JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dem Artikel wird eine neuartige In-vitro-Methode zur schnellen und sensitiven Bewertung der Toxizität und Ökotoxizität von Schadstoffen vorgeschlagen, die auf der Motilität von Mytilus galloprovincialis-Hämozyten basiert. Die Methode soll zur Entwicklung ethischerer und empfindlicherer toxikologischer und ökotoxikologischer Expositionstests beitragen.

Zusammenfassung

Hämozyten sind die zirkulierenden immunkompetenten Zellen in Muscheln und spielen eine Schlüsselrolle bei mehreren wichtigen Funktionen der zellvermittelten angeborenen Immunität. In den frühen Stadien der Immunantwort wandern Hämozyten aktiv zum Infektionsherd. Diese inhärente Motilität ist ein grundlegendes Merkmal dieser Zellen. Es stellt eine zelluläre Schlüsselfunktion dar, die mehrere Prozesse integriert, wie z. B. Zelladhäsion, Zellsignalisierung, Zytoskelettdynamik und Veränderungen des Zellvolumens. Daher können Veränderungen der Zellmotilität nach Exposition gegenüber Arzneimitteln oder Schadstoffen als nützlicher toxikologischer Endpunkt dienen. Trotz der grundlegenden Rolle der Zellmotilität in der Zellphysiologie ist sie aus toxikologischer Sicht nur unzureichend untersucht. In dieser Arbeit wird eine neuartige in vitro Methode zur schnellen und sensitiven Bewertung der Toxizität und Ökotoxizität von Schadstoffen vorgeschlagen, die auf der Bewertung der Hämozytenmotilität von Mytilus galloprovincialis basiert. Wir haben einen Zellmotilitätsassay an Hämozyten entwickelt, die an der Unterseite einer 96-Well-Polystyrol-Mikroplatte haften. Nach der Exposition gegenüber steigenden Konzentrationen von Medikamenten wurden die Zellverläufe und -geschwindigkeiten durch Zellverfolgung unter Zeitraffermikroskopie quantifiziert, was es uns ermöglichte, die Auswirkungen auf die Hämozytenmotilität zu messen. Aufgrund der Leichtigkeit der Hämozytenentnahme aus den Tieren auf relativ nicht-invasive Weise bietet die vorgeschlagene Methode einen alternativen Test zum Screening der Wirkungen und Wirkmechanismen von Schadstoffen und Arzneimitteln. Es steht im Einklang mit den 3R-Kriterien (Replacement, Reduction, and Refinement), geht auf ethische Bedenken ein und trägt zur Reduzierung von In-vivo-Tierversuchen für Wirbeltiere bei.

Einleitung

Wirkungsbasierte Methoden, wie z. B. In-vitro- und In-vivo-Bioassays, stellen innovative Instrumente für den Nachweis der Auswirkungen chemischer Umweltschadstoffe auf lebende Organismen und für ihren Einsatz als Instrumente bei der Umweltüberwachung und Risikobewertungdar 1,2,3,4. Sie ergänzen den klassischen analytisch-chemischen Ansatz, indem sie einige seiner Grenzen überwinden. Mit wirkungsbasierten Methoden können beispielsweise die Bioverfügbarkeit von Schadstoffen, ihre Auswirkungen auf die Gesundheit des Organismus und die kombinierten toxikologischen Wirkungen von Gemischen bewertet werden. Diese kombinierten Effekte sind möglicherweise nicht vorhersehbar, wenn sie ausschließlich auf der chemischen Analyseberuhen 5.

In den letzten Jahren stellte die Ökotoxikologie von neu besorgniserregenden Schadstoffen (neu auftretende Schadstoffe) ein Gebiet dar, in dem wirkungsbasierte Methoden nützliche Instrumente zur Feststellung der Exposition und zur Bewertung der Auswirkungen auf die Biota sein können 1,5,6,7. Bei mehreren wirkungsbasierten Methoden werden Muscheln als Prüforganismen für die Umweltüberwachung und -bewertung verwendet 8,9. Einige Merkmale machen diese Organismen für ökotoxikologische Studien geeignet, wie z. B. ihre weite Verbreitung, ihre filtrierende Natur, ihre sessile Lebensweise, die Fähigkeit zur Bioakkumulation eines breiten Spektrums von Umweltschadstoffen und zur Entwicklung nachweisbarer Reaktionen auf Schadstoffe, die Möglichkeit, mit verschiedenen Lebensstadien zu arbeiten und unter Laborbedingungenzu halten 7. Sie reagieren sehr empfindlich auf Schadstoffbelastung und zeigen je nach Spezies, Lebensstadium und Umweltbedingungen eine Vielzahl von Reaktionen auf toxische Schadstoffe 8,9,10. Daher verwenden mehrere Umweltrichtlinien Muschelarten als standardisierte Testarten10,11.

Unter den Muscheln ist der weit verbreitete Mytilus galloprovincialis eine der am häufigsten verwendeten Arten im ökotoxikologischen Bereich, da er in der Lage ist, frühzeitig nachweisbare Reaktionen auf die Exposition gegenüber chemischer Verschmutzung zu entwickeln, einschließlich Metallothionein-Induktion, Veränderung antioxidativer Enzyme, Destabilisierung der lysosomalen Membran, Lipidperoxidation, Lipofuszinakkumulation, erhöhte Mikrokernfrequenz, Carboanhydrase-Induktion 12,13,14, 15. Datenschutz Hämozyten, die immunkompetenten hämolymphhatischen Zellen, werden häufig verwendet, um die toxikologischen Auswirkungen von Umweltschadstoffen in Muscheln zu untersuchen 4,13,16,17. Diese Zellen sind entscheidend für die Immunantwort des Organismus und erfüllen mehrere wichtige Funktionen der zellvermittelten angeborenen Immunität. Dazu gehören die Eliminierung von Mikroben durch Phagozytose und verschiedene zytotoxische Reaktionen, wie die Freisetzung von lysosomalen Enzymen, antimikrobiellen Peptiden und die Produktion von Sauerstoffmetaboliten während des Atemausbruchs 18,19,20. Hämozyten sind intrinsisch bewegliche Zellen 21,22,23, die in der Lage sind, während des frühen Stadiums der Immunantwort des Organismus an den Ort der Infektion zu wandern. Im Allgemeinen ist die Motilität ein grundlegendes Merkmal, das alle Immunzellen charakterisiert, da sie die Immunüberwachung dieser Zellen zum Schutz des Körpers ermöglicht24. Untersuchungen an verschiedenen Weichtierarten zeigen, dass die Motilität der Hämozyten eine entscheidende Komponente ihrer Immunantwort, der Wundheilung und der Interaktion mit Krankheitserregern ist. Diese Motilität wird durch spezifische molekulare Signalwege reguliert, was die Komplexität und Spezialisierung der Hämozytenfunktionen in Mollusken unterstreicht 21,25,26,27.

Trotz der grundlegenden Bedeutung der Motilität für die Physiologie der Hämozyten haben nur sehr wenige Studien die Empfindlichkeit der Hämozytenmotilität gegenüber chemischen Umweltschadstoffen untersucht 23,28,29,30. Kürzlich charakterisierte unsere Gruppe die spontane Bewegung von Mytilus galloprovincialis-Hämozyten in einer gewebekulturbehandelten Polystyrol-96-Well-Mikroplatte und untersuchte die Empfindlichkeit der Hämozytenmotilität gegenüber einer in vitro-Exposition gegenüber Paracetamol23. Die Hämozyten von M. galloprovincialis zeigten eine zufällige Zellbewegung, die auf Lamellipodien und schnellen Formveränderungen basierte, wie sie zuvor bei einer anderen Muschelart, Mytilus edulis 21,22,23,28, gefunden und bereits bei menschlichen Immunzellen beschrieben wurden31. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Motilität der Hämozyten empfindlich auf chemische Stressoren reagiert23,28. Basierend auf diesen vorangegangenen Erkenntnissen wird in dieser Arbeit eine neuartige in vitro Methode zur schnellen und sensitiven Bewertung der Toxizität und Ökotoxizität von Schadstoffen vorgeschlagen, die auf der Bewertung der Motilität von M. galloprovincialis-Hämozyten und ihrer Veränderungen durch velozimetrische Analyse der Zellmotilität (Quantifizierung der mittleren Geschwindigkeit, der migrierten Entfernung, des euklidischen Abstands und der Direktheit) basiert. Die Methode bietet die Möglichkeit, die Toxizität mehrerer Substanzen in vitro entweder in Kurzzeit-Assays (1-4 h) oder in Langzeit-Expositions-Assays mit einer Dauer von 24-48 h zu screenen.

Protokoll

Alle Versuche wurden im Rahmen der italienischen Tierschutzgesetzgebung (D.L.26/2014) durchgeführt, mit der die Richtlinie des Europäischen Ausschusses (2010/63 EWG) umgesetzt wurde. Mytilus galloprovincialis ist eine filtrierende Muschel, die allgemein als Mittelmeermuschel bekannt ist. Er ist im Mittelmeer und an der Atlantikküste Südeuropas beheimatet. Es wurde eingeführt und ist im westlichen Nordamerika, Asien und Südafrika weit verbreitet. Er ist eine wichtige kommerzielle Fischereiart in mehreren Teilen der Welt. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Aufbereitung von künstlichem Meerwasser (ASTM) oder gefiltertem natürlichem Meerwasser

  1. Für die Aufbereitung von künstlichem Meerwasser ASW nach ASTM D1141-98 (2021)32 lösen Sie folgende Salze in destilliertem Wasser (g für 1 L): 27,65 NaCl, 0,133 NaHCO3, 3,33 MgCl2· 6H2O, 2,66 Na2SO4, 0,733 CaCl2 · 2H2O, 0,466 KCl, 0,067 KBr, 0,02 H3BO3, 0,013 SrCl2,6H 2O, 0,0019 NaF. Die ASW-Lösung hat einen pH-Wert von 7,80.
  2. Für die Aufbereitung von gefiltertem natürlichem Meerwasser (FSW) wird natürliches Meerwasser 37 PSU, das an einem Ort gesammelt wird, der nicht von anthropogenen Aktivitäten betroffen ist, mit 0,2-μm-Filtern gefiltert.

2. Eingewöhnung der Tiere

  1. Adulte Muschelexemplare (Mytilus galloprovincialis Lam.) werden vor der experimentellen Verwendung 24 h lang in statischen Tanks (in Hungerphasen) mit belüftetem ASW oder FSW (1 l/Tier) bei 15 °C in einem thermostatischen Raum akklimatisiert.

3. Reagenzienpräparat zur Beurteilung der Hämozytenmotilität

  1. Bereiten Sie gefiltertes Meerwasser (FSW) wie oben oder physiologische Standardkochsalzlösung (SPS) vor. HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure) 4,77 g, NaCl 25,48 g, MgSO4 13,06 g, KCl 0,75 g, CaCl2 1,47 g in ca. 800 ml destilliertem Wasser auflösen und dann durch Zugabe von mehr destilliertem Wasser auf 1 l auffüllen. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 7,36 ein.
  2. Bereiten Sie eine neutralrote Stammlösung von 20 mg/ml in Dimethylsulfoxid (DMSO) vor.
  3. Neutralrot-Färbelösung vorbereiten: Fügen Sie 5 μl einer neutralroten Stammlösung zu 995 μl FSW oder SPS hinzu.
  4. Bereiten Sie FSW oder SPS zu, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 40 I.E./ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin, wie folgt vor: Fügen Sie 100 μl 2 mM L-Glutamin und 100 μl Penicillin/Streptomycin-Mischung zu 10 mL FSW/SPS hinzu.
  5. Bereiten Sie 0,4% Trypanblau in FSW oder SPS vor.
    HINWEIS: Die neutrale rote Stammlösung wurde nach Martínez-Gómez et al.33 hergestellt. Die Neutral Red Stammlösung hält sich bei 4 °C Lagerung ca. 2-3 Wochen. Neutral Red Färbelösung und 0,4 % Trypanblau sollten kurz vor dem Assay hergestellt werden.

4. Hämolymph-Probenahme

  1. Füllen Sie eine Spritze mit 0,5 mL gefiltertem Meerwasser FSW oder physiologischer Standardkochsalzlösung SPS (bei 15 °C) vor.
  2. Hebeln Sie die Klappen entlang der Bauchfläche mit einem Skalpell leicht und vorsichtig auseinander. Halten Sie das Skalpell in Position oder verwenden Sie eine Pipettenspitze. Lassen Sie die Nadel einer Injektionsspritze in den Raum zwischen den Ventilen eindringen.
  3. Entnehmen Sie vorsichtig 0,5 ml Hämolymphe aus dem hinteren Adduktorenmuskel mit der Fertigspritze gemäß UNEP/RAMOGE34.
  4. Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze und geben Sie den Inhalt der Spritze in ein Mikroröhrchen.
  5. Sammeln Sie die Hämolymphe von 3-4 Muscheln und sammeln Sie die Hämolymphproben in einem Röhrchen bei 15 °C im gleichen Verhältnis zwischen den Individuen.
    HINWEIS: Die Vorfüllung der Spritze wird verwendet, um die Hämolymphe während der Probenahme sofort 1:1 zu verdünnen. Die Verdünnung der Hämolymphe mit FSW oder SPS im Verhältnis 50:50 wird häufig verwendet, um die Aggregation von Hämozyten zu verhindern, so Martínez-Gómez et al.33.

5. Hämozytenplattierung und -kultur

  1. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
  2. Verdünnen Sie die Hämolymphe in einer Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml mit FSW oder SPS.
  3. Bewerten Sie die Lebensfähigkeit von Hämozyten in Suspension durch Trypanblau-Färbung: Geben Sie 100 μl 0,4 % Trypanblau, gelöst in FSW oder SPS, zu 100 μl Hämozytensuspension. 5 min bei 15 °C inkubieren.
  4. Geben Sie anschließend einen Tropfen Suspension in ein Hämozytometer und zählen Sie die ungefärbten (lebensfähigen) und gefärbten (nicht lebensfähigen) Zellen unter mikroskopischer Beobachtung.
  5. Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Hämozyten als Prozentsatz lebensfähiger Zellen, berechnet auf die Gesamtzahl der gezählten Zellen35.
  6. Verwenden Sie die folgende Formel für die Bewertung der Zellviabilität35:
    Lebensfähige Zellen (%) = [Anzahl lebensfähiger Zellen/Gesamtzahl der Zellen (lebensfähig + nicht lebensfähig)] x 100
  7. Stellen Sie sicher, dass die Lebensfähigkeit der Hämozyten höher als 95 % sein sollte, um im weiteren Verlauf des Protokolls fortzufahren.
  8. Geben Sie 50 μl verdünnte Hämolymphe in jede Vertiefung einer mit TC behandelten Zellkultur-Mikroplatte mit 96 Well aus Polystyrol mit flachem Boden. Decken Sie den Teller mit dem Deckel ab.
  9. Lassen Sie die Hämozyten 30 Minuten lang bei 15 °C am Boden der Vertiefungen haften, um eine Monoschicht zu bilden.
  10. Entfernen Sie die überschüssige Hämolymphe, indem Sie vorsichtig mit einer Mikropipette aspirieren.

6. Kurzzeit-Assay

  1. Für Kurzzeit-Assays (innerhalb von 1-4 h) inkubieren Sie die am Boden der Vertiefungen haftenden Zellen sofort mit 100 μl der in FSW oder SPS gelösten Substanz von Interesse in unterschiedlichen Konzentrationen bei 15 °C. Verwenden Sie mindestens drei Vertiefungen für drei Wiederholungsbestimmungen jeder Versuchsbedingung.
  2. Beurteilen Sie nach der Inkubation die Zellmotilität gemäß Schritt 8.

7. Assay bei längerer Exposition

  1. Bei längerer Exposition, d. h. 24-48 h Expositionsassays, inkubieren Sie die kultivierten adhärenten Zellen mit steigenden Konzentrationen der im Kulturmedium gelösten Prüfsubstanz (FSW oder ASW), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 40 IE/ml, Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin) bei 15 °C. Verwenden Sie mindestens drei Vertiefungen für drei Wiederholungsbestimmungen jeder Versuchsbedingung.
  2. Beurteilen Sie nach der Inkubation die Zellmotilität gemäß Schritt 8.

8. Beurteilung der Zellmotilität durch Zeitraffermikroskopie

  1. Setzen Sie die Multiwell-Platte mit den adhärenten lebenden Hämozyten in einen Multimode-Reader ein.
  2. Beurteilen Sie die Beweglichkeit der adhärenten lebenden Zellen durch Echtzeit-Bildgebung auf der Platte durch Zeitraffermikroskopie: Nehmen Sie Bilder derselben Region of Interest (ROI) (Dimension des verwendeten ROI: 720 μm x 720 μm) in jeder Vertiefung mit einer Rate von 1 Bild alle 1 Minute für 10 Minuten mit dem Multimode-Reader unter 20-facher Vergrößerung und Farbhellfeldvisualisierung auf.
  3. Zur besseren Visualisierung der Blutröhren färben Sie die Zellen kurz vor dem Zeitraffermikroskop wie folgt mit dem Vitalfarbstoff Neutralrot:
    1. Entfernen Sie das Inkubationsmedium aus jeder Vertiefung.
    2. 100 μl Färbelösung von Neutralrot, gelöst in physiologischer Standardkochsalzlösung, die die interessierende Substanz enthält, in die Vertiefungen der Platte mit den adhärenten Zellen geben.
    3. Inkubieren Sie die Zellen bei 15 °C für 15 min. Wasche den überschüssigen Farbstoff aus.
    4. Es werden 100 μl der in FSW oder SPS gelösten Substanz von Interesse zugegeben. Visualisieren Sie die Zellen für die Beurteilung der Beweglichkeit.
      HINWEIS: Die Verwendung eines Multimode-Readers ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von Bildern aus einer großen Anzahl von Wells, wodurch die gleichzeitige Motilitätsdetektion aller experimentellen Bedingungen und Replikate, die in der Vertiefung enthalten sind, ermöglicht wird. Der neutralrote Farbstoff bleibt in den Lysosomen erhalten, die als kleine orangefarbene Flecken im Zytoplasma erscheinen, während der Zellkern als durchscheinendes Loch erscheint, da er nicht durch den Acidophilus-Vitalfarbstoff verfärbt wird. Die Bildaufnahme erfolgte für 10 min bei einer Raumtemperatur von 20 °C.

9. Berechnung der Zellverfolgung und der velozimetrischen Parameter

  1. Analysieren Sie die Frames desselben interessierenden Bereichs, die unter Zeitraffermikroskopie von Bild J für jedes Well aufgenommen wurden.
  2. Speichern Sie die Bilder in einem Ordner ohne Leerzeichen im Namen. Die Bilder können entweder im JPEG- oder PNG-Format vorliegen.
  3. Öffnen Sie ImageJ. Klicken Sie auf Datei > Importieren > Bildsequenz.
  4. Führen Sie die Zellverfolgung für einzelne Zellen mit dem Plug-In "Manuelle Verfolgung" von ImageJ durch. Die Positionen der einzelnen Zellen werden in aufeinanderfolgenden Bildern markiert, so dass Positionsänderungen im Laufe der Zeit verfolgt werden können.
  5. Analysieren Sie mindestens 40 Zellen pro Well, wobei Zellen, die aus dem aufgezeichneten Feld ausweichen, aus der Analyse ausgeschlossen werden.
  6. Importieren Sie Datensätze aus dem ImageJ-Plug-in "Manual Tracking" in die frei verfügbare Software Chemotaxis und Migration Tool.
  7. Quantifizieren Sie velozimetrische Parameter, wie z. B. mittlere Geschwindigkeit, euklidische Entfernung, migrierte Entfernung und Direktheit unter Verwendung der Software Chemotaxis and Migration Tool gemäß den detaillierten Anweisungen in der frei verfügbaren Bedienungsanleitungder Software 36oder den unten angegebenen Schritten:
    1. Importieren Sie Datensätze aus dem ImageJ-Plug-in "Manuelles Tracking" in die Software Chemotaxis and Migration Tool.
    2. Wählen Sie die gewünschte Anzahl von Slices aus (z. B. die Anzahl der Bilder, die für das Tracking verwendet werden).
    3. Kalibrieren Sie die Software, indem Sie die x/y-Pixelgröße und das Zeitintervall einstellen. Die x/y-Kalibrierung gibt die Kantenlänge eines Pixels in μm an, während das Zeitintervall die Dauer zwischen den einzelnen Schichten darstellt.
    4. Nachdem Sie die Werte und Parameter angepasst haben, klicken Sie auf Einstellungen übernehmen.
    5. Plotten Sie Trajektorien und exportieren Sie sie als Bild. Klicken Sie auf die Schaltfläche Messwerte , um die Messwerte anzuzeigen. Speichern Sie es.
    6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistik und speichern Sie die Geschwindigkeit und Direktheit der Spurserie.
  8. Die für Kontrollzellen berechneten velozimetrischen Parameter sind mit denen von Hämozyten zu vergleichen, die der Prüfsubstanz in unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt waren.
    HINWEIS: Die migrierte Entfernung (gemessen in μm) bezieht sich auf die Länge des Migrationspfads während des Beobachtungszeitraums (10 min). Der euklidische Abstand (auch in μm gemessen) stellt den geradlinigen Abstand zwischen dem Startpunkt und dem Endpunkt der Zelle dar. Die mittlere Geschwindigkeit (ausgedrückt in μm min-1) wird als Verhältnis der migrierten Entfernung zur Dauer der Zellverfolgung für jede Zelle berechnet. Die Direktheit ist definiert als das Verhältnis der euklidischen Entfernung zur akkumulierten Entfernung für jede Trajektorie.

Ergebnisse

Die Studie stellt eine neuartige in vitro-Methode zur schnellen und sensitiven Bewertung der Toxizität und Ökotoxizität von Schadstoffen vor, wobei die Motilität von Mytilus galloprovincialis-Hämozyten genutzt wird. Abbildung 1A-C zeigt eine repräsentative Zeitraffer-Bildgebung von Hämozyten nach 30-minütiger Anheftung an den Boden der Vertiefung. Die Zellen in der Abbildung wurden kurz vor der Moti...

Diskussion

Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll stellt eine neuartige In-vitro-Methode dar, die für die schnelle und empfindliche Bewertung der Toxizität von Arzneimitteln und Schadstoffen auf der Grundlage der Bewertung der Motilität von M. galloprovincialis-Hämozyten und ihrer Veränderungen geeignet ist. Motilität ist ein besonderer Aspekt der Immunfunktion dieser Zellen 21,22,23,37,38, daher kann jede Veränderung der Zellmotilität auf Veränderungen in der Immunf...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch das Projekt "Dipartimento di Eccellenza" finanziert, das DiSTeBA vom italienischen Ministerium für Universität und Forschung, CUP: F85D18000130001, und vom NBFC (National Biodiversity Future Center) gefördert wurde, das von der Europäischen Union NextGenerationEU, PNRR, Projekt n. CN00000033, finanziert wurde. Wir danken auch der BIOforIU-Infrastruktur an der Fakultät für Bio- und Umweltwissenschaften und -technologien der Universität Salento.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm filter (diameter 25 mm)ABLUO labware
2.5 ml hypodermic syringe needdle 22GRays2522CM32labware
96-well flat-bottom polystyrene TC-treated microplateCorning3916labware
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KGChemical
Chemotaxis and Migration Tool software (Ibidi GmbH)software
Cytation 5 Agilent BioTeckCytation 5Equipment: Cell imaging multimode reader
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merk (Sigma - Aldrich) 472301Solvent
Falcon 15 mL Tube Conical BottomCorning352196labware
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394Chemical
Hemocytometer Fast read 102BiosigmaBVS100labware
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid)Merk (Sigma - Aldrich) H3375-500GChemical
ImageJ softwareNIHsoftware
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Chemical
KClMerk 104936Chemical
L-glutamineMerk (Sigma - Aldrich) G7513Essential amino acid for cell culture medium
MgCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) M2670Chemical
MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) M7506Chemical
Microscope Nikon Eclipse E600NikonEquipment: Cell imaging 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemical
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-RChemical
NaFFluka71519 500gChemical
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KGChemical
Neutral RedMerk (Sigma - Aldrich) N4638-1GVital cell dye
Penicillin/StreptomycinMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLAntibiotics for cell culture
SrCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) 255521Chemical
Trypan blue Merk (Sigma - Aldrich) T8154Cell dye

Referenzen

  1. Di Paolo, C., et al. Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring. Water Res. 104, 473-484 (2016).
  2. Brack, W., et al. Effect-based methods are key. The European Collaborative Project SOLUTIONS recommends integrating effect-based methods for diagnosis and monitoring of water quality. Environ Sci Eur. 31 (1), 10 (2019).
  3. Lionetto, M. G., Caricato, R., Erroi, E., Giordano, M. E., Schettino, T. Potential application of carbonic anhydrase activity in bioassay and biomarker studies. Chem Ecol. 22 (sup1), S119-S125 (2006).
  4. Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E. Pollution biomarkers in the framework of marine biodiversity conservation: State of art and perspectives. Water. 13 (13), 1847 (2021).
  5. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).
  6. Fabbri, E., Valbonesi, P., Moon, T. W., León, V. M., Bellas, J. Pharmaceuticals in the marine environment: Occurrence, fate, and biological effects. Contaminants of Emerging Concern in the Marine Environment. Chapter 2, 11-71 (2023).
  7. Lionetto, F., et al. Autofluorescence of model polyethylene terephthalate nanoplastics for cell interaction studies. Nanomaterials. 12 (9), 1560 (2022).
  8. Damiens, G., Gnassia-Barelli, M., Loquès, F., Roméo, M., Salbert, V. Integrated biomarker response index as a useful tool for environmental assessment evaluated using transplanted mussels. Chemosphere. 66 (3), 574-583 (2007).
  9. Ogidi, O. I., Onwuagba, C. G., Richard-Nwachukwu, N., Izah, S. C., Ogwu, M. C., Hamidifar, H. Biomonitoring tools, techniques and approaches for environmental assessments. Biomonitoring of Pollutants in the Global South. , (2024).
  10. Rosner, A., et al. A broad-taxa approach as an important concept in ecotoxicological studies and pollution monitoring. Biol Rev. 99 (1), 131-176 (2024).
  11. Gagné, F., Burgeot, T. Bivalves in ecotoxicology. Encyclopedia of Aquatic Ecotoxicology. , 247-258 (2013).
  12. Caricato, R., et al. Carbonic anhydrase integrated into a multimarker approach for the detection of the stress status induced by pollution exposure in Mytilus galloprovincialis: A field case study. Sci Total Environ. 690, 140-150 (2019).
  13. Calisi, A., et al. Morphological and functional alterations in hemocytes of Mytilus galloprovincialis exposed in high-impact anthropogenic sites. Mar Environ Res. 188, 105988 (2023).
  14. Viarengo, A., Burlando, B., Evangelisti, V., Mozzone, S., Dondero, F., Garrigues, F., Barth, H., Walker, C. H., Narbonne, J. F. Sensitivity and specificity of metallothionein as a biomarker for aquatic environment biomonitoring. Biomarkers in Marine Organisms. , 29-43 (2001).
  15. Bocchetti, R., et al. Contaminant accumulation and biomarker responses in caged mussels, Mytilus galloprovincialis, to evaluate bioavailability and toxicological effects of remobilized chemicals during dredging and disposal operations in harbor areas. Aquat Toxicol. 89 (3), 257-266 (2008).
  16. Calisi, A., Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E., Schettino, T. Morphometric alterations in Mytilus galloprovincialis granulocytes: A new biomarker. Environ Toxicol Chem. 26 (6), 1435-1441 (2007).
  17. Burgos-Aceves, M. A., Faggio, C. An approach to the study of the immunity functions of bivalve haemocytes: Physiology and molecular aspects. Fish Shellfish Immunol. 67 (6), 513-517 (2017).
  18. Canesi, L., et al. Tyrosine kinase-mediated cell signaling in the activation of Mytilus hemocytes: Possible role of STAT-like proteins. Biol Cell. 95 (9), 603-613 (2003).
  19. Novas, A., Barcia, R., Ramos-Martínez, J. I. Nitric oxide production by hemocytes from Mytilus galloprovincialis shows seasonal variations. Fish Shellfish Immunol. 23 (4), 886-891 (2007).
  20. Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components. Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).
  21. Le Foll, F., et al. Characterization of Mytilus edulis hemocyte subpopulations by single-cell time-lapse motility imaging. Fish Shellfish Immunol. 28 (2), 372-386 (2010).
  22. Rioult, D., Lebel, J. -. M., Le Foll, F. Cell tracking and velocimetric parameters analysis as an approach to assess activity of mussel (Mytilus edulis) hemocytes in vitro. Cytotechnology. 65 (5), 749-758 (2013).
  23. Udayan, G., Giordano, M. E., Pagliara, P., Lionetto, M. G. Motility of Mytilus galloprovincialis hemocytes: Sensitivity to paracetamol in vitro exposure. Aquat Toxicol. 265, 106779 (2023).
  24. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  25. Ivanina, A., Falfushynska, H., Beniash, E., Piontkivska, H., Sokolova, I. Biomineralization-related specialization of hemocytes and mantle tissues of the Pacific oyster Crassostrea gigas. J Exp Biol. 220 (18), 3209-3221 (2017).
  26. Furukawa, F., et al. Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai. Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).
  27. Lau, Y., Gambino, L., Santos, B., Espinosa, E., Allam, B. Regulation of oyster (Crassostrea virginica) hemocyte motility by the intracellular parasite Perkinsus marinus: A possible mechanism for host infection. Fish Shellfish Immunol. 78, 18-25 (2018).
  28. Gendre, H., et al. Modulation of hemocyte motility by chemical and biological stresses in Mytilus edulis and Dreissena polymorpha. Fish Shellfish Immunol. 139, 108919 (2023).
  29. Kaloyianni, M., et al. Oxidative effects of inorganic and organic contaminants on haemolymph of mussels. Comp Biochem Physiol C: Toxicol Pharmacol. 149 (4), 631-639 (2009).
  30. Sendra, M., et al. Nanoplastics: From tissue accumulation to cell translocation into Mytilus galloprovincialis hemocytes. Resilience of immune cells exposed to nanoplastics and nanoplastics plus Vibrio splendidus combination. J Hazard Mater. 388, 121788 (2020).
  31. Pizzagalli, D. U., Pulfer, A., Thelen, M., Krause, R., Gonzalez, S. F. In vivo motility patterns displayed by immune cells under inflammatory conditions. Front Immunol. 12, 804159 (2021).
  32. ASTM D1141-98. . Standard Practice for Preparation of Substitute Ocean Water. , (2021).
  33. Martínez-Gómez, C., Bignell, J., Lowe, D. Lysosomal membrane stability in mussels. ICES Techniques in Marine Environmental Sciences. 56, 1-41 (2015).
  34. UNEP/RAMOGE. Manual on the biomarkers recommended for the MED POL Biomonitoring Programme. UNEP. , (1999).
  35. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  36. Asano, Y., Horn, E. . Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0 Version 1.1. , (2013).
  37. Wilkinson, J. L., et al. Pharmaceutical pollution of the world's rivers. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (8), e2113947119 (2022).
  38. Parisi, M. G., Pirrera, J., La Corte, C. Effects of organic mercury on Mytilus galloprovincialis hemocyte function and morphology. J Comp Physiol B. 191 (1), 143-158 (2021).
  39. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  40. Bailly, M., Condeelis, J. Cell motility: Insights from the backstage. Nat Cell Biol. 4 (5), E292-E294 (2002).
  41. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).
  42. Mosca, F., et al. Effects of high temperature and exposure to air on mussel (Mytilus galloprovincialis, Lmk 1819) hemocyte phagocytosis: Modulation of spreading and oxidative response. Tissue Cell. 45 (3), 198-203 (2013).
  43. Beaudry, A., et al. Effect of temperature on immunocompetence of the blue mussel (Mytilus edulis). J Xenobiot. 6 (1), 5889 (2016).
  44. Wu, F., et al. Combined effects of seawater acidification and high temperature on hemocyte parameters in the thick shell mussel Mytilus coruscus. Fish Shellfish Immunol. 56, 554-562 (2016).
  45. Schmeisser, S., et al. New approach methodologies in human regulatory toxicology - Not if, but how and when. Environ Int. 178, 108082 (2023).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

BiologieAusgabe 214Mytilus GalloprovincialisH mozytenZellmotilit tImmunantwortZelladh sionArzneimittelexpositionSchadstoffwirkungenMikroplatten AssayZeitraffermikroskopieZellverfolgung3R Kriteriennicht invasive Sammlung

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten