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요약

이 논문은 Mytilus galloprovincialis hemocytes의 운동성을 기반으로 오염 물질의 독성 및 생태 독성을 빠르고 민감하게 평가하기 위한 새로운 체외 방법을 제안합니다. 이 방법은 보다 윤리적이고 민감한 독성 및 생태 독성 노출 테스트의 개발에 기여하는 것을 목표로 합니다.

초록

혈구는 이매패류 연체동물에서 순환하는 면역 역량 세포이며 세포 매개 선천성 면역의 몇 가지 중요한 기능에서 중요한 역할을 합니다. 면역 반응의 초기 단계에서 혈구는 감염 부위로 적극적으로 이동합니다. 이러한 타고난 운동성은 이러한 세포의 근본적인 특성입니다. 이는 세포 부착, 세포 신호, 세포골격 역학 및 세포 부피의 변화와 같은 여러 프로세스를 통합하는 핵심 세포 기능을 나타냅니다. 따라서 약물 또는 오염 물질에 노출된 후 세포 운동성의 변화는 유용한 독성학적 종말점으로 작용할 수 있습니다. 세포 생리학에서 세포 운동성의 근본적인 역할에도 불구하고 독성학적 관점에서 제대로 조사되지 않았습니다. 이 연구는 Mytilus galloprovincialis의 혈구 운동성 평가를 기반으로 오염 물질의 독성 및 생태 독성을 빠르고 민감하게 평가하기 위한 새로운 체외 방법을 제안합니다. 우리는 96웰 폴리스티렌 마이크로플레이트의 바닥에 부착된 혈구에 대한 세포 운동성 분석을 개발했습니다. 증가하는 농도의 약물에 노출된 후 타임 랩스 현미경 검사에서 세포 추적을 통해 세포 궤적 및 속도를 정량화하여 혈구 운동성에 미치는 영향을 측정할 수 있었습니다. 상대적으로 비침습적인 방식으로 동물로부터 적혈구 수집이 용이하기 때문에 제안된 방법은 오염 물질 및 약물의 영향 및 작용 메커니즘을 스크리닝하기 위한 대체 테스트를 제공합니다. 이는 3R(Replacement, Reduction, and Refinement) 기준에 부합하여 윤리적 문제를 해결하고 척추동물 생체 내 동물 실험의 감소에 기여합니다.

서문

in vitro 및 in vivo bioassay와 같은 효과 기반 방법은 살아있는 유기체에서 환경 화학 오염 물질의 영향을 감지하고 환경 모니터링 및 위험 평가의 도구로 사용하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다 1,2,3,4. 이는 몇 가지 한계를 극복함으로써 고전적인 분석 화학 접근 방식을 보완합니다. 예를 들어, 효과 기반 방법은 오염 물질의 생체 이용률, 유기체 건강에 미치는 영향 및 혼합물의 결합된 독성학적 영향을 평가할 수 있습니다. 이러한 복합적인 효과는화학적 분석5만으로는 예측할 수 없다.

최근 몇 년 동안 신흥 우려 오염 물질(신흥 오염 물질)의 생태 독성학은 효과 기반 방법이 노출을 감지하고 생물군에 대한 영향을 평가하는 데 유용한 도구가 될 수 있는 분야를 대표합니다 1,5,6,7. 여러 효과 기반 방법은 이매패류 연체동물을 환경 모니터링 및 평가에서 테스트 유기체로 사용합니다 8,9. 이러한 유기체는 광범위한 분포, 여과 섭식 특성, 고착성 생활 방식, 광범위한 환경 오염 물질의 생물 축적 능력, 오염 물질에 대한 검출 가능한 반응을 개발할 수 있는 능력, 다양한 생활 단계에서 작업할 수 있는 가능성, 실험실 조건 하에서 유지할 수 있는 가능성7 등과 같은 몇 가지 특성으로 인해 환경 독성학 연구에 적합합니다. 그들은 오염 노출에 매우 민감하며 종, 생활 단계 및 환경 조건에 따라 독성 오염 물질에 대한 다양한 반응을 보입니다 8,9,10. 따라서 여러 환경 지침에서는 이매패 종을 표준화 된 테스트 종10,11로 사용합니다.

이매패류 연체 동물 중 널리 퍼진 Mytilus galloprovincialis는 메탈로티오닌 유도, 항산화 효소 변경, 리소좀 막 불안정화, 지질 과산화, 리포푸신 축적, 소핵 빈도 증가, 탄산 무수효소 유도 12,13,14를 포함한 화학 오염 노출에 대한 조기 검출 가능한 반응을 개발할 수 있는 능력으로 인해 생태독성학 분야에서 가장 많이 사용되는 종 중 하나입니다. 15. 면역 능력이 있는 혈림프 세포인 조혈구는 이매패류 연체동물에서 환경 오염 물질의 독성학적 영향을 연구하는 데 널리 사용됩니다 4,13,16,17. 이 세포는 세포 매개 선천성 면역의 몇 가지 중요한 기능을 수행하면서 유기체의 면역 반응에 매우 중요합니다. 여기에는 식세포작용(phagocytosis)을 통한 미생물의 제거와 리소좀 효소(lysosomal enzymes), 항균 펩타이드(anti-microbial peptides)의 방출, 호흡 파열 중 산소 대사 산물의 생성과 같은 다양한 세포독성 반응이 포함됩니다 18,19,20. 혈구는 본질적으로 운동성이 있는 세포로, 21,22,23 유기체의 면역 반응 초기 단계에서 감염 부위로 이동할 수 있습니다. 일반적으로 운동성은 모든 면역 세포의 면역 감시를 가능하게 하여 신체를 보호하기 때문에 모든 면역 세포를 특징짓는 근본적인 특징입니다24. 다양한 연체동물 종에 대한 연구는 혈구 운동성이 면역 반응, 상처 치유 및 병원체와의 상호 작용에 중요한 구성 요소임을 보여줍니다. 이 운동성은 특정 분자 경로에 의해 조절되며, 연체동물에서 혈구 기능의 복잡성과 전문화를 강조합니다 21,25,26,27.

혈구의 생리학에서 운동성의 근본적인 중요성에도 불구하고, 환경 화학 오염 물질에 대한 혈구 운동성의 민감성을 조사한 연구는 거의 없습니다 23,28,29,30. 최근 우리 그룹은 조직 배양 처리된 폴리스티렌 96웰 마이크로플레이트에서 Mytilus galloprovincialis hemocytes의 자발적 움직임을 특성화하고 파라세타몰23에 대한 체외 노출에 대한 혈구 운동성의 민감도를 조사했습니다. M. galloprovincialis hemocytes는 이전에 다른 홍합 종인 Mytilus edulis 21,22,23,28에서 발견되었으며 인간 면역 세포31에서 이미 설명된 바와 같이 얇은 판과 빠른 모양 변화를 기반으로 한 무작위 같은 세포 움직임을 보여주었습니다. 최근 혈구 운동성은 화학적 스트레스 요인에 민감한 것으로 입증되었습니다23,28. 이러한 선행 연구 결과를 바탕으로 본 연구는 세포 운동성의 속도계 분석(평균 속도, 이동 거리, 유클리드 거리 및 직접성의 정량화)을 통해 M. galloprovincialis hemocytes의 운동성과 그 변형을 평가하여 오염 물질의 독성 및 생태 독성을 빠르고 민감하게 평가할 수 있는 새로운 in vitro 방법을 제안합니다. 이 방법은 단기 분석 (1-4 시간 지속) 또는 24-48 시간 동안 지속되는 장기 노출 분석에서 여러 물질의 독성을 체외 스크리닝 할 수있는 가능성을 제공합니다.

프로토콜

모든 실험은 유럽위원회 이사회 지침 (2010/63 EEC)을 시행하는 이탈리아 동물 복지 법률 (D.L.26/2014)에 따라 수행되었습니다. Mytilus galloprovincialis 는 일반적으로 지중해 홍합으로 알려진 여과식 이매패류입니다. 지중해와 남부 유럽의 대서양 연안이 원산지입니다. 그것은 소개되었으며 북미 서부, 아시아 및 남아프리카에 널리 퍼져 있습니다. 그것은 세계 여러 지역에서 중요한 상업 어종입니다. 시약과 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 인공 해수(ASTM) 또는 여과된 천연 해수의 준비

  1. ASTM D1141-98 (2021)32에 따른 인공 해수 ASW를 준비하려면 다음 염을 증류수(1L의 경우 g)에 용해시킵니다. 6H2O, 2.66 Na2SO4, 0.733 CaCl2 · 2H2O, 0.466 KCl, 0.067 KBr, 0.02 H3BO3, 0.013 SrCl2·6H2O, 0.0019 NaF. ASW 용액의 pH는 7.80입니다.
  2. 여과된 자연 해수(FSW)를 준비하기 위해 0.2μm 필터로 인위적 활동의 영향을 받지 않는 현장에서 수집된 자연 해수 37PSU를 여과합니다.

2. 동물 순응

  1. 실험용으로 사용하기 전에 온도 조절 실에서 15°C에서 폭기된 ASW 또는 FSW(1L/동물)가 포함된 정적 탱크(기아 상태)에서 성인 홍합 표본(Mytilus galloprovincialis Lam.)을 24시간 동안 순응시킵니다.

3. 혈구 운동성 평가를 위한 시약 준비

  1. 위와 같이 여과된 해수(FSW) 또는 표준 생리식염수(SPS)를 준비합니다. 약 800mL의 증류수에 HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid) 4.77g, NaCl 25.48g, MgSO4 13.06g, KCl 0.75g, CaCl2 1.47g을 용해한 다음 증류수를 더 첨가하여 최대 1L까지 만듭니다. 1M NaOH로 pH를 7.36으로 조정합니다.
  2. 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 20mg/mL의 중성 적색 원액을 준비합니다.
  3. 중성 적색 염색 용액 준비: 995μL의 FSW 또는 SPS에 5μL의 중성 적색 원액을 추가합니다.
  4. 다음과 같이 2mM의 L-글루타민, 40IU/mL의 페니실린 G 및 100μg/mL의 스트렙토마이신이 보충된 FSW 또는 SPS를 준비합니다.10mL의 FSW/SPS에 100μL의 2mM L-글루타민과 100μL의 페니실린/스트렙토마이신 혼합물을 추가합니다.
  5. FSW 또는 SPS에서 0.4% 트리판 블루를 준비합니다.
    참고: 중성 적색 원액은 Martínez-Gómez et al.33에 따라 제조되었습니다. Neutral Red 스톡 용액은 4 ° C에서 보관 할 때 약 2-3 주 동안 지속됩니다. 중성 적색 염색 용액과 0.4% 트리판 블루는 분석 직전에 준비해야 합니다.

4. 혈림프 샘플링

  1. 주사기에 0.5mL의 여과된 해수 FSW 또는 표준 생리식 식염수 SPS(15°C에서)를 미리 채웁니다.
  2. 메스로 복부 표면을 따라 판막을 약간 조심스럽게 들어 올립니다. 메스를 제자리에 유지하거나 피펫 팁을 사용하십시오. 피하 주사기의 바늘이 판막 사이의 공간으로 들어가도록 합니다.
  3. UNEP/RAMOGE34에 따라 미리 채워진 주사기로 후방 내전근에서 0.5mL의 혈림프를 부드럽게 수집합니다.
  4. 주사기에서 바늘을 제거하고 주사기의 내용물을 마이크로튜브로 옮깁니다.
  5. 3-4 개의 홍합에서 혈림프를 수집하고 개인간에 동일한 비율을 사용하여 15 ° C의 튜브에 혈림 샘플을 함께 모읍니다.
    참고: 주사기의 사전 충진은 샘플링 중에 혈림프를 즉시 1:1로 희석하는 데 사용됩니다. Martínez-Gómez et al.33에 따르면 FSW 또는 SPS를 50:50 비율로 혈림프와 희석하는 것이 일반적으로 혈구 응집을 방지하는 데 사용됩니다.

5. 적혈구 도금과 배양

  1. 혈구계로 세포를 세십시오.
  2. 혈림프를 FSW 또는 SPS로 1 × 106 cells/mL 농도로 희석합니다.
  3. Trypan blue 염색에 의한 현탁액 내 혈구의 생존력 평가: FSW 또는 SPS에 용해된 0.4% Trypan blue 100μL를 100μL의 혈구 현탁액에 추가합니다. 15 °C에서 5분 동안 배양합니다.
  4. 다음으로, 혈구계에 현탁액을 한 방울 떨어뜨리고 현미경 관찰 하에 염색되지 않은(생존 가능한) 세포와 염색된(생존 불가능한) 세포를 계수합니다.
  5. 헤모사이트 생존율을 계수된 총 세포 수에 대해 계산된 생존 가능한 세포의 백분율로 평가합니다35.
  6. 세포 생존율 평가35를 위해 다음 공식을 사용하십시오.
    생존 가능한 세포(%) = [생존 가능한 세포 수/총 세포 수(생존 + 생존 불가능)] x 100
  7. 프로토콜에서 계속 진행하기 위해 혈구 생존율이 95% 이상이어야 합니다.
  8. 50μL의 희석된 혈림프를 세포 배양 96웰 평면 바닥 폴리스티렌 TC 처리된 마이크로플레이트의 각 웰에 추가합니다. 뚜껑으로 접시를 덮으십시오.
  9. hemocytes가 15 ° C에서 30 분 동안 우물 바닥에 부착되어 단층을 형성하도록합니다.
  10. 마이크로피펫으로 부드럽게 흡인하여 과도한 혈림프를 제거합니다.

6. 단기 분석

  1. 단기 분석(1-4시간 이내)의 경우, 15°C에서 다른 농도로 FSW 또는 SPS에 용해된 관심 물질 100μL로 웰 바닥에 부착된 세포를 즉시 배양합니다. 각 실험 조건의 3회 반복 측정을 위해 최소 3개의 웰을 사용합니다.
  2. 배양 후 8단계에 따라 세포 운동성을 평가합니다.

7. 장기간 노출 분석

  1. 장기간 노출, 즉 24-48시간 노출 분석의 경우, 15°C에서 2mM L-글루타민 40 IU/mL 페니실린 G 및 100 μg/mL 스트렙토마이신)이 보충된 배양 배지(FSW 또는 ASW)에 용해된 테스트 물질의 농도를 증가시켜 배양된 부착 세포를 배양합니다. 각 실험 조건의 3회 반복 측정을 위해 최소 3개의 웰을 사용합니다.
  2. 배양 후 8단계에 따라 세포 운동성을 평가합니다.

8. 타임랩스 현미경에 의한 세포 운동성 평가

  1. 부착된 살아있는 혈구가 포함된 멀티웰 플레이트를 다중 모드 리더에 삽입합니다.
  2. 타임 랩스 현미경 검사를 통해 플레이트에서 실시간 이미징을 통해 부착 살아있는 세포의 운동성을 평가합니다: 20배 배율 및 컬러 명시야 시각화에서 다중 모드 리더를 사용하여 10분 동안 1분마다 1개의 이미지 비율로 각 웰에서 동일한 관심 영역(ROI)(사용된 ROI 치수: 720μm x 720μm)의 이미지를 캡처합니다.
  3. 혈구를 더 잘 시각화하려면 다음과 같이 타임 랩스 현미경 검사 직전에 중요한 염료인 Neutral Red로 세포를 염색합니다.
    1. 각 웰에서 배양 배지를 제거합니다.
    2. 관심 물질을 포함하는 표준 생리식 식염수에 용해된 중성 적색 염색 용액 100μL를 부착 세포가 포함된 플레이트의 웰에 추가합니다.
    3. 15°C에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 여분의 염료를 씻어냅니다.
    4. FSW 또는 SPS에서 용해된 관심 물질 100μL를 추가합니다. 운동성 평가를 위해 세포를 시각화합니다.
      참고: 다중 모드 리더를 사용하면 많은 수의 웰에서 이미지를 동시에 획득할 수 있으므로 웰에 포함된 모든 실험 조건 및 복제의 운동성을 동시에 검출할 수 있습니다. 중성 적색 염료는 세포질에서 작은 주황색 반점으로 나타나는 리소솜 내부에 남아 있는 반면, 핵은 애시도필러스 바이탈 염료가 염색하지 않기 때문에 반투명 구멍으로 나타납니다. 이미지 획득은 20°C의 실온에서 10분 동안 수행되었습니다.

9. 세포 추적 및 속도 측정 매개 변수 계산

  1. 각 웰에 대해 Image J로 타임 랩스 현미경으로 획득한 동일한 관심 영역의 프레임을 분석합니다.
  2. 이름에 공백이 없는 폴더에 이미지를 저장합니다. 이미지는 JPEG 또는 PNG 형식일 수 있습니다.
  3. ImageJ를 엽니다. File >(파일)을 클릭하여 Import > Image Sequence(이미지 시퀀스 가져오기)를 클릭합니다.
  4. ImageJ의 Manual Tracking 플러그인을 사용하여 단일 셀에서 셀 추적을 수행합니다. 개별 셀의 위치는 연속적인 이미지로 표시되어 시간 경과에 따른 위치 변화를 추적할 수 있습니다.
  5. 분석에서 기록된 필드를 벗어나는 세포를 제외하고 웰당 최소 40개의 세포를 분석합니다.
  6. ImageJ 플러그인인 "Manual Tracking"에서 무료로 사용할 수 있는 Chemotaxis 및 Migration Tool 소프트웨어로 데이터 세트를 가져올 수 있습니다.
  7. 무료로 사용 가능한 소프트웨어(36)의 사용자 가이드 또는 아래에 제공된 단계에 보고된 자세한 지침에 따라 Chemotaxis 및 Migration Tool 소프트웨어를 사용하여 평균 속도, 유클리드 거리, 마이그레이션된 거리 및 직접성과 같은 속도 측정 매개변수를 정량화합니다.
    1. ImageJ 플러그인 "Manual Tracking"에서 Chemotaxis 및 Migration Tool 소프트웨어로 데이터 세트를 가져올 수 있습니다.
    2. 원하는 슬라이스 수(예: 추적에 사용되는 이미지 수)를 선택합니다.
    3. x/y 픽셀 크기와 시간 간격을 설정하여 소프트웨어를 보정합니다. x/y 보정은 픽셀의 가장자리 길이를 μm 단위로 나타내고 시간 간격은 각 슬라이스 사이의 지속 시간을 나타냅니다.
    4. 값과 매개변수를 조정한 후 Apply Settings(설정 적용)를 클릭합니다.
    5. 궤적을 플롯하고 이미지로 내보냅니다. 측정값 버튼을 클릭하여 측정값을 확인합니다. 저장하세요.
    6. 통계 버튼을 클릭하고 트랙 시리즈의 속도와 직접성을 저장합니다.
  8. 대조 세포에 대해 계산된 속도 측정 매개변수를 다른 농도에서 테스트 물질에 노출된 혈구의 매개변수와 비교합니다.
    참고: 마이그레이션된 거리(μm로 측정)는 관찰 기간(10분) 동안 마이그레이션 경로의 길이를 나타냅니다. 유클리드 거리(μm 단위로도 측정)는 셀의 시작점과 끝점 사이의 직선 거리를 나타냅니다. 평균 속도(μm min-1로 표시)는 각 셀에 대한 셀 추적 기간에 대한 마이그레이션된 거리의 비율로 계산됩니다. 직접성은 각 궤적에 대한 누적 거리에 대한 유클리드 거리의 비율로 정의됩니다.

결과

이 연구는 Mytilus galloprovincialis hemocytes의 운동성을 활용하여 오염 물질의 독성 및 생태 독성을 빠르고 민감하게 평가하기 위한 새로운 체외 방법을 소개합니다. 그림 1A-C는 우물 바닥에 30분 부착 후 혈구의 대표적인 타임 랩스 이미징을 보여줍니다. 그림의 세포는 운동성 평가 직전에 중성 적색으로 염색되었습?...

토론

이 연구에서 기술된 프로토콜은 M. galloprovincialis hemocytes의 운동성 및 그 변형 평가를 기반으로 약물 및 오염 물질의 독성을 빠르고 민감하게 평가하는 데 적합한 새로운 in vitro 방법을 나타냅니다. 운동성은 이러한 세포의 면역 기능 중 특이한 측면이므로 21,22,23,37,38 세포 운동성의 변화는 이러한 세포의 면역 기능의 변화를 예고할 수 있습니다.<...

공개

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 이탈리아 대학연구부(CUP: F85D18000130001)가 DiSTeBA에 수여한 프로젝트 "Dipartimento di Eccellenza"와 유럽연합 NextGenerationEU, PNRR, 프로젝트 n. CN00000033가 자금을 지원한 NBFC(National Biodiversity Future Center)의 지원을 받았습니다. 또한 살렌토 대학교(University of Salento)의 생물 및 환경 과학 및 기술학과의 BIOforIU 인프라에도 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm filter (diameter 25 mm)ABLUO labware
2.5 ml hypodermic syringe needdle 22GRays2522CM32labware
96-well flat-bottom polystyrene TC-treated microplateCorning3916labware
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KGChemical
Chemotaxis and Migration Tool software (Ibidi GmbH)software
Cytation 5 Agilent BioTeckCytation 5Equipment: Cell imaging multimode reader
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merk (Sigma - Aldrich) 472301Solvent
Falcon 15 mL Tube Conical BottomCorning352196labware
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394Chemical
Hemocytometer Fast read 102BiosigmaBVS100labware
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid)Merk (Sigma - Aldrich) H3375-500GChemical
ImageJ softwareNIHsoftware
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Chemical
KClMerk 104936Chemical
L-glutamineMerk (Sigma - Aldrich) G7513Essential amino acid for cell culture medium
MgCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) M2670Chemical
MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) M7506Chemical
Microscope Nikon Eclipse E600NikonEquipment: Cell imaging 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemical
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-RChemical
NaFFluka71519 500gChemical
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KGChemical
Neutral RedMerk (Sigma - Aldrich) N4638-1GVital cell dye
Penicillin/StreptomycinMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLAntibiotics for cell culture
SrCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) 255521Chemical
Trypan blue Merk (Sigma - Aldrich) T8154Cell dye

참고문헌

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