Utilizzo di MouseWalker per quantificare la disfunzione locomotoria in un modello murino di lesione del midollo spinale

Riepilogo

Viene fornita una pipeline sperimentale per descrivere quantitativamente il modello locomotore dei topi che camminano liberamente utilizzando il toolbox MouseWalker (MW), che va dalle registrazioni video iniziali e dal tracciamento all'analisi post-quantificazione. Un modello di lesione da contusione del midollo spinale nei topi viene impiegato per dimostrare l'utilità del sistema MW.

Abstract

L'esecuzione di programmi motori complessi e altamente coordinati, come camminare e correre, dipende dall'attivazione ritmica dei circuiti spinali e sovraspinali. Dopo una lesione del midollo spinale toracico, la comunicazione con i circuiti a monte è compromessa. Questo, a sua volta, porta a una perdita di coordinazione, con un potenziale di recupero limitato. Quindi, per valutare meglio il grado di recupero dopo la somministrazione di farmaci o terapie, vi è la necessità di nuovi strumenti più dettagliati e accurati per quantificare l'andatura, la coordinazione degli arti e altri aspetti fini del comportamento locomotore in modelli animali di lesioni del midollo spinale. Diversi saggi sono stati sviluppati nel corso degli anni per valutare quantitativamente il comportamento di camminata libera nei roditori; Tuttavia, di solito mancano misurazioni dirette relative alle strategie di andatura, ai modelli di impronta e alla coordinazione. Per ovviare a queste carenze, viene fornita una versione aggiornata del MouseWalker, che combina una passerella di riflessione interna totale frustrata (fTIR) con un software di tracciamento e quantificazione. Questo sistema open-source è stato adattato per estrarre diversi output grafici e parametri cinematici, e una serie di strumenti di post-quantificazione può essere per analizzare i dati di output forniti. Questo manoscritto dimostra anche come questo metodo, unito a test comportamentali già stabiliti, descriva quantitativamente i deficit locomotori a seguito di lesioni del midollo spinale.

Introduzione

L'efficace coordinazione di quattro arti non è esclusiva degli animali quadrupedi. La coordinazione degli arti anteriori-posteriori nell'uomo rimane importante per svolgere diversi compiti, come il nuoto e le alterazioni della velocità mentre si cammina¹. Varie cinematiche degli arti² e del programma motorio ^1,3,4, così come i circuiti di feedback propriocettivo⁵, sono conservati tra l'uomo e altri mammiferi e dovrebbero essere considerati quando si analizzano le opzioni terapeutiche per i disturbi motori, come la lesione del midollo spinale (SCI)^6,7,8.

Per camminare, diverse connessioni spinali dagli arti anteriori e posteriori devono essere correttamente cablate e attivate ritmicamente, il che richiede input dal cervello e feedback dal sistema somatosensoriale ^2,9,10. Queste connessioni culminano nei generatori di pattern centrali (CPG), che si trovano a livello cervicale e lombare per gli arti anteriori e posteriori, rispettivamente ^1,9,10. Spesso, dopo la SCI, l'interruzione della connettività neuronale e la formazione di una cicatrice gliale inibitoria¹² limitano il recupero della funzione locomotoria, con esiti che variano dalla paralisi totale alla funzione ristretta di un gruppo di arti a seconda della gravità della lesione. Gli strumenti per quantificare con precisione la funzione locomotoria dopo SCI sono fondamentali per monitorare il recupero e valutare gli effetti dei trattamenti o di altri interventi clinici⁶.

Il test metrico standard per i modelli di contusione murina della SCI è la scala del topo Basso (BMS)^13,14, un punteggio non parametrico che considera la stabilità del tronco, la posizione della coda^, il passo plantare e la coordinazione degli arti anteriori-posteriori in un'arena di campo aperto. Anche se il BMS è estremamente affidabile per la maggior parte dei casi, richiede almeno due valutatori esperti per osservare tutti gli angoli del movimento animale al fine di tenere conto della variabilità naturale e ridurre i pregiudizi.

Sono stati sviluppati anche altri test per valutare quantitativamente le prestazioni motorie dopo SCI. Questi includono il test rotarod, che misura il tempo trascorso su un cilindro rotante¹⁵; la scala orizzontale, che misura il numero di ringhiere mancate e pinze positive^16,17; e il beam walking test, che misura il tempo impiegato da un animale e il numero di fallimenti che fa quando attraversa una trave stretta¹⁸. Nonostante rifletta una combinazione di deficit motori, nessuno di questi test produce informazioni locomotorie dirette sulla coordinazione degli arti anteriori-posteriori.

Per analizzare in modo specifico e più approfondito il comportamento della camminata, sono stati sviluppati altri saggi per ricostruire i cicli di passi e le strategie di deambulazione. Un esempio è il test dell'impronta, in cui le zampe inchiostrate di un animale disegnano un motivo su un foglio di carta bianca¹⁹. Sebbene semplice nella sua esecuzione, estrarre parametri cinematici come la lunghezza del passo è ingombrante e impreciso. Inoltre, la mancanza di parametri dinamici, come la durata del ciclo di step o la coordinazione leg-timed, ne limita le applicazioni; In effetti, questi parametri dinamici possono essere acquisiti solo analizzando fotogramma per fotogramma video di roditori che camminano attraverso una superficie trasparente. Per gli studi SCI, i ricercatori hanno analizzato il comportamento a piedi da una vista laterale utilizzando un tapis roulant, compresa la ricostruzione del ciclo dei passi e la misurazione delle variazioni angolari di ciascuna articolazione della gamba 4,20,21. Anche se questo approccio può essere estremamente informativo⁶, rimane focalizzato su un insieme specifico di arti e manca di caratteristiche aggiuntive dell'andatura, come la coordinazione.

Per colmare queste lacune, Hamers e colleghi hanno sviluppato un test quantitativo basato su un sensore tattile ottico che utilizza la riflessione interna totale frustrata (fTIR)²². In questo metodo, la luce si propaga attraverso il vetro attraverso la riflessione interna, si disperde premendo la zampa e, infine, viene catturata da una telecamera ad alta velocità. Più recentemente, è stata resa disponibile una versione open source di questo metodo, chiamata MouseWalker, e questo approccio combina una passerella fTIR con un pacchetto software di tracciamento e quantificazione²³. Utilizzando questo metodo, l'utente può estrarre un ampio set di parametri quantitativi, tra cui modelli di passo, spaziali e di andatura, posizionamento dell'impronta e coordinazione degli arti anteriori-posteriori, nonché output visivi, come i modelli di impronta (imitando il saggio della zampa inchiostrata⁶) o le fasi di posizione rispetto all'asse del corpo. È importante sottolineare che, a causa della sua natura open source, è possibile estrarre nuovi parametri aggiornando il pacchetto di script MATLAB.

Qui viene aggiornato l'assembly pubblicato in precedenza del sistema MouseWalker²³ . Viene fornita una descrizione di come configurarlo, con tutti i passaggi necessari per ottenere la migliore qualità video, le condizioni di tracciamento e l'acquisizione dei parametri. Ulteriori strumenti di post-quantificazione sono inoltre condivisi per migliorare l'analisi del set di dati di output MouseWalker (MW). Infine, l'utilità di questo strumento è dimostrata ottenendo valori quantificabili per le prestazioni locomotorie generali, in particolare i cicli di step e la coordinazione arto anteriore-posteriore, in un contesto di lesione del midollo spinale (SCI).

Protocollo

Tutte le procedure di trattamento, chirurgiche e post-operatorie sono state approvate dal Comitato Interno Molecolare dell'Instituto de Medicina (ORBEA) e dal Comitato Portoghese di Etica degli Animali (DGAV) in conformità con le linee guida della Comunità Europea (Direttiva 2010/63/UE) e la legge portoghese sulla cura degli animali (DL 113/2013) con licenza 0421/000/000/2022. Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57Bl/6J di 9 settimane. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo il numero di animali e per ridurre la sofferenza degli animali utilizzati nello studio. Lo script MATLAB e la versione standalone del software MW sono open-source e sono disponibili su GitHub
repository (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Mentre il software MW è stato sviluppato in MATLAB R2012b, è stato adattato per funzionare in MATLAB R2022b. La Figura 1 illustra il flusso di lavoro di analisi del MW.

1. Configurazione dell'apparato MouseWalker (MW)

1. Assemblare l'apparato MW come descritto in precedenza²³, o adattarlo alle esigenze specifiche del progetto sperimentale (vedere la tabella dei materiali e la figura supplementare 1 per maggiori dettagli sulla configurazione).
   NOTA: L'arena pedonale può essere allargata per ospitare animali più grandi, come i ratti.
2. Verifica che il plexiglass dove camminano gli animali sia pulito e privo di graffi. Utilizzare un panno liscio e ridurre al minimo l'uso di solventi organici come ammoniaca o etanolo in alte concentrazioni, che possono danneggiare il plexiglass (si consiglia il 3% di perossido di idrogeno, il 7% di etanolo o qualsiasi disinfettante compatibile e appropriato per il plexiglass). Se necessario, sostituire il plexiglass.
3. Impostare la fotocamera ad alta velocità con un obiettivo veloce e un'ampia apertura (ad esempio, valori F-stop più piccoli) per catturare una grande quantità di luce, in quanto ciò aiuta a registrare i segnali fTIR (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: l'obiettivo non deve generare distorsioni ottiche, in particolare ai bordi dell'immagine. Le distorsioni ottiche possono essere testate registrando un modello noto (ad esempio, strisce o quadrati) e quindi misurando la dimensione dei blocchi su ImageJ / FIJI²⁴ (utilizzare lo strumento linea e quindi fare clic su Analizza > misura). Ad esempio, un quadrato di 1 cm dovrebbe avere le stesse dimensioni in pixel sia al centro dell'immagine che sui bordi. Le variazioni dovrebbero essere inferiori al 5%.
4. Illuminare la striscia luminosa LED multicolore dalla scatola luminosa di sfondo.
5. Illuminare la striscia luminosa bianca a LED dalla scatola luminosa della passerella.
   NOTA: Un LED colorato può anche essere utilizzato²⁵ per facilitare la distinzione dell'impronta / corpo / sfondo.
6. Con le luci della stanza spente, verificare l'intensità luminosa della scatola luminosa di sfondo e della passerella. Regolare l'intensità, se necessario, utilizzando un potenziometro o una plastica semi-opaca. Questi devono essere ottimizzati in modo che l'intensità dei pixel aumenti nel seguente ordine: corpo dell'animale < sfondo < impronte.
   1. Per controllare l'intensità dei pixel del corpo / sfondo / impronte dell'animale, apri la sequenza di immagini su ImageJ / FIJI²⁴ e fai clic su Analizza > misura. Il segnale di impronta non deve essere troppo saturo, in quanto ciò impedirà la definizione dei confini dell'impronta (cioè dita dei piedi e cuscinetti dei piedi) (Figura supplementare 2).
7. Regolare il contrasto dell'immagine della passerella sul software di registrazione video. Il contrasto può essere regolato in due modi: attenuando o aumentando l'illuminazione sulla striscia LED o regolando l'apertura dell'obiettivo della fotocamera.
8. Posizionare correttamente la lente alla stessa altezza e al centro dello specchio riflettente a 45° e perpendicolare (90°) alla passerella. Ciò genererà un'immagine costantemente proporzionale lungo la passerella sinistra-destra.
   NOTA: evitare di modificare la posizione della videocamera (distanza, altezza e orientamento) tra le sessioni di registrazione multiple. Se necessario, contrassegnare il pavimento in cui posizionare il treppiede. Ciò manterrà le caratteristiche dell'immagine.
9. Focalizzare la lente sulla superficie del plexiglass. Questo può essere testato utilizzando un oggetto non dannoso che tocca la superficie del plexiglass.
   NOTA: con valori di obiettivo F-stop più bassi, la profondità di campo si ridurrà, rendendo così più difficile la messa a fuoco.
10. Assicurati che tutte le impostazioni rimangano inalterate durante il test, poiché potrebbero modificare l'intensità dei pixel dei video registrati.

2. Acquisizione video

1. Assicurarsi che i topi abbiano familiarità con la stanza e l'apparato prima del test. Risparmiare almeno 1 giorno per l'assuefazione (giorno 0). Per evitare un allenamento eccessivo, eseguire il test MW in un giorno diverso dagli altri test comportamentali (preferibilmente il giorno dopo).
2. Nel software di registrazione video, assicurarsi che almeno 50 cm della passerella siano visibili.
3. Regolare le impostazioni di registrazione per troncare la regione della passerella. Ciò ridurrà le dimensioni del video e ottimizzerà l'acquisizione video.
4. Scatta una foto o un breve video di un righello normale prima di ogni sessione. Il numero di pixel per centimetro verrà successivamente utilizzato nella "finestra delle impostazioni" per calibrare i video.
5. Inizia l'acquisizione video e posiziona l'animale sul bordo della passerella afferrando la base della coda per evitare lesioni. Assicurati che gli animali si muovano fino al bordo estremo della piattaforma. Esegui le registrazioni video con almeno 100 fotogrammi / s per garantire transizioni di andatura fluide.
   1. Se necessario, motivare gli animali a muoversi toccando delicatamente la parete della passerella o schioccando / battendo le dita. Tuttavia, evitare spintoni fisici, in quanto ciò potrebbe influire sui risultati.
   2. Salva i video direttamente come sequenze di immagini in formato TIFF (con compressione LZW), JPEG o PNG. Nel caso in cui la fotocamera registri come file MOV grezzo, convertire i video in sequenze di immagini aprendo il file in ImageJ / FIJI²⁴ e facendo clic su File > Salva come sequenza >di immagini (o utilizzando un altro software, come LosslessCut²⁵).
      NOTA: la maggior parte degli animali inizia a camminare subito dopo essere stata messa nella passerella; Pertanto, si consiglia di avviare l'acquisizione video prima di posizionare l'animale.

3. Preparazione dei video per il software di tracciamento MW

1. Filma abbastanza tirature complete di ogni singolo mouse. Il numero di animali da filmare per condizione e il numero di cicli completi devono essere decisi in base a ciascun disegno sperimentale. Una corsa completa è quando il mouse percorre l'intero 50 cm della passerella senza fermate prolungate (in questo esperimento, sono state selezionate tre corse complete).
   NOTA: a seconda del software di acquisizione delle immagini, potrebbe essere necessario ritagliare i video in base al ROI più piccolo. Ciò aumenterà la velocità di tracciamento e generazione dell'output.
2. In ImageJ/FIJI²⁴, selezionare i fotogrammi in cui il mouse è sullo schermo facendo clic su Image > Stack > Tools > Crea un substack. Il tracciamento sul MW richiede che la testa e la coda siano visibili in tutti i telai. È possibile, tuttavia, creare diversi substack da una singola registrazione video, che in seguito rappresenterà ogni esecuzione.
3. Salva ogni substack separatamente in cartelle diverse facendo clic su File > Salva come sequenza >immagine. Il software MW crea automaticamente una sottocartella in ogni directory ogni volta che si inizia ad analizzare un'esecuzione.

4. Tracciamento

1. Apri MATLAB, aggiungi la cartella contenente lo script MW alla directory di lavoro ed esegui "MouseWalker.m" sulla riga di comando principale.
   NOTA: L'utilizzo del software MW in MATLAB consente di visualizzare i messaggi di errore di tracciamento sulla console principale di MATLAB e di selezionare i dati di output desiderati (aprendo il file di script principale "MouseEvaluate.m" e modificando gli output su 1 o 0: il file excel, i grafici dei passi, le tracce di posizione e i modelli di andatura).
2. Carica la cartella video come "Directory di input". Si può anche scegliere la cartella di output; tuttavia, questo non è un requisito in quanto il software MW crea automaticamente una nuova cartella chiamata "Risultati" all'interno della "Directory di input".
3. Utilizzando le frecce "<<", "<", ">>" e ">" controlla se i fotogrammi video sono tutti caricati correttamente all'interno del software MW.
4. Vai alla finestra "Impostazioni" dove si trovano tutti i parametri di calibrazione e soglia. Queste impostazioni possono variare a seconda dell'intensità dei pixel dello sfondo e delle impronte, nonché delle dimensioni minime del corpo e delle impronte, tra gli altri fattori (vedere l'esempio nella Figura supplementare 2). Prova l'effetto della modifica di alcuni parametri facendo clic sul pulsante Anteprima .
   1. Usa i diversi stili di trama, tra cui "corpo + piedi + coda", "solo corpo", "solo piedi" e "solo coda", per aiutare a discriminare le parti del corpo dopo aver regolato i parametri di soglia.
   2. Sfrutta gli strumenti sul pannello di destra per misurare la luminosità o le dimensioni (usando rispettivamente i pulsanti "luminosità" e "righello"). Tutte le impostazioni possono essere salvate come "predefinite" purché la distanza della fotocamera rimanga la stessa.
5. Dopo aver regolato i parametri di soglia, verificare che il video sia pronto per il tracciamento automatico. Vai al primo fotogramma e fai clic su Auto per avviare il monitoraggio. Questo passaggio può essere seguito in tempo reale e richiede alcuni minuti, a seconda delle dimensioni del video e delle prestazioni del computer.
   1. Se il rilevamento automatico etichetta erroneamente le caratteristiche del corpo, annulla il rilevamento automatico, inserisci nuove impostazioni e riavvia il processo.
6. Una volta completato il monitoraggio, controlla se è necessaria una correzione manuale. Per correggere, utilizzare il pannello centrale per selezionare o deselezionare e indicare la posizione delle impronte della zampa anteriore destra (RF), posteriore destra (RH), anteriore sinistra (LF) e posteriore sinistra (LH), testa, naso, corpo (diviso in due segmenti) e posizioni della coda (divisa in quattro segmenti). Salvare le modifiche premendo il pulsante Salva .
   NOTA: tutti i pulsanti e la maggior parte dei comandi hanno una scorciatoia da tasto (controllare il manuale associato per i dettagli²³). Per facilitare lo scorrimento video e l'esecuzione di scorciatoie da tastiera, è possibile utilizzare un controller hardware con pulsanti programmabili e una rotella navetta come il Contour ShuttlePro V2.
7. Fare clic su Valuta per generare i file di output dal video tracciato. A seconda dell'output desiderato selezionato (vedere il passaggio 4.1), questo passaggio può richiedere alcuni minuti.
8. Verificare che tutti i grafici dei dati di output siano salvati nella cartella "Risultati". Verificare l'accuratezza del tracking esaminando alcune delle uscite grafiche, come le "Stance traces", dove è possibile verificare se tutte le posizioni delle zampe sono coerenti.
   1. Se viene identificato un errore, correggere manualmente il rilevamento (se possibile; altrimenti, eliminare la cartella "Risultati" ed eseguire nuovamente il rilevamento automatico con nuove impostazioni) e fare nuovamente clic sul comando Valuta .
9. Verificare che tutte le misure quantitative generate dal software MW siano salvate su un foglio di calcolo Excel e riassunte su "1. Info_Sheet". Verificare che le opzioni di Excel per le delimitazioni delle formule corrispondano allo script. Il separatore decimale deve essere "," e i separatori delle migliaia devono essere ";".
10. Utilizzare lo script "MouseMultiEvaluate.m" per riunire le misurazioni di tutte le esecuzioni in un nuovo file per l'analisi.
    1. Per iniziare, genera un file .txt contenente i percorsi delle cartelle per tutti i video (ad esempio "Videofile.txt"). Assicurati che ogni riga corrisponda a un singolo video.
    2. Quindi, scrivi "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')" nella riga di comando. Un file excel denominato "ResultSummary.xls" verrà generato nella directory di lavoro (vedere un esempio nel repository GitHub).
       NOTA: La Figura 2 rappresenta le uscite grafiche ottenute dal software MW dai video di un animale registrato.

5. Flusso di lavoro di analisi cinematica dei dati

1. Modificare il foglio Excel generato nel passaggio 4.10, che contiene i dati per l'elaborazione utilizzando gli script Python forniti, in base ai seguenti prerequisiti.
   1. Nell'intestazione della prima colonna specificare la condizione sperimentale. Assegnare un nome a ogni riga dopo il nome del gruppo/condizione (gli individui degli stessi gruppi devono avere lo stesso nome). Il primo gruppo deve essere il controllo o la linea di base (questo è obbligatorio solo per il plotting della mappa di calore, passaggio 5.6).
   2. Nella seconda colonna, specificare l'ID animale. Questo è obbligatorio, anche se queste informazioni non verranno utilizzate per la generazione della trama.
   3. Dalla terza colonna in poi, scegliere i parametri del motore che verranno utilizzati per l'analisi. Assicurarsi che la prima riga sia il nome del parametro (questi nomi appariranno in seguito nei grafici).
2. Apri Anaconda Navigator ed esegui Spyder per aprire gli script Python forniti.
   NOTA: Tutti gli script sono stati sviluppati con Python 3.9.13, sono stati eseguiti con Spyder 5.2.2 in Anaconda Navigator 2.1.4 e sono disponibili nella tabella dei materiali e nel repository GitHub (dove sono inclusi materiali aggiuntivi, come un esempio video, un file di esempio excel e un documento FAQ). È possibile eseguire gli script al di fuori di Anaconda Navigator; Tuttavia, questa interfaccia utente grafica è più user-friendly.
3. Utilizzare il "Rawdata_PlotGenerator.py" per generare i grafici di dati non elaborati. Ciò consentirà la visualizzazione di ogni parametro in funzione della velocità.
   1. Apri "Rawdata_PlotGenerator.py" in Spyder ed esegui il codice facendo clic sul pulsante Riproduci .
   2. Selezionare il file Excel da analizzare e il nome del foglio nella finestra automatica. Se il nome del foglio non è stato modificato, scrivere "Foglio1".
   3. I grafici dei dati grezzi appariranno nella console di stampa (pannello in alto a destra). Per salvare i grafici, fare clic sul pulsante Salva immagine o Salva tutte le immagini nella console di stampa.
4. Utilizzare lo script "Residuals_DataAnalysis" per calcolare i residui per l'analisi dei dati. Questo script genererà un file CSV con i calcoli dei residui per tutti i parametri del motore.
   NOTA: Molti dei parametri di andatura misurati estratti dal MW variano con la velocità (ad esempio, velocità di oscillazione, lunghezza del passo, durata della posizione, rettilineità della posizione e indici di andatura). Pertanto, si consiglia di eseguire un modello di regressione ottimale di ogni singolo parametro rispetto alla velocità per l'esperimento di base e quindi di determinare i valori residui per ciascun gruppo sperimentale in relazione a questo modello di regressione. I dati sono quindi espressi come differenza dalla linea normalizzata residua²⁶.
   1. Apri "Residuals_DataAnalysis.py" in Spyder ed esegui il codice facendo clic sul pulsante Riproduci .
   2. Selezionare il file Excel da analizzare e il nome del foglio nella finestra automatica. Se il nome del foglio non è stato modificato, scrivere "Foglio1".
   3. Salvare il file CSV nella stessa cartella dei dati. È obbligatorio che il controllo (o baseline) sia il primo gruppo nel file Excel.
5. Utilizzare lo script "PCA_PlotGenerator.py" per eseguire un'analisi dei componenti principali (PCA).
   NOTA: Questo metodo di riduzione della dimensionalità non supervisionato viene utilizzato per generare una rappresentazione più succinta^{di 27,28,29} dei dati (Figura 3A, B). Lo script PCA include i passaggi seguenti. I dati vengono prima pre-elaborati mediante centraggio e scalamento, dopodiché l'algoritmo PCA calcola la matrice di covarianza per determinare le correlazioni tra le variabili e calcolare gli autovettori e gli autovalori della matrice di covarianza per identificare i componenti principali. I primi due o tre componenti principali sono scelti per la rappresentazione dei dati in grafici 2D o 3D, rispettivamente. Ogni punto nei grafici corrisponde a un animale e rappresenta una variabile astratta diversa. I punti codificati a colori vengono utilizzati per distinguere i gruppi specifici. Come tale, gruppi di punti riflettono modelli di camminata simili condivisi dagli individui corrispondenti.
   1. Apri "PCA_PlotGenerator.py" in Spyder ed esegui il codice facendo clic sul pulsante Riproduci .
   2. Selezionare il file Excel da analizzare e il nome del foglio nella finestra automatica. Se il nome del foglio non è stato modificato, scrivere "Foglio1".
   3. Assicuratevi che i grafici PCA 2D e 3D vengano visualizzati nella console di stampa (pannello in alto a destra). Ogni colore rappresenta un gruppo diverso e la legenda viene visualizzata accanto alla trama. Per salvare la trama, fare clic su Salva immagine nella console di stampa.
6. Usa "Heatmap_PlotGenerator.py" per generare una mappa di calore. Assicurarsi che il generatore di mappe di calore crei una tabella che mostri le differenze statistiche tra il gruppo di base (o gruppo di controllo) e gli altri gruppi per ciascun parametro motore²⁷ (Figura 4). Ogni colonna rappresenta un gruppo e ogni linea si riferisce a un parametro motore specifico.
   NOTA: L'analisi statistica è stata condotta con un ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Tukey (per le distribuzioni normali) o da un ANOVA di Kruskal-Wallis seguito dal test post hoc di Dunn (per le distribuzioni non normali). I valori anomali sono stati esclusi dall'analisi. I valori P sono rappresentati da un codice colore, con sfumature rosse e blu che indicano rispettivamente un aumento o una diminuzione rispetto al controllo (o linea di base). La tonalità di colore rappresenta la significatività statistica, con i colori più scuri che mostrano una significatività più elevata e i colori più chiari che mostrano una significatività inferiore. corrisponde a P < 0,001; ** corrisponde a P < 0,01; e * corrisponde a P < 0,05. Il bianco non indica alcuna variazione.
   1. Apri "Heatmap_PlotGenerator.py" in Spyder ed esegui il codice facendo clic sul pulsante Riproduci .
   2. Selezionare il file Excel da analizzare e il nome del foglio nella finestra automatica. Se il nome del foglio non è stato modificato, scrivere "Foglio1".
   3. Selezionare il tipo di dati nella seconda finestra automatica: dati grezzi o dati residui. Se un'opzione non è selezionata, i dati residui sono l'impostazione predefinita.
   4. La mappa di calore verrà visualizzata nella console di stampa (pannello in alto a destra). Per salvare la trama, fare clic su Salva immagine nella console di stampa.
      Nota : è obbligatorio che il controllo (o linea di base) è il primo gruppo nel file di Excel.
7. Utilizzare "Boxplots_PlotGenerator.py" per generare i boxplot. Questo strumento consentirà la generazione di boxplot che rappresentano la distribuzione dei valori per tutti i parametri del motore per ciascun gruppo (Figura 5, Figura 6 e Figura 7).
   Nota : ogni casella contiene la mediana come linea mediana e i bordi inferiore e superiore delle caselle rappresentano rispettivamente i quartili 25% e 75%. I baffi rappresentano l'intervallo dell'intero set di dati, esclusi i valori anomali. I valori anomali sono definiti come qualsiasi valore pari a 1,5 volte l'intervallo interquartile inferiore o superiore rispettivamente al quartile del 25% e del 75%.
   1. Apri "Boxplots_PlotGenerator.py" in Spyder ed esegui il codice facendo clic sul pulsante Riproduci .
   2. Selezionare il file Excel da analizzare e il nome del foglio nella finestra automatica. Se il nome del foglio non è stato modificato, scrivere "Foglio1".
   3. Selezionare il tipo di dati nella seconda finestra automatica: dati grezzi o dati residui. Se un'opzione non è selezionata, i dati residui sono l'impostazione predefinita.
   4. I boxplot appariranno nella console di stampa (pannello in alto a destra). Per salvare i grafici, fare clic sul pulsante Salva immagine o Salva tutte le immagini nella console di stampa.

Risultati

Il sistema BMS standard descrive i deficit motori lordi dopo SCI¹⁴. A causa della sua natura soggettiva, altri saggi quantitativi vengono generalmente eseguiti insieme al BMS per produrre una valutazione più dettagliata e fine della locomozione. Tuttavia, questi test non riescono a mostrare informazioni specifiche sui cicli di passi, sui modelli di passo e sulla coordinazione degli arti anteriori-posteriori, che è estremamente importante per capire come i circuiti spinali mantengono la funzione ...

Discussione

Qui, il potenziale del metodo MouseWalker è dimostrato analizzando il comportamento locomotore dopo SCI. Fornisce nuove informazioni su specifiche alterazioni nei modelli di passo, impronta e andatura che altrimenti sarebbero sfuggite ad altri test standard. Oltre a fornire una versione aggiornata del pacchetto MW, gli strumenti di analisi dei dati sono descritti anche utilizzando gli script Python forniti (vedere il passaggio 5).

Poiché il MW genera un ampio set di dati e una raccolta di pa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
45º Mirror
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side	Misumi
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side	Misumi
1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long	Misumi
87 x 23 cm mirror	General glass supplier
black cardboard filler	General stationery supplier		We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror
Background backlight
109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick)	General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side	Misumi
multicolor LED strip	General hardware supplier
white opaque paper to cover the plexyglass	General stationery supplier
fTIR Support base and posts
2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height	Misumi
60 x 30 cm metric breadboard	Edmund Optics	#54-641
M6 12 mm screws	Edmund Optics
M6 hex nuts and wahers	Edmund Optics
fTIR Walkway
109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)	General hardware supplier		109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)
109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass)	General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side	Misumi
black cardboard filler	General stationery supplier		we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges
M6 12 mm screws	Edmund Optics
High speed camera (on a tripod)
Blackfly S USB3	FLIR	#BFS-U3-32S4M-C	This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second
Infinite Horizon Impactor
Infinite Horizon Impactor	Precision Systems and Instrumentation, LLC.	#0400
Lens
Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm	Nikon	#1929	This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals
Software
MATLAB R2022b	MathWorks
Python 3.9.13	Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4	Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5	Spyder Project Contributors
Walkway wall
2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm	Any bricolage convenience store
2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height	Any bricolage convenience store
GitHub Materials
Folder name	URL
Boxplots	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots		Script to create Boxplots
Docs	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs		Additional documents
Heatmap	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps		Script to create heatmap
Matlat script	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script		MouseWalker matlab script
PCA	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots		Script to perform Principal Component Analysis
Raw data Plots	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots		Script to create Raw data plots
Residual Analysis	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis		Code to compute residuals from Raw data