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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'articolo propone un nuovo metodo in vitro per la valutazione rapida e sensibile della tossicità e dell'ecotossicità degli inquinanti, basato sulla motilità degli emociti di Mytilus galloprovincialis . Il metodo mira a contribuire allo sviluppo di test di esposizione tossicologica ed ecotossicologica più etici e sensibili.

Abstract

Gli emociti sono le cellule immuno-competenti circolanti nei molluschi bivalvi e svolgono un ruolo chiave in diverse importanti funzioni dell'immunità innata cellulo-mediata. Durante le prime fasi della risposta immunitaria, gli emociti migrano attivamente verso il sito dell'infezione. Questa motilità intrinseca è una caratteristica fondamentale di queste cellule. Rappresenta una funzione cellulare chiave che integra molteplici processi, come l'adesione cellulare, la segnalazione cellulare, la dinamica del citoscheletro e i cambiamenti nel volume cellulare. Pertanto, le alterazioni della motilità cellulare in seguito all'esposizione a farmaci o inquinanti possono fungere da utile endpoint tossicologico. Nonostante il ruolo fondamentale della motilità cellulare nella fisiologia cellulare, è stata scarsamente studiata da un punto di vista tossicologico. Questo lavoro propone un nuovo metodo in vitro per la valutazione rapida e sensibile della tossicità e dell'ecotossicità degli inquinanti, basata sulla valutazione della motilità emocitaria di Mytilus galloprovincialis. Abbiamo sviluppato un saggio di motilità cellulare su emociti che aderiscono al fondo di una micropiastra di polistirene a 96 pozzetti. A seguito dell'esposizione a concentrazioni crescenti di farmaci, le traiettorie e le velocità cellulari sono state quantificate mediante tracciamento cellulare al microscopio time-lapse, permettendoci di misurare gli effetti sulla motilità degli emociti. A causa della facilità di raccolta degli emociti dagli animali in modo relativamente non invasivo, il metodo proposto offre un test alternativo per lo screening degli effetti e dei meccanismi d'azione di inquinanti e farmaci. Si allinea con i criteri 3R (Replacement, Reduction, and Refinement), affrontando le preoccupazioni etiche e contribuendo alla riduzione dei test sugli animali in vivo sui vertebrati.

Introduzione

I metodi basati sugli effetti, come i biosaggi in vitro e in vivo, rappresentano strumenti innovativi per la rilevazione degli effetti degli inquinanti chimici ambientali negli organismi viventi e per il loro utilizzo come strumenti nel monitoraggio ambientale e nella valutazione del rischio 1,2,3,4. Completano l'approccio chimico analitico classico superando alcuni dei suoi limiti. Ad esempio, i metodi basati sugli effetti possono valutare la biodisponibilità degli inquinanti, il loro impatto sulla salute degli organismi e gli effetti tossicologici combinati delle miscele. Questi effetti combinati potrebbero non essere prevedibili basandosi esclusivamente sull'analisi chimica5.

Negli ultimi anni, l'ecotossicologia degli inquinanti di preoccupazione emergente (inquinanti emergenti) rappresenta un campo in cui i metodi basati sugli effetti possono essere strumenti utili per rilevare l'esposizione e valutare l'impatto sul biota 1,5,6,7. Diversi metodi basati sugli effetti utilizzano i molluschi bivalvi come organismi di prova nel monitoraggio e nella valutazione ambientale 8,9. Alcune caratteristiche rendono questi organismi adatti agli studi ecotossicologici, come la loro ampia distribuzione, la loro natura filtratrice, il loro stile di vita sesilile, la capacità di bioaccumulo di un'ampia gamma di inquinanti ambientali e di sviluppare risposte rilevabili agli inquinanti, la possibilità di lavorare con diverse fasi di vita e di mantenere in condizioni di laboratorio7. Sono altamente sensibili all'esposizione all'inquinamento e mostrano una varietà di risposte ai contaminanti tossici a seconda della specie, della fase di vita e delle condizioni ambientali 8,9,10. Pertanto, diverse linee guida ambientali utilizzano le specie bivalvi come specie di prova standardizzate10,11.

Tra i molluschi bivalvi, il diffuso Mytilus galloprovincialis è una delle specie più utilizzate in campo ecotossicologico per la sua capacità di sviluppare risposte precoci rilevabili all'esposizione all'inquinamento chimico, tra cui l'induzione di metallotioneina, l'alterazione enzimatica antiossidante, la destabilizzazione della membrana lisosomiale, la perossidazione lipidica, l'accumulo di lipofuscina, l'aumento della frequenza dei micronuclei, l'induzione dell'anidrasi carbonica 12,13,14, 15. Gli emociti, le cellule emolinfatiche immunocompetenti, sono ampiamente utilizzati per studiare gli impatti tossicologici degli inquinanti ambientali nei molluschi bivalvi 4,13,16,17. Queste cellule sono cruciali per la risposta immunitaria dell'organismo, svolgendo diverse importanti funzioni dell'immunità innata cellulo-mediata. Questi includono l'eliminazione dei microbi attraverso la fagocitosi e varie reazioni citotossiche, come il rilascio di enzimi lisosomiali, peptidi antimicrobici e la produzione di metaboliti dell'ossigeno durante lo scoppio respiratorio 18,19,20. Gli emociti sono cellule intrinsecamente mobili 21,22,23 in grado di migrare verso il sito di infezione durante la fase iniziale della risposta immunitaria dell'organismo. In generale, la motilità è una caratteristica fondamentale che caratterizza tutte le cellule immunitarie poiché consente l'immunosorveglianza di queste cellule per proteggere l'organismo24. La ricerca su varie specie di molluschi dimostra che la motilità degli emociti è una componente fondamentale della loro risposta immunitaria, della guarigione delle ferite e dell'interazione con gli agenti patogeni. Questa motilità è regolata da specifiche vie molecolari, evidenziando la complessità e la specializzazione delle funzioni degli emociti nei molluschi 21,25,26,27.

Nonostante l'importanza fondamentale della motilità nella fisiologia degli emociti, pochissimi studi hanno indagato la sensibilità della motilità degli emociti agli inquinanti chimici ambientali 23,28,29,30. Recentemente, il nostro gruppo ha caratterizzato il movimento spontaneo degli emociti di Mytilus galloprovincialis in una micropiastra di polistirene a 96 pozzetti trattata con coltura tissutale e ha esaminato la sensibilità della motilità degli emociti all'esposizione in vitro al paracetamolo23. Gli emociti di M. galloprovincialis hanno mostrato un movimento cellulare casuale basato su lamellipodi e rapidi cambiamenti di forma, come precedentemente trovato in un'altra specie di cozza, Mytilus edulis 21,22,23,28, e già descritto in cellule immunitarie umane31. Recentemente è stato dimostrato che la motilità degli emociti è sensibile ai fattori di stress chimico23,28. Sulla base di questi risultati precedenti, questo lavoro propone un nuovo metodo in vitro per la valutazione rapida e sensibile della tossicità e dell'ecotossicità degli inquinanti basata sulla valutazione della motilità degli emociti di M. galloprovincialis e delle sue alterazioni, attraverso l'analisi velocimetrica della motilità cellulare (quantificazione della velocità media, della distanza migrata, della distanza euclidea e dell'immediatezza). Il metodo offre la possibilità di eseguire lo screening in vitro della tossicità di diverse sostanze sia in saggi a breve termine (della durata di 1-4 ore) che in saggi di esposizione prolungata, della durata di 24-48 ore.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti nel rispetto della normativa italiana sul benessere degli animali (D.L.26/2014) che ha recepito la Direttiva del Consiglio del Comitato Europeo (2010/63 CEE). Mytilus galloprovincialis è un bivalve filtratore, comunemente noto come cozza mediterranea. È originario del Mar Mediterraneo e della costa atlantica dell'Europa meridionale. È stato introdotto ed è diffuso nel Nord America occidentale, in Asia e in Sud Africa. È un'importante specie di pesca commerciale in diverse parti del mondo. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di acqua di mare artificiale (ASTM) o acqua di mare naturale filtrata

  1. Per la preparazione di acqua di mare artificiale ASW secondo ASTM D1141-98 (2021)32, sciogliere i seguenti sali in acqua distillata (g per 1 L): 27,65 NaCl, 0,133 NaHCO3, 3,33 MgCl2· 6H2O, 2.66 Na2SO4, 0.733 CaCl2 · 2H2O, 0,466 KCl, 0,067 KBr, 0,02 H3BO3, 0,013 SrCl2·6H2O, 0,0019 NaF. La soluzione ASW ha un pH di 7,80.
  2. Per la preparazione di acqua di mare naturale filtrata (FSW), filtrare l'acqua di mare naturale 37 PSU, raccolta da un sito non interessato da attività antropiche con filtri da 0,2 μm.

2. Acclimatazione degli animali

  1. Prima dell'uso sperimentale, acclimatare gli esemplari adulti di cozze (Mytilus galloprovincialis Lam.) per 24 ore in vasche statiche (in fase di fame) contenenti ASW o FSW aerati (1 L/animale) a 15 °C in un locale termostatico.

3. Preparazione del reagente per la valutazione della motilità degli emociti

  1. Preparare acqua di mare filtrata (FSW) come sopra o soluzione fisiologica standard (SPS). Sciogliere HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazina-etansolfonico) 4,77 g, NaCl 25,48 g, MgSO4 13,06 g, KCl 0,75 g, CaCl2 1,47 g in circa 800 mL di acqua distillata, quindi portare a 1 L con l'aggiunta di altra acqua distillata. Regolare il pH a 7,36 con 1 M NaOH.
  2. Preparare una soluzione madre di Rosso Neutro di 20 mg/mL in dimetilsolfossido (DMSO).
  3. Preparare la soluzione di colorazione Neutral Red: aggiungere 5 μl di una soluzione madre di Neutral Red a 995 μl di FSW o SPS.
  4. Preparare FSW o SPS integrati con 2 mM di L-glutammina, 40 UI/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina come segue: Aggiungere 100 μL di 2 mM di L-glutammina e 100 μL di miscela Penicillina/Streptomicina a 10 mL di FSW/SPS.
  5. Preparare lo 0,4% di tripano blu in FSW o SPS.
    NOTA: La soluzione madre di Rosso neutro è stata preparata secondo Martínez-Gómez et al.33. La soluzione madre di Neutral Red dura circa 2-3 settimane se conservata a 4 °C. La soluzione colorante di colore rosso neutro e il blu di tripano allo 0,4% devono essere preparati appena prima del test.

4. Prelievo di emolinfa

  1. Preriempire una siringa con 0,5 mL di FSW di acqua di mare filtrata o SPS fisiologico standard (a 15 °C).
  2. Sollevare leggermente e con attenzione le valvole lungo la superficie ventrale con un bisturi. Mantenere il bisturi in posizione o utilizzare una punta per pipetta. Lasciare che l'ago di una siringa ipodermica entri nello spazio tra le valvole.
  3. Raccogliere delicatamente 0,5 mL di emolinfa dal muscolo adduttore posteriore con la siringa preriempita secondo UNEP/RAMOGE34.
  4. Rimuovere l'ago dalla siringa e trasferire il contenuto della siringa in una microprovetta.
  5. Raccogliere l'emolinfa da 3-4 cozze e raccogliere i campioni di emolinfa in una provetta a 15 °C utilizzando lo stesso rapporto tra gli individui.
    NOTA: Il preriempimento della siringa viene utilizzato per diluire immediatamente l'emolinfa 1:1 durante il prelievo. La diluizione dell'emolinfa con FSW o SPS in un rapporto 50:50 è comunemente usata per prevenire l'aggregazione degli emociti, secondo Martínez-Gómez et al.33.

5. Placcatura e coltura degli emociti

  1. Contare le cellule con un emocitometro.
  2. Diluire l'emolinfa alla concentrazione di 1 × 106 cellule/mL con FSW o SPS.
  3. Valutare la vitalità degli emociti in sospensione mediante colorazione con blu di tripano: aggiungere 100 μl di blu di tripano allo 0,4% disciolto in FSW o SPS a 100 μl di sospensione di emociti. Incubare per 5 minuti a 15 °C.
  4. Quindi, aggiungere una goccia di sospensione in un emocitometro e contare le cellule non colorate (vitali) e colorate (non vitali) sotto osservazione microscopica.
  5. Valutare la vitalità degli emociti come percentuale di cellule vitali calcolata sul numero totale di cellule contate35.
  6. Utilizzare la seguente formula per la valutazione della vitalità cellulare35:
    Cellule vitali (%) = [numero di cellule vitali/numero totale di cellule (vitali + non vitali)] x 100
  7. Assicurarsi che la vitalità degli emociti sia superiore al 95% per procedere ulteriormente nel protocollo.
  8. Aggiungere 50 μl di emolinfa diluita in ciascun pozzetto di una micropiastra in polistirene a fondo piatto a 96 pozzetti trattata con TC per colture cellulari. Coprite il piatto con il suo coperchio.
  9. Lasciare che gli emociti aderiscano al fondo dei pozzetti per 30 minuti a 15 °C per formare un monostrato.
  10. Rimuovere l'emolinfa in eccesso aspirando delicatamente con una micropipetta.

6. Saggio a breve termine

  1. Per saggi a breve termine (entro 1-4 ore), incubare immediatamente le cellule aderenti al fondo dei pozzetti con 100 μL della sostanza di interesse disciolta in FSW o SPS a diverse concentrazioni a 15 °C. Utilizzare almeno tre pozzetti per tre determinazioni di replica di ciascuna condizione sperimentale.
  2. Dopo l'incubazione, valutare la motilità cellulare seguendo il passaggio 8.

7. Saggio di esposizione prolungata

  1. Per esposizioni prolungate, ossia saggi di esposizione di 24-48 ore, incubare le cellule aderenti in coltura con concentrazioni crescenti della sostanza in esame disciolta nel terreno di coltura (FSW o ASW) integrata con 2 mM di L-glutammina, 40 UI/mL di penicillina G e 100 μg/mL di streptomicina) a 15°C. Utilizzare almeno tre pozzetti per tre determinazioni di replica di ciascuna condizione sperimentale.
  2. Dopo l'incubazione, valutare la motilità cellulare seguendo il passaggio 8.

8. Valutazione della motilità cellulare mediante microscopia time-lapse

  1. Inserire la piastra multipozzetto contenente gli emociti viventi aderenti in un lettore multimodale.
  2. Valutare la motilità delle cellule viventi aderenti mediante imaging in tempo reale sulla piastra mediante microscopia time-lapse: acquisire immagini della stessa regione di interesse (ROI) (dimensione del ROI utilizzato: 720μm x 720μm) in ciascun pozzetto a una velocità di 1 immagine ogni 1 minuto per 10 minuti utilizzando il lettore multimodale con ingrandimento 20x e visualizzazione in campo chiaro a colori.
  3. Per una migliore visualizzazione degli emociti, colorare le cellule con il colorante vitale Neutral Red appena prima della microscopia time-lapse come segue:
    1. Rimuovere il terreno di incubazione da ciascun pozzetto.
    2. Aggiungere 100 μl di soluzione colorante di rosso neutro disciolto in soluzione fisiologica standard contenente la sostanza di interesse nei pozzetti della piastra contenente le cellule aderenti.
    3. Incubare le cellule a 15 °C per 15 minuti. Lavare via il colorante in eccesso.
    4. Aggiungere 100 μl della sostanza di interesse risolta in FSW o SPS. Visualizzare le cellule per la valutazione della motilità.
      NOTA: L'utilizzo di un lettore multimodale consente l'acquisizione simultanea di immagini da un elevato numero di pozzetti, consentendo la rilevazione simultanea della motilità di tutte le condizioni sperimentali e delle repliche contenute nel pozzetto. Il colorante rosso neutro viene trattenuto all'interno dei lisosomi, che appaiono come piccole macchie arancioni nel citoplasma, mentre il nucleo appare come un foro traslucido poiché il colorante vitale acidophilus non lo macchia. L'acquisizione dell'immagine è stata effettuata per 10 minuti a una temperatura ambiente di 20 °C.

9. Inseguimento delle celle e calcolo dei parametri velocimetrici

  1. Analizzare i frame della stessa regione di interesse acquisiti al microscopio time-lapse mediante l'immagine J per ciascun pozzetto.
  2. Salva le immagini in una cartella senza spazi nel nome. Le immagini possono essere in formato JPEG o PNG.
  3. Aprire ImageJ. Fare clic su File > Importa > sequenza di immagini.
  4. Eseguire il tracciamento delle celle su singole celle utilizzando il plug-in Tracciamento manuale di ImageJ. Le posizioni delle singole celle sono contrassegnate in immagini consecutive, consentendo il monitoraggio dei cambiamenti di posizione nel tempo.
  5. Analizzare almeno 40 celle per pozzetto, escluse le celle che fuoriescono dal campo registrato dall'analisi.
  6. Importa i set di dati dal plug-in ImageJ, "Tracciamento manuale", nel software Chemotaxis e Migration Tool disponibile gratuitamente.
  7. Quantificare i parametri velocimetrici come la velocità media, la distanza euclidea, la distanza migrata e la direttività utilizzando il software Chemotaxis and Migration Tool secondo le istruzioni dettagliate riportate nella guida per l'utente disponibile gratuitamente del software36o i passaggi forniti di seguito:
    1. Importa i set di dati dal plug-in ImageJ "Tracciamento manuale" nel software Chemotaxis and Migration Tool.
    2. Selezionare il numero di sezioni desiderato (ad esempio, il numero di immagini utilizzate per il tracciamento).
    3. Calibrare il software impostando la dimensione dei pixel x/y e l'intervallo di tempo. La calibrazione x/y indica la lunghezza del bordo di un pixel in μm, mentre l'intervallo di tempo rappresenta la durata tra ogni fetta.
    4. Dopo aver regolato i valori e i parametri, fare clic su Applica impostazioni.
    5. Traccia le traiettorie ed esporta come immagine. Fare clic sul pulsante Valori misurati per visualizzare i valori misurati. Salvalo.
    6. Fare clic sul pulsante Statistiche e salvare la velocità e l'immediatezza della serie di tracce.
  8. Confrontare i parametri velocimetrici calcolati per le cellule di controllo con quelli degli emociti esposti alla sostanza in esame a diverse concentrazioni.
    NOTA: La distanza migrata (misurata in μm) si riferisce alla lunghezza del percorso di migrazione durante il periodo di osservazione (10 min). La distanza euclidea (misurata anche in μm) rappresenta la distanza in linea retta tra il punto iniziale e il punto finale della cella. La velocità media (espressa in μm min-1) è calcolata come il rapporto tra la distanza migrata e la durata dell'inseguimento delle celle per ciascuna cella. L'immediatezza è definita come il rapporto tra la distanza euclidea e la distanza accumulata per ciascuna traiettoria.

Risultati

Lo studio introduce un nuovo metodo in vitro per valutare in modo rapido e sensibile la tossicità e l'ecotossicità degli inquinanti, utilizzando la motilità degli emociti di Mytilus galloprovincialis. La Figura 1A-C mostra l'imaging time-lapse rappresentativo degli emociti dopo 30 minuti di attacco al fondo del pozzetto. Le cellule nella figura sono state colorate con rosso neutro appena prima della valu...

Discussione

Il protocollo descritto in questo lavoro rappresenta un nuovo metodo in vitro adatto per la valutazione rapida e sensibile della tossicità di farmaci e inquinanti basata sulla valutazione della motilità degli emociti di M. galloprovincialis e delle sue alterazioni. La motilità è un aspetto peculiare della funzione immunitaria di queste cellule 21,22,23,37,38, quindi qualsiasi alterazione della motilità cellulare può far presagire alterazioni della funzione immunit...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata finanziata dal progetto "Dipartimento di Eccellenza" assegnato al DiSTeBA dal Ministero dell'Università e della Ricerca, CUP: F85D18000130001, e da NBFC (National Biodiversity Future Center) finanziato dall'Unione Europea NextGenerationEU, PNRR, progetto n. CN00000033. Si ringrazia inoltre l'infrastruttura BIOforIU presso il Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali dell'Università del Salento.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm filter (diameter 25 mm)ABLUO labware
2.5 ml hypodermic syringe needdle 22GRays2522CM32labware
96-well flat-bottom polystyrene TC-treated microplateCorning3916labware
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KGChemical
Chemotaxis and Migration Tool software (Ibidi GmbH)software
Cytation 5 Agilent BioTeckCytation 5Equipment: Cell imaging multimode reader
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merk (Sigma - Aldrich) 472301Solvent
Falcon 15 mL Tube Conical BottomCorning352196labware
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394Chemical
Hemocytometer Fast read 102BiosigmaBVS100labware
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid)Merk (Sigma - Aldrich) H3375-500GChemical
ImageJ softwareNIHsoftware
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Chemical
KClMerk 104936Chemical
L-glutamineMerk (Sigma - Aldrich) G7513Essential amino acid for cell culture medium
MgCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) M2670Chemical
MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) M7506Chemical
Microscope Nikon Eclipse E600NikonEquipment: Cell imaging 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemical
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-RChemical
NaFFluka71519 500gChemical
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KGChemical
Neutral RedMerk (Sigma - Aldrich) N4638-1GVital cell dye
Penicillin/StreptomycinMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLAntibiotics for cell culture
SrCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) 255521Chemical
Trypan blue Merk (Sigma - Aldrich) T8154Cell dye

Riferimenti

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