Abhängig von der Bilderfassungssoftware müssen Videos möglicherweise auf den kleinsten ROI zugeschnitten werden. Dadurch wird die Geschwindigkeit der Nachverfolgung und Ausgabegenerierung erhöht.
2. Wählen Sie in ImageJ/FIJI²⁴ die Frames aus, in denen sich die Maus auf dem Bildschirm befindet, indem Sie auf Image > Stack > Tools klicken > Substack erstellen. Das Tracking auf dem MW erfordert, dass der Kopf und das Heck in allen Rahmen sichtbar sind. Es ist jedoch möglich, aus einer einzigen Videoaufnahme mehrere Substacks zu erstellen, die später jeden Durchlauf darstellen.
3. Speichern Sie jeden Teilstapel separat in verschiedenen Ordnern, indem Sie auf Datei > Speichern als > Bildsequenz klicken. Die MW-Software erstellt später automatisch einen Unterordner in jedem Verzeichnis, wenn man mit der Analyse eines Laufs beginnt.

4. Sendungsverfolgung

1. Öffnen Sie MATLAB, fügen Sie den Ordner mit dem MW-Skript zum Arbeitsverzeichnis hinzu und führen Sie "MouseWalker.m" in der Hauptbefehlszeile aus.
   HINWEIS: Die Verwendung der MW-Software unter MATLAB ermöglicht es, Tracking-Fehlermeldungen auf der Hauptkonsole von MATLAB anzuzeigen und die gewünschten Ausgabedaten auszuwählen (indem Sie die Hauptskriptdatei "MouseEvaluate.m" öffnen und die Ausgaben entweder auf 1 oder 0 ändern: die Excel-Datei, Schrittdiagramme, Standspuren und Gangmuster).
2. Laden Sie den Videoordner als "Eingabeverzeichnis". Man kann auch den Ausgabeordner auswählen; Dies ist jedoch keine Voraussetzung, da die MW-Software automatisch einen neuen Ordner namens "Results" im "Input-Verzeichnis" erstellt.
3. Überprüfen Sie mit den Pfeilen "<<", "<", ">>" und ">", ob alle Videobilder korrekt in der MW-Software geladen sind.
4. Gehen Sie zum Fenster "Einstellungen", in dem sich alle Kalibrierungs- und Schwellenwertparameter befinden. Diese Einstellungen können sich unter anderem in Abhängigkeit von der Pixelintensität des Hintergrunds und der Footprints sowie der minimalen Größe des Körpers und der Footprints ändern (siehe Beispiel in der ergänzenden Abbildung 2). Testen Sie die Auswirkungen der Änderung einiger Parameter, indem Sie auf die Schaltfläche Vorschau klicken.
   1. Verwenden Sie die verschiedenen Plotstile, einschließlich "Körper + Füße + Schwanz", "Nur Körper", "Nur Füße" und "Nur Schwanz", um Körperteile nach dem Anpassen der Schwellenwertparameter zu unterscheiden.
   2. Nutzen Sie die Werkzeuge auf der rechten Seite, um die Helligkeit oder Größe zu messen (mit den Tasten "Helligkeit" bzw. "Lineal"). Alle Einstellungen können als "Standard" gespeichert werden, solange der Kameraabstand gleich bleibt.
5. Überprüfen Sie nach dem Anpassen der Schwellenwertparameter, ob das Video für das automatisierte Tracking bereit ist. Gehen Sie zum ersten Frame und klicken Sie auf Auto , um das Tracking zu starten. Dieser Schritt kann in Echtzeit verfolgt werden und dauert je nach Größe des Videos und der Leistung des Computers einige Minuten.
   1. Wenn das automatische Tracking die Körper-Features falsch beschriftet, brechen Sie das automatische Tracking ab, geben Sie neue Einstellungen ein, und starten Sie den Vorgang erneut.
6. Überprüfen Sie nach Abschluss der Nachverfolgung, ob eine manuelle Korrektur erforderlich ist. Verwenden Sie zum Korrigieren das mittlere Feld, um die Auswahl aufzuheben, und geben Sie die Position der Pfotenabdrücke der rechten Vorderseite (RF), der rechten Hinterhand (rechts), der linken Vorderseite (LF) und der linken Hinterhand (LH), des Kopfes, der Nase, des Körpers (in zwei Segmente unterteilt) und des Schwanzes (unterteilt in vier Segmente) an. Speichern Sie die Änderungen, indem Sie auf die Schaltfläche Speichern klicken.
   HINWEIS: Alle Tasten und die meisten Befehle haben eine Tastenkombination (siehe das zugehörige Handbuch für Details²³). Um das Scrollen von Videos und das Ausführen von Tastaturkürzeln zu erleichtern, kann ein Hardware-Controller mit programmierbaren Tasten und einem Shuttle-Rad wie dem Contour ShuttlePro V2 verwendet werden.
7. Klicken Sie auf Auswerten , um die Ausgabedateien aus dem verfolgten Video zu generieren. Je nach gewählter gewünschter Ausgabe (siehe Schritt 4.1) kann dieser Schritt einige Minuten dauern.
8. Vergewissern Sie sich, dass alle grafischen Ausgabedaten im Ordner "Ergebnisse" gespeichert sind. Überprüfen Sie die Genauigkeit des Trackings, indem Sie einige der grafischen Ausgaben untersuchen, wie z. B. die "Stance-Traces", wo Sie überprüfen können, ob alle Pfotenpositionen konsistent sind.
   1. Wenn ein Fehler festgestellt wird, korrigieren Sie das Tracking manuell (wenn möglich, andernfalls löschen Sie den Ordner "Ergebnisse" und führen Sie das automatische Tracking mit neuen Einstellungen erneut durch) und klicken Sie erneut auf den Befehl Auswerten .
9. Vergewissern Sie sich, dass alle von der MW-Software generierten quantitativen Messungen in einer Excel-Tabelle gespeichert und unter "1. Info_Sheet". Stellen Sie sicher, dass die Excel-Optionen für die Formeltrennzeichen mit dem Skript übereinstimmen. Das Dezimaltrennzeichen muss "," sein, und die Tausendertrennzeichen müssen ";" sein.
10. Verwenden Sie das Skript "MouseMultiEvaluate.m", um die Messungen aus allen Durchläufen zur Analyse in einer neuen Datei zusammenzufassen.
    1. Generieren Sie zunächst eine .txt Datei, die die Ordnerpfade für alle Videos enthält (z. B. "Videofiles.txt"). Stellen Sie sicher, dass jede Zeile einem einzelnen Video entspricht.
    2. Schreiben Sie dann "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')" in die Befehlszeile. Im Arbeitsverzeichnis wird eine Excel-Datei mit dem Namen "ResultSummary.xls" generiert (siehe Beispiel im GitHub-Repository).
       HINWEIS: Abbildung 2 zeigt die grafischen Ausgaben, die die MW-Software aus den Videos eines aufgezeichneten Tieres erhält.

5. Arbeitsablauf für die kinematische Datenanalyse

1. Bearbeiten Sie die in Schritt 4.10 generierte Excel-Tabelle, die die Daten für die Verarbeitung mit den bereitgestellten Python-Skripten enthält, gemäß den folgenden Voraussetzungen.
   1. Geben Sie in der ersten Spaltenüberschrift die experimentelle Bedingung an. Benennen Sie jede Zeile nach dem Gruppen-/Bedingungsnamen (Personen aus denselben Gruppen müssen denselben Namen haben). Die erste Gruppe muss das Steuerelement oder die Baseline sein (dies ist nur für das Heatmap-Plotten, Schritt 5.6 obligatorisch).
   2. Geben Sie in der zweiten Spalte die Tier-ID an. Dies ist obligatorisch, obwohl diese Informationen nicht für die Ploterstellung verwendet werden.
   3. Wählen Sie in der dritten Spalte die Motorparameter aus, die für die Analyse verwendet werden sollen. Stellen Sie sicher, dass die erste Zeile der Name des Parameters ist (diese Namen werden später in den Diagrammen angezeigt).
2. Öffnen Sie Anaconda Navigator und führen Sie Spyder aus, um die bereitgestellten Python-Skripte zu öffnen.
   HINWEIS: Alle Skripte wurden mit Python 3.9.13 entwickelt, wurden mit Spyder 5.2.2 in Anaconda Navigator 2.1.4 ausgeführt und sind im Materialverzeichnis und im GitHub-Repository verfügbar (wo zusätzliche Materialien enthalten sind, wie z. B. ein Videobeispiel, eine Excel-Beispieldatei und ein FAQ-Dokument). Es ist möglich, die Skripte außerhalb des Anaconda Navigators auszuführen; Diese grafische Benutzeroberfläche ist jedoch benutzerfreundlicher.
3. Verwenden Sie die "Rawdata_PlotGenerator.py", um die Rohdatendiagramme zu generieren. Dies ermöglicht die Visualisierung jedes Parameters als Funktion der Geschwindigkeit.
   1. Öffnen Sie "Rawdata_PlotGenerator.py" in Spyder und führen Sie den Code aus, indem Sie auf die Schaltfläche "Abspielen " klicken.
   2. Wählen Sie die zu analysierende Excel-Datei und den Blattnamen im automatischen Fenster aus. Wenn der Blattname nicht geändert wurde, schreiben Sie "Tabelle1".
   3. Die Rohdatenplots werden in der Plotkonsole (oben rechts) angezeigt. Um die Plots zu speichern, klicken Sie in der Plotkonsole auf die Schaltfläche Bild speichern oder Alle Bilder speichern .
4. Verwenden Sie das Skript "Residuals_DataAnalysis", um die Residuen für die Datenanalyse zu berechnen. Dieses Skript generiert eine CSV-Datei mit den Berechnungen der Residuen für alle Motorparameter.
   HINWEIS: Viele der gemessenen Gangparameter, die vom MW extrahiert werden, variieren mit der Geschwindigkeit (z. B. Schwunggeschwindigkeit, Schrittlänge, Standdauer, Standgeradheit und Gangindex). Daher wird empfohlen, für das Baseline-Experiment ein Best-Fit-Regressionsmodell für jeden einzelnen Parameter in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit durchzuführen und dann die Residuenwerte für jede Versuchsgruppe in Bezug auf dieses Regressionsmodell zu bestimmen. Die Daten werden dann als Differenz aus der normalisierten Restzeile²⁶ ausgedrückt.
   1. Öffnen Sie "Residuals_DataAnalysis.py" in Spyder und führen Sie den Code aus, indem Sie auf die Schaltfläche "Abspielen " klicken.
   2. Wählen Sie die zu analysierende Excel-Datei und den Blattnamen im automatischen Fenster aus. Wenn der Blattname nicht geändert wurde, schreiben Sie "Tabelle1".
   3. Speichern Sie die CSV-Datei im selben Ordner wie die Daten. Es ist zwingend erforderlich, dass das Steuerelement (oder die Baseline) die erste Gruppe in der Excel-Datei ist.
5. Verwenden Sie das Skript "PCA_PlotGenerator.py", um eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchzuführen.
   ANMERKUNG: Diese unüberwachte Methode zur Reduzierung der Dimensionalität wird verwendet, um eine prägnantere Darstellung^27,28,29 der Daten zu erzeugen (Abbildung 3A, B). Das PCA-Skript umfasst die folgenden Schritte. Die Daten werden zunächst durch Zentrierung und Skalierung vorverarbeitet, danach berechnet der PCA-Algorithmus die Kovarianzmatrix, um die Korrelationen zwischen den Variablen zu bestimmen, und berechnet die Eigenvektoren und Eigenwerte der Kovarianzmatrix, um die Hauptkomponenten zu identifizieren. Die ersten zwei bzw. drei Hauptkomponenten werden für die Darstellung der Daten in 2D- bzw. 3D-Diagrammen ausgewählt. Jeder Punkt in den Diagrammen entspricht einem Tier und stellt eine andere abstrakte Variable dar. Farbcodierte Punkte werden verwendet, um die einzelnen Gruppen zu unterscheiden. Daher spiegeln Punktgruppen ähnliche Laufmuster wider, die von den entsprechenden Individuen geteilt werden.
   1. Öffnen Sie "PCA_PlotGenerator.py" in Spyder und führen Sie den Code aus, indem Sie auf die Schaltfläche " Abspielen" klicken.
   2. Wählen Sie die zu analysierende Excel-Datei und den Blattnamen im automatischen Fenster aus. Wenn der Blattname nicht geändert wurde, schreiben Sie "Tabelle1".
   3. Stellen Sie sicher, dass die PCA-2D- und 3D-Plots in der Plotkonsole (oben rechts) angezeigt werden. Jede Farbe stellt eine andere Gruppe dar, und die Legende wird neben dem Diagramm angezeigt. Um den Plot zu speichern, klicken Sie in der Plotkonsole auf Bild speichern .
6. Verwenden Sie "Heatmap_PlotGenerator.py", um eine Heatmap zu erstellen. Stellen Sie sicher, dass der Heatmap-Generator eine Tabelle erstellt, in der die statistischen Unterschiede zwischen der Basisgruppe (oder Kontrollgruppe) und den anderen Gruppen für jeden Motorparameter²⁷ aufgeführt sind (Abbildung 4). Jede Spalte stellt eine Gruppe dar, und jede Zeile bezieht sich auf einen bestimmten Motorparameter.
   ANMERKUNG: Die statistische Analyse wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA durchgeführt, gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test (für Normalverteilungen) oder einer Kruskal-Wallis-ANOVA gefolgt von einem Post-hoc-Test von Dunn (für Nicht-Normalverteilungen). Ausreißer wurden aus der Analyse ausgeschlossen. P-Werte werden durch einen Farbcode dargestellt, wobei rote und blaue Schattierungen eine Zunahme bzw. Abnahme relativ zur Kontrolle (bzw. zur Basislinie) anzeigen. Der Farbton stellt die statistische Signifikanz dar, wobei dunklere Farben eine höhere Signifikanz und hellere Farben eine geringere Signifikanz aufweisen. entspricht P < 0,001; ** entspricht P < 0,01; und * entspricht P < 0,05. Weiß zeigt keine Abweichung an.
   1. Öffnen Sie "Heatmap_PlotGenerator.py" in Spyder und führen Sie den Code aus, indem Sie auf die Schaltfläche " Abspielen" klicken.
   2. Wählen Sie die zu analysierende Excel-Datei und den Blattnamen im automatischen Fenster aus. Wenn der Blattname nicht geändert wurde, schreiben Sie "Tabelle1".
   3. Wählen Sie im zweiten automatischen Fenster den Datentyp aus: Rohdaten oder Residuendaten. Wenn eine Option nicht ausgewählt ist, sind Residuendaten die Standardeinstellung.
   4. Die Heatmap wird in der Plotkonsole (oben rechts) angezeigt. Um den Plot zu speichern, klicken Sie in der Plotkonsole auf Bild speichern .
      HINWEIS: Es ist zwingend erforderlich, dass das Steuerelement (oder die Baseline) die erste Gruppe in der Excel-Datei ist.
7. Verwenden Sie "Boxplots_PlotGenerator.py", um die Boxplots zu generieren. Dieses Werkzeug ermöglicht die Generierung von Boxplots, die die Verteilung der Werte für alle Motorparameter für jede Gruppe darstellen (Abbildung 5, Abbildung 6 und Abbildung 7).
   HINWEIS: Jedes Kästchen enthält den Median als Mittellinie, und der untere und obere Rand der Kästchen stellen das 25%- bzw. 75%-Quartil dar. Die Whisker stellen den Bereich des vollständigen Datensatzes dar, ohne Ausreißer. Ausreißer sind definiert als jeder Wert, der das 1,5-fache des Interquartilsbereichs unter oder über dem 25%- bzw. 75%-Quartil liegt.
   1. Öffnen Sie "Boxplots_PlotGenerator.py" in Spyder und führen Sie den Code aus, indem Sie auf die Schaltfläche "Abspielen " klicken.
   2. Wählen Sie die zu analysierende Excel-Datei und den Blattnamen im automatischen Fenster aus. Wenn der Blattname nicht geändert wurde, schreiben Sie "Tabelle1".
   3. Wählen Sie im zweiten automatischen Fenster den Datentyp aus: Rohdaten oder Residuendaten. Wenn eine Option nicht ausgewählt ist, sind Residuendaten die Standardeinstellung.
   4. Die Boxplots werden in der Plotkonsole (oben rechts) angezeigt. Um die Plots zu speichern, klicken Sie in der Plotkonsole auf die Schaltfläche Bild speichern oder Alle Bilder speichern .

Ergebnisse

Das Standard-BMS-System beschreibt die grobmotorischen Defizite nach SCI¹⁴. Aufgrund seiner subjektiven Natur werden in der Regel andere quantitative Assays zusammen mit dem BMS durchgeführt, um eine detailliertere und feinere Beurteilung der Fortbewegung zu ermöglichen. Diese Tests liefern jedoch keine spezifischen Informationen über Schrittzyklen, Schrittmuster und die Koordination zwischen Vorder- und Hintergliedmaßen, was äußerst wichtig ist, um zu verstehen, wie die spinalen Schaltkreis...

Diskussion

Hier wird das Potenzial der MouseWalker-Methode durch die Analyse des Bewegungsverhaltens nach Rückenmarksverletzung demonstriert. Es bietet neue Einblicke in spezifische Veränderungen der Schritt-, Fußabdruck- und Gangmuster, die sonst von anderen Standardtests übersehen würden. Neben der Bereitstellung einer aktualisierten Version des MW-Pakets werden die Datenanalysewerkzeuge auch mit den mitgelieferten Python-Skripten beschrieben (siehe Schritt 5).

Da der MW einen großen Datensatz un...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
45º Mirror
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side	Misumi
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side	Misumi
1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long	Misumi
87 x 23 cm mirror	General glass supplier
black cardboard filler	General stationery supplier		We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror
Background backlight
109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick)	General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side	Misumi
multicolor LED strip	General hardware supplier
white opaque paper to cover the plexyglass	General stationery supplier
fTIR Support base and posts
2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height	Misumi
60 x 30 cm metric breadboard	Edmund Optics	#54-641
M6 12 mm screws	Edmund Optics
M6 hex nuts and wahers	Edmund Optics
fTIR Walkway
109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)	General hardware supplier		109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)
109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass)	General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side	Misumi
black cardboard filler	General stationery supplier		we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges
M6 12 mm screws	Edmund Optics
High speed camera (on a tripod)
Blackfly S USB3	FLIR	#BFS-U3-32S4M-C	This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second
Infinite Horizon Impactor
Infinite Horizon Impactor	Precision Systems and Instrumentation, LLC.	#0400
Lens
Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm	Nikon	#1929	This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals
Software
MATLAB R2022b	MathWorks
Python 3.9.13	Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4	Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5	Spyder Project Contributors
Walkway wall
2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm	Any bricolage convenience store
2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height	Any bricolage convenience store
GitHub Materials
Folder name	URL
Boxplots	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots		Script to create Boxplots
Docs	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs		Additional documents
Heatmap	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps		Script to create heatmap
Matlat script	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script		MouseWalker matlab script
PCA	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots		Script to perform Principal Component Analysis
Raw data Plots	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots		Script to create Raw data plots
Residual Analysis	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis		Code to compute residuals from Raw data