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Resumo

O artigo propõe um novo método in vitro para a avaliação rápida e sensível da toxicidade e ecotoxicidade de poluentes, baseado na motilidade dos hemócitos de Mytilus galloprovincialis . O método visa contribuir para o desenvolvimento de testes de exposição toxicológica e ecotoxicológica mais éticos e sensíveis.

Resumo

Os hemócitos são as células circulantes imunocompetentes em moluscos bivalves e desempenham um papel fundamental em várias funções importantes da imunidade inata mediada por células. Durante os estágios iniciais da resposta imune, os hemócitos migram ativamente para o local da infecção. Essa motilidade inerente é uma característica fundamental dessas células. Representa uma função celular chave que integra vários processos, como adesão celular, sinalização celular, dinâmica do citoesqueleto e alterações no volume celular. Portanto, alterações na motilidade celular após exposição a drogas ou poluentes podem servir como um desfecho toxicológico útil. Apesar do papel fundamental da motilidade celular na fisiologia celular, ela tem sido pouco investigada do ponto de vista toxicológico. Este trabalho propõe um novo método in vitro para a avaliação rápida e sensível da toxicidade e ecotoxicidade de poluentes, baseado na avaliação da motilidade dos hemócitos de Mytilus galloprovincialis. Desenvolvemos um ensaio de motilidade celular em hemócitos aderidos ao fundo de uma microplaca de poliestireno de 96 poços. Após a exposição a concentrações crescentes de drogas, as trajetórias e velocidades celulares foram quantificadas por rastreamento celular sob microscopia de lapso de tempo, permitindo medir os efeitos na motilidade dos hemócitos. Devido à facilidade de coleta de hemócitos dos animais de forma relativamente não invasiva, o método proposto oferece um teste alternativo para triagem dos efeitos e mecanismos de ação de poluentes e fármacos. Ele se alinha com os critérios 3Rs (Substituição, Redução e Refinamento), abordando questões éticas e contribuindo para a redução de testes em animais in vivo em vertebrados.

Introdução

Os métodos baseados em efeitos, como os bioensaios in vitro e in vivo, representam ferramentas inovadoras para a detecção dos efeitos de poluentes químicos ambientais em organismos vivos e para seu uso como ferramentas de monitoramento ambiental e avaliação de riscos 1,2,3,4. Eles complementam a abordagem química analítica clássica, superando algumas de suas limitações. Por exemplo, os métodos baseados em efeitos podem avaliar a biodisponibilidade de poluentes, seu impacto na saúde do organismo e os efeitos toxicológicos combinados das misturas. Esses efeitos combinados podem não ser previsíveis com base apenas na análise química5.

Nos últimos anos, a ecotoxicologia de poluentes de preocupação emergente (poluentes emergentes) representa um campo onde métodos baseados em efeitos podem ser ferramentas úteis para detectar a exposição e avaliar o impacto na biota 1,5,6,7. Vários métodos baseados em efeitos utilizam moluscos bivalves como organismos de ensaio na monitorização e avaliação ambiental 8,9. Algumas características tornam esses organismos adequados para estudos ecotoxicológicos, como sua ampla distribuição, sua natureza filtradora, seu estilo de vida séssil, a capacidade de bioacumulação de uma ampla gama de poluentes ambientais e de desenvolver respostas detectáveis a poluentes, a possibilidade de trabalhar com diferentes estágios de vida e de manter em condições de laboratório7. Eles são altamente sensíveis à exposição à poluição e mostram uma variedade de respostas a contaminantes tóxicos, dependendo da espécie, estágio de vida e condições ambientais 8,9,10. Portanto, várias diretrizes ambientais utilizam espécies de bivalves como espécies de teste padronizadas10,11.

Dentre os moluscos bivalves, o amplamente difundido Mytilus galloprovincialis é uma das espécies mais utilizadas no campo ecotoxicológico devido à sua capacidade de desenvolver respostas detectáveis precocemente à exposição à poluição química, incluindo indução de metalotioneína, alteração enzimática antioxidante, desestabilização da membrana lisossômica, peroxidação lipídica, acúmulo de lipofuscina, aumento da frequência de micronúcleos, indução de anidrase carbônica 12,13,14, 15. Os hemócitos, as células hemolinfáticas imunocompetentes, são amplamente utilizados para estudar os impactos toxicológicos de poluentes ambientais em moluscos bivalves 4,13,16,17. Essas células são cruciais para a resposta imune do organismo, desempenhando várias funções importantes da imunidade inata mediada por células. Isso inclui a eliminação de micróbios por meio de fagocitose e várias reações citotóxicas, como a liberação de enzimas lisossômicas, peptídeos antimicrobianos e a produção de metabólitos de oxigênio durante a explosão respiratória 18,19,20. Os hemócitos são células intrinsecamente móveis 21,22,23 capazes de migrar para o local da infecção durante o estágio inicial da resposta imune do organismo. Em geral, a motilidade é uma característica fundamental que caracteriza todas as células imunes, pois permite a imunovigilância dessas células para proteger o organismo24. Pesquisas em várias espécies de moluscos demonstram que a motilidade dos hemócitos é um componente crítico de sua resposta imune, cicatrização de feridas e interação com patógenos. Essa motilidade é regulada por vias moleculares específicas, destacando a complexidade e especialização das funções dos hemócitos em moluscos 21,25,26,27.

Apesar da importância fundamental da motilidade na fisiologia dos hemócitos, poucos estudos investigaram a sensibilidade da motilidade dos hemócitos a poluentes químicos ambientais 23,28,29,30. Recentemente, nosso grupo caracterizou o movimento espontâneo de hemócitos de Mytilus galloprovincialis em uma microplaca de poliestireno de 96 poços tratada com cultura de tecidos e examinou a sensibilidade da motilidade dos hemócitos à exposição in vitro ao paracetamol23. Os hemócitos de M. galloprovincialis mostraram um movimento celular aleatório baseado em lamelipódios e mudanças rápidas de forma, como encontrado anteriormente em outra espécie de mexilhão, Mytilus edulis 21,22,23,28, e já descrito em células imunes humanas31. Recentemente, a motilidade dos hemócitos demonstrou ser sensível a estressores químicos23,28. Com base nesses achados anteriores, este trabalho propõe um novo método in vitro para a avaliação rápida e sensível da toxicidade e ecotoxicidade de poluentes com base na avaliação da motilidade de hemócitos de M. galloprovincialis e suas alterações, por meio da análise velocimétrica da motilidade celular (quantificação da velocidade média, distância migratória, distância euclidiana e franqueza). O método oferece a possibilidade de rastrear in vitro a toxicidade de várias substâncias, seja em ensaios de curto prazo (com duração de 1-4 h) ou em ensaios de exposição prolongada, com duração de 24-48 h.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com a legislação italiana de bem-estar animal (DL26/2014) que implementou a Diretiva do Conselho do Comitê Europeu (2010/63 EEC). Mytilus galloprovincialis é um bivalve filtrador, comumente conhecido como mexilhão mediterrâneo. É nativa do Mar Mediterrâneo e da costa atlântica do sul da Europa. Foi introduzido e é difundido no oeste da América do Norte, Ásia e África do Sul. É uma importante espécie de pesca comercial em várias partes do mundo. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de água do mar artificial (ASTM) ou água do mar natural filtrada

  1. Para a preparação de água do mar artificial ASW de acordo com ASTM D1141-98 (2021)32, dissolva os seguintes sais em água destilada (g para 1 L): 27,65 NaCl, 0,133 NaHCO3, 3,33 MgCl2· 6H2O, 2,66 Na2SO4, 0,733 CaCl2 · 2H2O, 0,466 KCl, 0,067 KBr, 0,02 H3BO3, 0,013 SrCl2·6H2O, 0,0019 NaF. A solução ASW tem um pH de 7,80.
  2. Para a preparação de água do mar natural filtrada (FSW), filtre a água do mar natural 37 PSU, coletada de um local não impactado por atividades antrópicas com filtros de 0,2 μm.

2. Aclimatação animal

  1. Aclimatar espécimes de mexilhões adultos (Mytilus galloprovincialis Lam.) durante 24 h em tanques estáticos (em caso de fome) contendo ASW ou FSW (1 l/animal) aerados a 15 °C numa sala termostática antes da utilização experimental.

3. Preparação de reagentes para avaliação da motilidade dos hemócitos

  1. Prepare água do mar filtrada (FSW) como acima ou solução salina fisiológica padrão (SPS). Dissolva HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanossulfônico) 4,77 g, NaCl 25,48 g, MgSO4 13,06 g, KCl 0,75 g, CaCl2 1,47 g em aproximadamente 800 mL de água destilada e, em seguida, perfaça até 1 L pela adição de mais água destilada. Ajuste o pH para 7,36 com NaOH 1 M.
  2. Prepare uma solução de estoque vermelho neutro de 20 mg / mL em dimetilsulfóxido (DMSO).
  3. Prepare a solução de coloração Vermelho Neutro: Adicione 5 μL de uma solução estoque de Vermelho Neutro a 995 μL de FSW ou SPS.
  4. Prepare FSW ou SPS suplementado com 2 mM de L-glutamina, 40 UI / mL de penicilina G e 100 μg / mL de estreptomicina da seguinte forma: Adicione 100 μL de 2 mM de L-glutamina e 100 μL de mistura de penicilina / estreptomicina a 10 mL de FSW / SPS.
  5. Prepare 0,4% de azul de tripano em FSW ou SPS.
    NOTA: A solução estoque vermelha neutra foi preparada de acordo com Martínez-Gómez et al.33. A solução-mãe Vermelho Neutro dura cerca de 2-3 semanas quando armazenada a 4 °C. A solução de coloração vermelha neutra e o azul de tripano a 0,4% devem ser preparados imediatamente antes do ensaio.

4. Amostragem de hemolinfa

  1. Encha previamente uma seringa com 0,5 ml de FSW de água do mar filtrada ou SPS de soro fisiológico padrão (a 15 °C).
  2. Separe leve e cuidadosamente as válvulas ao longo da superfície ventral com um bisturi. Mantenha o bisturi na posição ou use uma ponta de pipeta. Deixe a agulha de uma seringa hipodérmica entrar no espaço entre as válvulas.
  3. Colete suavemente 0,5 mL de hemolinfa do músculo adutor posterior com a seringa pré-cheia de acordo com o PNUMA/RAMOGE34.
  4. Retire a agulha da seringa e transfira o conteúdo da seringa para um microtubo.
  5. Colete a hemolinfa de 3-4 mexilhões e agrupe as amostras de hemolinfa em um tubo a 15 ° C usando a mesma proporção entre os indivíduos.
    NOTA: O pré-enchimento da seringa é usado para diluir imediatamente a hemolinfa 1:1 durante a amostragem. A diluição da hemolinfa com FSW ou SPS na proporção de 50:50 é comumente usada para prevenir a agregação de hemócitos, de acordo com Martínez-Gómez et al.33.

5. Plaqueamento e cultura de hemócitos

  1. Conte as células com um hemocitômetro.
  2. Diluir a hemolinfa na concentração de 1 × 106 células/mL com FSW ou SPS.
  3. Avalie a viabilidade dos hemócitos em suspensão pela coloração com azul de tripano: Adicione 100 μL de azul de tripano a 0,4% dissolvido em FSW ou SPS a 100 μL de suspensão de hemócitos. Incubar durante 5 min a 15 °C.
  4. Em seguida, adicione uma gota de suspensão em um hemocitômetro e conte as células não coradas (viáveis) e coradas (não viáveis) sob observação microscópica.
  5. Avalie a viabilidade dos hemócitos como a porcentagem de células viáveis calculada sobre o número total de células contadas35.
  6. Utilizar a seguinte fórmula para a avaliação da viabilidade celular35:
    Células viáveis (%) = [número de células viáveis/número total de células (viáveis + inviáveis)] x 100
  7. Certifique-se de que a viabilidade do hemócito seja superior a 95% para prosseguir no protocolo.
  8. Adicione 50 μL de hemolinfa diluída em cada poço de uma microplaca de poliestireno de fundo plano de 96 poços de cultura de células. Cubra o prato com a tampa.
  9. Permitir que os hemócitos adiram ao fundo dos alvéolos durante 30 min a 15 °C para formar uma monocamada.
  10. Remova o excesso de hemolinfa aspirando suavemente com uma micropipeta.

6. Ensaio a curto prazo

  1. Para ensaios de curto prazo (dentro de 1-4 h), incubar imediatamente as células aderentes ao fundo dos alvéolos com 100 μL da substância de interesse dissolvida em FSW ou SPS em diferentes concentrações a 15 °C. Utilizar pelo menos três alvéolos para três determinações repetidas de cada condição experimental.
  2. Após a incubação, avalie a motilidade celular seguindo a etapa 8.

7. Ensaio de exposição prolongada

  1. Para exposições prolongadas, ou seja, ensaios de exposição de 24-48 h, incubar as células aderentes cultivadas com concentrações crescentes da substância de ensaio dissolvida no meio de cultura (FSW ou ASW) suplementado com 2 mM de L-glutamina (40 UI/ml de penicilina G e 100 μg/ml de estreptomicina) a 15°C. Utilizar pelo menos três alvéolos para três determinações repetidas de cada condição experimental.
  2. Após a incubação, avalie a motilidade celular seguindo a etapa 8.

8. Avaliação da motilidade celular por microscopia de lapso de tempo

  1. Insira a placa multipoços contendo os hemócitos vivos aderentes em um leitor multimodo.
  2. Avalie a motilidade das células vivas aderentes por meio de imagens em tempo real na placa por meio de microscopia de lapso de tempo: capture imagens da mesma região de interesse (ROI) (dimensão da ROI utilizada: 720μm x 720μm) em cada poço a uma taxa de 1 imagem a cada 1 min por 10 min usando o leitor multimodo sob ampliação de 20x e visualização de campo claro colorido.
  3. Para melhor visualização dos hemócitos, core as células com o corante vital Vermelho Neutro imediatamente antes da microscopia de lapso de tempo da seguinte forma:
    1. Remova o meio de incubação de cada poço.
    2. Adicione 100 μL de solução de coloração de Vermelho Neutro dissolvido em solução salina fisiológica padrão contendo a substância de interesse nos poços da placa que contém as células aderentes.
    3. Incubar as células a 15 °C durante 15 min. Lave o excesso de corante.
    4. Adicionar 100 μL da substância de interesse resolvida em FSW ou SPS. Visualize as células para avaliação da motilidade.
      NOTA: O uso de um leitor multimodo permite a aquisição simultânea de imagens de um grande número de poços, permitindo a detecção simultânea da motilidade de todas as condições experimentais e réplicas contidas no poço. O corante vermelho neutro é retido dentro dos lisossomos, que aparecem como pequenas manchas laranja no citoplasma, enquanto o núcleo aparece como um buraco translúcido, uma vez que o corante acidophilus vital não o mancha. A aquisição das imagens foi feita por 10 min a uma temperatura ambiente de 20 °C.

9. Rastreamento celular e cálculo de parâmetros velocimétricos

  1. Analise os quadros da mesma região de interesse adquiridos sob microscopia de lapso de tempo pela Imagem J para cada poço.
  2. Salve as imagens em uma pasta sem espaços no nome. As imagens podem estar no formato JPEG ou PNG.
  3. Abra o ImageJ. Clique em Arquivo > Importar > sequência de imagens.
  4. Execute o rastreamento de células em células únicas usando o plug-in de rastreamento manual do ImageJ. As posições das células individuais são marcadas em imagens consecutivas, permitindo o rastreamento de mudanças de posição ao longo do tempo.
  5. Analise pelo menos 40 células por poço, excluindo as células que escapam do campo registrado da análise.
  6. Importe conjuntos de dados do plug-in ImageJ, "Rastreamento manual", para o software Quimiotaxia e Ferramenta de Migração disponível gratuitamente.
  7. Quantifique os parâmetros velocimétricos, como velocidade média, distância euclidiana, distância migrada e franqueza usando o software Chemotaxis and Migration Tool de acordo com as instruções detalhadas relatadas no guia do usuário do softwaredisponível gratuitamente 36ou as etapas fornecidas abaixo:
    1. Importe conjuntos de dados do plug-in ImageJ "Rastreamento manual" para o software Chemotaxis and Migration Tool.
    2. Selecione o número desejado de fatias (por exemplo, o número de imagens usadas para rastreamento).
    3. Calibre o software definindo o tamanho do pixel x/y e o intervalo de tempo. A calibração x/y indica o comprimento da borda de um pixel em μm, enquanto o intervalo de tempo representa a duração entre cada fatia.
    4. Depois de ajustar os valores e parâmetros, clique em Aplicar configurações.
    5. Plote trajetórias e exporte como imagem. Clique no botão Valores medidos para ver os valores medidos. Salve-o.
    6. Clique no botão Estatísticas e salve a velocidade e a franqueza da série de faixas.
  8. Comparar os parâmetros velocimétricos calculados para as células de controlo com os dos hemócitos expostos à substância em estudo em diferentes concentrações.
    NOTA: A distância migrada (medida em μm) refere-se ao comprimento do caminho de migração durante o período de observação (10 min). A distância euclidiana (também medida em μm) representa a distância em linha reta entre o ponto inicial e o ponto final da célula. A velocidade média (expressa em μm min-1) é calculada como a razão entre a distância migrada e a duração do rastreamento celular para cada célula. A franqueza é definida como a razão entre a distância euclidiana e a distância acumulada para cada trajetória.

Resultados

O estudo apresenta um novo método in vitro para avaliar de forma rápida e sensível a toxicidade e ecotoxicidade de poluentes, utilizando a motilidade dos hemócitos de Mytilus galloprovincialis. A Figura 1A-C mostra imagens representativas de lapso de tempo de hemócitos após 30 min de fixação ao fundo do poço. As células da figura foram coradas com Vermelho Neutro pouco antes da avaliação da moti...

Discussão

O protocolo descrito neste trabalho representa um novo método in vitro adequado para a avaliação rápida e sensível da toxicidade de fármacos e poluentes com base na avaliação da motilidade dos hemócitos de M. galloprovincialis e suas alterações. A motilidade é um aspecto peculiar da função imunológica dessas células 21,22,23,37,38, portanto, qualquer alteração na motilidade celular pode pressagiar alterações na função imunológica dessas células.<...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo projeto "Dipartimento di Eccellenza" concedido ao DiSTeBA pelo Ministério Italiano da Universidade e Pesquisa, CUP: F85D18000130001, e pelo NBFC (National Biodiversity Future Center) financiado pela União Europeia NextGenerationEU, PNRR, projeto n. CN00000033. Agradecemos também a infraestrutura BIOforIU no Departamento de Ciências e Tecnologias Biológicas e Ambientais da Universidade de Salento.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm filter (diameter 25 mm)ABLUO labware
2.5 ml hypodermic syringe needdle 22GRays2522CM32labware
96-well flat-bottom polystyrene TC-treated microplateCorning3916labware
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KGChemical
Chemotaxis and Migration Tool software (Ibidi GmbH)software
Cytation 5 Agilent BioTeckCytation 5Equipment: Cell imaging multimode reader
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merk (Sigma - Aldrich) 472301Solvent
Falcon 15 mL Tube Conical BottomCorning352196labware
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394Chemical
Hemocytometer Fast read 102BiosigmaBVS100labware
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid)Merk (Sigma - Aldrich) H3375-500GChemical
ImageJ softwareNIHsoftware
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Chemical
KClMerk 104936Chemical
L-glutamineMerk (Sigma - Aldrich) G7513Essential amino acid for cell culture medium
MgCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) M2670Chemical
MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) M7506Chemical
Microscope Nikon Eclipse E600NikonEquipment: Cell imaging 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemical
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-RChemical
NaFFluka71519 500gChemical
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KGChemical
Neutral RedMerk (Sigma - Aldrich) N4638-1GVital cell dye
Penicillin/StreptomycinMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLAntibiotics for cell culture
SrCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) 255521Chemical
Trypan blue Merk (Sigma - Aldrich) T8154Cell dye

Referências

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