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  • Déclarations de divulgation
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Résumé

L’article propose une nouvelle méthode in vitro pour l’évaluation rapide et sensible de la toxicité et de l’écotoxicité des polluants, basée sur la motilité des hémocytes de Mytilus galloprovincialis . La méthode vise à contribuer au développement d’essais d’exposition toxicologiques et écotoxicologiques plus éthiques et plus sensibles.

Résumé

Les hémocytes sont les cellules immunitaires circulantes chez les mollusques bivalves et jouent un rôle clé dans plusieurs fonctions importantes de l’immunité innée à médiation cellulaire. Au cours des premiers stades de la réponse immunitaire, les hémocytes migrent activement vers le site de l’infection. Cette motilité inhérente est une caractéristique fondamentale de ces cellules. Il représente une fonction cellulaire clé qui intègre de multiples processus, tels que l’adhésion cellulaire, la signalisation cellulaire, la dynamique du cytosquelette et les changements de volume cellulaire. Par conséquent, les altérations de la motilité cellulaire à la suite d’une exposition à des médicaments ou à des polluants peuvent servir de paramètre toxicologique utile. Malgré le rôle fondamental de la motilité cellulaire dans la physiologie cellulaire, elle a été peu étudiée d’un point de vue toxicologique. Ce travail propose une nouvelle méthode in vitro pour l’évaluation rapide et sensible de la toxicité et de l’écotoxicité des polluants, basée sur l’évaluation de la motilité des hémocytes de Mytilus galloprovincialis. Nous avons mis au point un test de motilité cellulaire sur des hémocytes adhérant au fond d’une microplaque de polystyrène de 96 puits. Suite à une exposition à des concentrations croissantes de médicaments, les trajectoires cellulaires et les vitesses ont été quantifiées par suivi cellulaire sous microscopie time-lapse, ce qui nous a permis de mesurer les effets sur la motilité des hémocytes. En raison de la facilité de collecte des hémocytes sur les animaux d’une manière relativement non invasive, la méthode proposée offre un test alternatif pour dépister les effets et les mécanismes d’action des polluants et des médicaments. Il s’aligne sur les critères des 3R (remplacement, réduction et raffinement), en répondant aux préoccupations éthiques et en contribuant à la réduction des essais in vivo sur les animaux vertébrés.

Introduction

Les méthodes fondées sur les effets, telles que les essais biologiques in vitro et in vivo, représentent des outils novateurs pour la détection des effets des polluants chimiques environnementaux dans les organismes vivants et pour leur utilisation comme outils de surveillance environnementale et d’évaluation des risques 1,2,3,4. Ils complètent l’approche chimique analytique classique en surmontant certaines de ses limites. Par exemple, les méthodes basées sur les effets peuvent évaluer la biodisponibilité des polluants, leur impact sur la santé des organismes et les effets toxicologiques combinés des mélanges. Ces effets combinés peuvent ne pas être prévisibles sur la seule base de l’analyse chimique5.

Ces dernières années, l’écotoxicologie des polluants préoccupants émergents (polluants émergents) représente un domaine où les méthodes basées sur les effets peuvent être des outils utiles pour détecter l’exposition et évaluer l’impact sur le biote 1,5,6,7. Plusieurs méthodes fondées sur les effets utilisent des mollusques bivalves comme organismes d’essai dans le cadre de la surveillance et de l’évaluation environnementales 8,9. Certaines caractéristiques rendent ces organismes aptes aux études écotoxicologiques, telles que leur large distribution, leur nature filtrée, leur mode de vie sessile, la capacité de bioaccumulation d’un large éventail de polluants environnementaux et de développer des réponses détectables aux polluants, la possibilité de travailler avec différents stades de vie et de maintenir dans des conditions de laboratoire7. Ils sont très sensibles à l’exposition à la pollution et réagissent diverses fois aux contaminants toxiques selon l’espèce, le stade de vie et les conditions environnementales 8,9,10. Par conséquent, plusieurs directives environnementales utilisent des espèces de bivalves comme espèces d’essai normalisées10,11.

Parmi les mollusques bivalves, le très répandu Mytilus galloprovincialis est l’une des espèces les plus utilisées dans le domaine écotoxicologique en raison de sa capacité à développer des réponses précoces détectables à l’exposition à la pollution chimique, y compris l’induction de métallothionéine, l’altération de l’enzyme antioxydante, la déstabilisation de la membrane lysosomale, la peroxydation lipidique, l’accumulation de lipofuscine, l’augmentation de la fréquence des micronoyaux, l’induction de l’anhydrase carbonique 12,13,14, 15. Traduction Les hémocytes, les cellules hémolymphhatiques immunocompétentes, sont largement utilisés pour étudier les impacts toxicologiques des polluants environnementaux chez les mollusques bivalves 4,13,16,17. Ces cellules sont cruciales pour la réponse immunitaire de l’organisme, remplissant plusieurs fonctions importantes de l’immunité innée à médiation cellulaire. Il s’agit notamment de l’élimination des microbes par phagocytose et de diverses réactions cytotoxiques, telles que la libération d’enzymes lysosomales, de peptides antimicrobiens et la production de métabolites de l’oxygène lors de l’explosion respiratoire 18,19,20. Les hémocytes sont des cellules intrinsèquement mobiles 21,22,23 capables de migrer vers le site de l’infection au cours du stade précoce de la réponse immunitaire de l’organisme. En général, la motilité est une caractéristique fondamentale qui caractérise toutes les cellules immunitaires puisqu’elle permet l’immunosurveillance de ces cellules pour protéger l’organisme24. La recherche sur diverses espèces de mollusques démontre que la motilité des hémocytes est un élément essentiel de leur réponse immunitaire, de la cicatrisation des plaies et de l’interaction avec les agents pathogènes. Cette motilité est régulée par des voies moléculaires spécifiques, mettant en évidence la complexité et la spécialisation des fonctions hémocytaires chez les mollusques 21,25,26,27.

Malgré l’importance fondamentale de la motilité dans la physiologie des hémocytes, très peu d’études ont examiné la sensibilité de la motilité des hémocytes aux polluants chimiques environnementaux 23,28,29,30. Récemment, notre groupe a caractérisé le mouvement spontané des hémocytes de Mytilus galloprovincialis dans une microplaque de polystyrène à 96 puits traitée par culture tissulaire et a examiné la sensibilité de la motilité des hémocytes à l’exposition in vitro au paracétamol23. Les hémocytes de M. galloprovincialis ont montré un mouvement cellulaire aléatoire basé sur des lamellipodes et des changements de forme rapides, comme précédemment observé chez une autre espèce de moule, Mytilus edulis 21,22,23,28, et déjà décrit dans les cellules immunitaires humaines31. Il a récemment été démontré que la motilité des hémocytes est sensible aux facteurs de stress chimiques23,28. Sur la base de ces résultats précédents, ce travail propose une nouvelle méthode in vitro pour l’évaluation rapide et sensible de la toxicité et de l’écotoxicité des polluants basée sur l’évaluation de la motilité des hémocytes de M. galloprovincialis et de ses altérations, par analyse vélocimétrique de la motilité cellulaire (quantification de la vitesse moyenne, de la distance migrée, de la distance euclidienne et de la directivité). La méthode offre la possibilité de dépister in vitro la toxicité de plusieurs substances, soit dans des essais à court terme (d’une durée de 1 à 4 h), soit dans des essais d’exposition prolongée d’une durée de 24 à 48 h.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la législation italienne sur le bien-être animal (D.L.26/2014) qui met en œuvre la directive du Comité européen du Conseil (2010/63 CEE). Mytilus galloprovincialis est un bivalve filtreur, communément appelé moule méditerranéenne. Il est originaire de la mer Méditerranée et de la côte atlantique du sud de l’Europe. Il a été introduit et est répandu dans l’ouest de l’Amérique du Nord, en Asie et en Afrique du Sud. Il s’agit d’une espèce importante de la pêche commerciale dans plusieurs régions du monde. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation d’eau de mer artificielle (ASTM) ou d’eau de mer naturelle filtrée

  1. Pour la préparation d’eau de mer artificielle ASW selon ASTM D1141-98 (2021)32, dissoudre les sels suivants dans de l’eau distillée (g pour 1 L) : 27,65 NaCl, 0,133 NaHCO3, 3,33 MgCl2· 6H2O, 2,66 Na2SO4, 0,733 CaCl2 · 2H2O, 0,466 KCl, 0,067 KBr, 0,02 H3BO3, 0,013 SrCl2·6H2O, 0,0019 NaF. La solution ASW a un pH de 7,80.
  2. Pour la préparation de l’eau de mer naturelle filtrée (FSW), filtrer l’eau de mer naturelle 37 PSU, prélevée sur un site non impacté par les activités anthropiques avec des filtres de 0,2 μm.

2. Acclimatation animale

  1. Acclimater des spécimens de moules adultes (Mytilus galloprovincialis Lam.) pendant 24 h dans des bassins statiques (en cas de famine) contenant de la ASW ou du FSW aéré (1 L/animal) à 15 °C dans une salle thermostatique avant l’utilisation expérimentale.

3. Préparation du réactif pour l’évaluation de la motilité des hémocytes

  1. Préparez de l’eau de mer filtrée (FSW) comme ci-dessus ou une solution saline physiologique standard (SPS). Dissoudre HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine-éthanesulfonique) 4,77 g, NaCl 25,48 g, MgSO4 13,06 g, KCl 0,75 g, CaCl2 1,47 g dans environ 800 ml d’eau distillée, puis augmenter à 1 L par l’ajout d’eau distillée. Ajustez le pH à 7,36 avec 1 M de NaOH.
  2. Préparez une solution mère de rouge neutre de 20 mg/mL dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO).
  3. Préparez une solution de coloration rouge neutre : Ajoutez 5 μL d’une solution mère de rouge neutre à 995 μL de FSW ou de SPS.
  4. Préparer le FSW ou le SPS complété par 2 mM de L-glutamine, 40 UI/mL de pénicilline G et 100 μg/mL de streptomycine comme suit : Ajouter 100 μL de 2 mM de L-glutamine et 100 μL de mélange de pénicilline/streptomycine à 10 mL de FSW/SPS.
  5. Préparez du bleu de trypan à 0,4 % dans du FSW ou du SPS.
    REMARQUE : La solution mère de rouge neutre a été préparée conformément à Martínez-Gómez et al.33. La solution mère Neutral Red dure environ 2 à 3 semaines lorsqu’elle est conservée à 4 °C. Une solution de coloration rouge neutre et du bleu de trypan à 0,4 % doivent être préparées juste avant le dosage.

4. Échantillonnage de l’hémolymphe

  1. Préremplir une seringue avec 0,5 mL d’eau de mer filtrée FSW ou de SPS physiologique physiologique standard (à 15 °C).
  2. Séparez légèrement et soigneusement les valves le long de la surface ventrale à l’aide d’un scalpel. Maintenez le scalpel en position ou utilisez une pointe de pipette. Laissez l’aiguille d’une seringue hypodermique pénétrer dans l’espace entre les valves.
  3. Prélever délicatement 0,5 mL d’hémolymphe du muscle adducteur postérieur avec la seringue préremplie conformément à l’UNEP/RAMOGE34.
  4. Retirez l’aiguille de la seringue et transférez le contenu de la seringue dans un microtube.
  5. Prélever l’hémolymphe de 3 ou 4 moules et regrouper les échantillons d’hémolymphe dans un tube à 15 °C en utilisant le même rapport entre les individus.
    REMARQUE : Le préremplissage de la seringue est utilisé pour diluer immédiatement l’hémolymphe 1:1 pendant l’échantillonnage. La dilution de l’hémolymphe avec le FSW ou le SPS dans un rapport de 50:50 est couramment utilisée pour prévenir l’agrégation des hémocytes, selon Martínez-Gómez et al.33.

5. Placage et culture des hémocytes

  1. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
  2. Diluer l’hémolymphe à la concentration de 1 × 106 cellules/mL avec FSW ou SPS.
  3. Evaluer la viabilité des hémocytes en suspension par coloration au bleu de Trypan : Ajouter 100 μL de bleu de Trypan à 0,4 % dissous dans le FSW ou le SPS à 100 μL de suspension d’hémocytes. Incuber 5 min à 15 °C.
  4. Ensuite, ajoutez une goutte de suspension dans un hémocytomètre et comptez les cellules non colorées (viables) et colorées (non viables) sous observation microscopique.
  5. Évaluer la viabilité des hémocytes en pourcentage de cellules viables calculé sur le nombre total de cellules comptées35.
  6. Utiliser la formule suivante pour l’évaluation de la viabilité cellulaire35 :
    Cellules viables ( %) = [nombre de cellules viables/nombre total de cellules (viables + non viables)] x 100
  7. S’assurer que la viabilité des hémocytes doit être supérieure à 95 % pour poursuivre le protocole.
  8. Ajouter 50 μL d’hémolymphe diluée dans chaque puits d’une microplaque de polystyrène à fond plat de 96 puits traitée TC de culture cellulaire. Couvrez l’assiette avec son couvercle.
  9. Laisser les hémocytes adhérer au fond des puits pendant 30 min à 15 °C pour former une monocouche.
  10. Retirez l’excès d’hémolymphe en aspirant doucement avec une micropipette.

6. Essai à court terme

  1. Pour les essais à court terme (dans un délai de 1 à 4 heures), incuber immédiatement les cellules adhérentes au fond des puits avec 100 μL de la substance d’intérêt résolue dans le FSW ou le SPS à différentes concentrations à 15 °C. Utilisez au moins trois puits pour trois déterminations répétées de chaque condition expérimentale.
  2. Après l’incubation, évaluez la motilité cellulaire en suivant l’étape 8.

7. Essai d’exposition prolongée

  1. Dans le cas d’expositions prolongées, c’est-à-dire d’essais d’exposition de 24 à 48 heures, incuber les cellules adhérentes en culture à des concentrations croissantes de la substance d’essai dissoute dans le milieu de culture (FSW ou ASW) complétée par 2 mM de L-glutamine (40 UI/mL de pénicilline G et 100 μg/mL de streptomycine) à 15 °C. Utilisez au moins trois puits pour trois déterminations répétées de chaque condition expérimentale.
  2. Après l’incubation, évaluez la motilité cellulaire en suivant l’étape 8.

8. Évaluation de la motilité cellulaire par microscopie time-lapse

  1. Insérez la plaque multipuits contenant les hémocytes vivants adhérents dans un lecteur multimode.
  2. Évaluez la motilité des cellules vivantes adhérentes par imagerie en temps réel sur la plaque grâce à la microscopie time-lapse : capturez des images de la même région d’intérêt (ROI) (dimension du ROI utilisé : 720 μm x 720 μm) dans chaque puits à raison de 1 image toutes les 1 min pendant 10 min à l’aide du lecteur multimode sous grossissement 20x et visualisation en fond clair couleur.
  3. Pour une meilleure visualisation des hémocytes, colorez les cellules avec le colorant vital Neutral Red juste avant la microscopie à intervalle de temps comme suit :
    1. Retirer le milieu d’incubation de chaque puits.
    2. Ajouter 100 μL de solution de coloration de Rouge Neutre dissous dans une solution saline physiologique standard contenant la substance d’intérêt dans les puits de la plaque contenant les cellules adhérentes.
    3. Incuber les cellules à 15 °C pendant 15 min. Lavez l’excès de colorant.
    4. Ajouter 100 μL de la substance d’intérêt résolue dans le FSW ou le SPS. Visualisez les cellules pour l’évaluation de la motilité.
      REMARQUE : L’utilisation d’un lecteur multimode permet l’acquisition simultanée d’images à partir d’un grand nombre de puits, ce qui permet la détection simultanée de la motilité de toutes les conditions expérimentales et répétitions contenues dans le puits. Le colorant rouge neutre est retenu à l’intérieur des lysosomes, qui apparaissent comme de petites taches orange dans le cytoplasme, tandis que le noyau apparaît comme un trou translucide puisque le colorant vital acidophilus ne le tache pas. L’acquisition de l’image a été effectuée pendant 10 min à une température ambiante de 20 °C.

9. Suivi des cellules et calcul des paramètres vélocimétriques

  1. Analysez les images de la même région d’intérêt acquises en microscopie time-lapse par l’image J pour chaque puits.
  2. Enregistrez les images dans un dossier sans espace dans le nom. Les images peuvent être au format JPEG ou PNG.
  3. Ouvrez ImageJ. Cliquez sur Fichier > importer > séquence d’images.
  4. Effectuez le suivi de cellules sur des cellules individuelles à l’aide du plug-in de suivi manuel d’ImageJ. Les positions des cellules individuelles sont marquées dans des images consécutives, ce qui permet de suivre les changements de position au fil du temps.
  5. Analysez au moins 40 cellules par puits, à l’exclusion des cellules qui échappent au champ enregistré de l’analyse.
  6. Importez des ensembles de données à partir du plug-in ImageJ, « Suivi manuel », dans le logiciel Chemotaxis et Migration Tool disponible gratuitement.
  7. Quantifiez les paramètres vélocimétriques tels que la vitesse moyenne, la distance euclidienne, la distance migrée et la directivité à l’aide du logiciel Chemotaxis and Migration Tool selon les instructions détaillées rapportées dans le guide de l’utilisateur du logiciel36disponible gratuitement ou les étapes fournies ci-dessous :
    1. Importez des jeux de données du plug-in ImageJ « Suivi manuel » dans le logiciel Chemotaxis et Migration Tool.
    2. Sélectionnez le nombre de tranches souhaité (par exemple, le nombre d’images utilisées pour le suivi).
    3. Calibrez le logiciel en réglant la taille de pixel x/y et l’intervalle de temps. L’étalonnage x/y indique la longueur du bord d’un pixel en μm, tandis que l’intervalle de temps représente la durée entre chaque tranche.
    4. Après avoir ajusté les valeurs et les paramètres, cliquez sur Appliquer les paramètres.
    5. Tracez des trajectoires et exportez-les sous forme d’image. Cliquez sur le bouton Valeurs mesurées pour voir les valeurs mesurées. Enregistrez-le.
    6. Cliquez sur le bouton Statistiques et enregistrez la vitesse et la franchise de la série de pistes.
  8. Comparer les paramètres vélocimétriques calculés pour les cellules témoins avec ceux des hémocytes exposés à la substance d’essai à différentes concentrations.
    REMARQUE : La distance de migration (mesurée en μm) fait référence à la longueur du chemin de migration pendant la période d’observation (10 min). La distance euclidienne (également mesurée en μm) représente la distance en ligne droite entre le point de départ et le point d’arrivée de la cellule. La vitesse moyenne (exprimée en μm min-1) est calculée comme le rapport entre la distance migrée et la durée du suivi de chaque cellule. La directivité est définie comme le rapport entre la distance euclidienne et la distance accumulée pour chaque trajectoire.

Résultats

L’étude introduit une nouvelle méthode in vitro pour évaluer rapidement et avec sensibilité la toxicité et l’écotoxicité des polluants, en utilisant la motilité des hémocytes de Mytilus galloprovincialis. La figure 1A-C montre une imagerie représentative en accéléré des hémocytes après 30 min de fixation au fond du puits. Les cellules de la figure ont été colorées au rouge neutre juste...

Discussion

Le protocole décrit dans ce travail représente une nouvelle méthode in vitro adaptée à l’évaluation rapide et sensible de la toxicité des médicaments et des polluants basée sur l’évaluation de la motilité des hémocytes de M. galloprovincialis et de ses altérations. La motilité est un aspect particulier de la fonction immunitaire de ces cellules 21,22,23,37,38, par conséquent, toute altération de la motilité cellulaire peut pr...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par le projet « Dipartimento di Eccellenza » attribué à DiSTeBA par le Ministère italien de l’Université et de la Recherche, CUP : F85D18000130001, et par NBFC (National Biodiversity Future Center) financé par l’Union européenne NextGenerationEU, PNRR, projet n. CN00000033. Nous remercions également l’infrastructure BIOforIU du Département des sciences et technologies biologiques et environnementales de l’Université du Salento.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm filter (diameter 25 mm)ABLUO labware
2.5 ml hypodermic syringe needdle 22GRays2522CM32labware
96-well flat-bottom polystyrene TC-treated microplateCorning3916labware
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KGChemical
Chemotaxis and Migration Tool software (Ibidi GmbH)software
Cytation 5 Agilent BioTeckCytation 5Equipment: Cell imaging multimode reader
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merk (Sigma - Aldrich) 472301Solvent
Falcon 15 mL Tube Conical BottomCorning352196labware
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394Chemical
Hemocytometer Fast read 102BiosigmaBVS100labware
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid)Merk (Sigma - Aldrich) H3375-500GChemical
ImageJ softwareNIHsoftware
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Chemical
KClMerk 104936Chemical
L-glutamineMerk (Sigma - Aldrich) G7513Essential amino acid for cell culture medium
MgCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) M2670Chemical
MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) M7506Chemical
Microscope Nikon Eclipse E600NikonEquipment: Cell imaging 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemical
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-RChemical
NaFFluka71519 500gChemical
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KGChemical
Neutral RedMerk (Sigma - Aldrich) N4638-1GVital cell dye
Penicillin/StreptomycinMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLAntibiotics for cell culture
SrCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) 255521Chemical
Trypan blue Merk (Sigma - Aldrich) T8154Cell dye

Références

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