Utilizzo di MouseWalker per quantificare la disfunzione locomotoria in un modello murino di lesione del midollo spinale

Riepilogo

Viene fornita una pipeline sperimentale per descrivere quantitativamente il modello locomotore dei topi che camminano liberamente utilizzando il toolbox MouseWalker (MW), che va dalle registrazioni video iniziali e dal tracciamento all'analisi post-quantificazione. Un modello di lesione da contusione del midollo spinale nei topi viene impiegato per dimostrare l'utilità del sistema MW.

Abstract

L'esecuzione di programmi motori complessi e altamente coordinati, come camminare e correre, dipende dall'attivazione ritmica dei circuiti spinali e sovraspinali. Dopo una lesione del midollo spinale toracico, la comunicazione con i circuiti a monte è compromessa. Questo, a sua volta, porta a una perdita di coordinazione, con un potenziale di recupero limitato. Quindi, per valutare meglio il grado di recupero dopo la somministrazione di farmaci o terapie, vi è la necessità di nuovi strumenti più dettagliati e accurati per quantificare l'andatura, la coordinazione degli arti e altri aspetti fini del comportamento locomotore in modelli animali di lesioni del midollo spinale. Diversi saggi sono stati sviluppati nel corso degli anni per valutare quantitativamente il comportamento di camminata libera nei roditori; Tuttavia, di solito mancano misurazioni dirette relative alle strategie di andatura, ai modelli di impronta e alla coordinazione. Per ovviare a queste carenze, viene fornita una versione aggiornata del MouseWalker, che combina una passerella di riflessione interna totale frustrata (fTIR) con un software di tracciamento e quantificazione. Questo sistema open-source è stato adattato per estrarre diversi output grafici e parametri cinematici, e una serie di strumenti di post-quantificazione può essere per analizzare i dati di output forniti. Questo manoscritto dimostra anche come questo metodo, unito a test comportamentali già stabiliti, descriva quantitativamente i deficit locomotori a seguito di lesioni del midollo spinale.

Introduzione

L'efficace coordinazione di quattro arti non è esclusiva degli animali quadrupedi. La coordinazione degli arti anteriori-posteriori nell'uomo rimane importante per svolgere diversi compiti, come il nuoto e le alterazioni della velocità mentre si cammina¹. Varie cinematiche degli arti² e del programma motorio ^1,3,4, così come i circuiti di feedback propriocettivo⁵, sono conservati tra l'uomo e altri mammiferi e dovrebbero essere considerati quando si analizzano le opzioni terapeutiche per i disturbi motori, come la lesione del midollo spinale (SCI)

Protocollo

Tutte le procedure di trattamento, chirurgiche e post-operatorie sono state approvate dal Comitato Interno Molecolare dell'Instituto de Medicina (ORBEA) e dal Comitato Portoghese di Etica degli Animali (DGAV) in conformità con le linee guida della Comunità Europea (Direttiva 2010/63/UE) e la legge portoghese sulla cura degli animali (DL 113/2013) con licenza 0421/000/000/2022. Per il presente studio sono stati utilizzati topi femmina C57Bl/6J di 9 settimane. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo il numero di animali e per ridurre la sofferenza degli animali utilizzati nello studio. Lo script MATLAB e la versione standalone del software MW sono open-s....

Discussione

Qui, il potenziale del metodo MouseWalker è dimostrato analizzando il comportamento locomotore dopo SCI. Fornisce nuove informazioni su specifiche alterazioni nei modelli di passo, impronta e andatura che altrimenti sarebbero sfuggite ad altri test standard. Oltre a fornire una versione aggiornata del pacchetto MW, gli strumenti di analisi dei dati sono descritti anche utilizzando gli script Python forniti (vedere il passaggio 5).

Poiché il MW genera un ampio set di dati e una raccolta di pa.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
45º Mirror
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side	Misumi
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side	Misumi
1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long	Misumi
87 x 23 cm mirror	General glass supplier
black cardboard filler	General stationery supplier		We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror
Background backlight
109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick)	General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side	Misumi
multicolor LED strip	General hardware supplier
white opaque paper to cover the plexyglass	General stationery supplier
fTIR Support base and posts
2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height	Misumi
60 x 30 cm metric breadboard	Edmund Optics	#54-641
M6 12 mm screws	Edmund Optics
M6 hex nuts and wahers	Edmund Optics
fTIR Walkway
109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)	General hardware supplier		109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)
109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass)	General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side	Misumi
black cardboard filler	General stationery supplier		we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges
12 mm screws	Edmund Optics	M6
High speed camera (on a tripod)
Blackfly S USB3	Blackfly	USB3	This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second
Infinite Horizon Impactor
Infinite Horizon Impactor	Precision Systems and Instrumentation, LLC.
Lens
Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm	Nikkon	2.8-4D IF	This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals
Software
MATLAB R2022b	MathWorks
Python 3.9.13	Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4	Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5	Spyder Project Contributors
Walkway wall
2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm	Any bricolage convenience store
2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height	Any bricolage convenience store
GitHub Materials
Folder name	URL
Boxplots	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots		Script to create Boxplots
Docs	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs		Additional documents
Heatmap	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps		Script to create heatmap
Matlat script	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script		MouseWalker matlab script
PCA	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots		Script to perform Principal Component Analysis
Raw data Plots	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots		Script to create Raw data plots
Residual Analysis	https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis		Code to compute residuals from Raw data