Verbesserung der Effizienz und der Radiomarkierungsausbeute von Kohlenstoff-11-Radioliganden für die klinische Forschung mit der Loop-Methode

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein detailliertes Verfahren zur Herstellung von vier Kohlenstoff-11-Radiotracern mittels der "Schleifenmethode" [¹¹C]methylierung vor. Wir beschreiben das Verfahren zur Synthese von [¹¹C]ER-176 mit Daten für drei weitere Radiotracer: [¹¹C]MRB, [¹¹C]mHED und [¹¹C]PiB. Die Loop-Methode bietet eine effiziente Synthese mit erhöhter radiochemischer Ausbeute gegenüber der herkömmlichen Reaktionsgefäß-Methylierung [¹¹C].

Zusammenfassung

Ein erfolgreiches Positronen-Emissions-Tomographie-Bildgebungsprogramm mit Kohlenstoff-11-Radiotracern erfordert schnelle, effiziente und zuverlässige Synthesemethoden, die eine Zyklotron- und Radiochemiegruppe vor Ort sowie klinisches Personal erfordern, das für den Betrieb unter den einzigartigen Einschränkungen des Kohlenstoff-11-Radionuklids geschult ist. In dieser Studie werden die Vorzüge und Vorteile einer lösungsmittelfreien "Schleifenmethode" untersucht, bei der vier Tracer mit dem Kohlenstoff-11-Radionuklid radioaktiv markiert werden, wodurch die Radioliganden [¹¹C]ER-176, [¹¹C]MRB, [¹¹C]mHED und [¹¹C]PiB hergestellt werden.

Die "Loop-Methode" wird mit der traditionellen reaktorbasierten Methode der Kohlenstoff-11-Methylierung verglichen, wobei dieselben Radiotracer auf der identischen automatisierten Plattform synthetisiert werden. Des Weiteren wird ein vollständiger Überblick über die klinische Forschungsvorbereitung des [¹¹C]ER-176 Radiotracers gegeben. Wie die Herstellung von [¹¹C]ER-176 zeigte, erwies sich die unverlierbare Lösungsmittel-"Schleifenmethode" der heterogenen Alkylierung als effizienter, mit ausgezeichneter radiochemischer Reinheit (99,6 ± 0,6 %, n = 25), höherer und konsistenterer radiochemischer Ausbeute (Ende der Synthese (EOS) = 5,4 ± 2,2 GBq, n = 25) im Vergleich zur Reaktormethode (EOS = 1,6 ± 0,5 GBq, n = 6), erhöhte molare Aktivität (Schleifenmethode = 194 ± 66 GBq/μmol, n = 25; Reaktormethode = 132 ± 78 GBq/μmol, n = 6), zusammen mit einer durchschnittlich 5 min kürzeren Reaktionssequenz.

Einleitung

Unter den Modalitäten der molekularen Bildgebung unterscheidet sich die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) durch die Art und Weise, wie sie die biochemischen Prozesse auflöst, die mit spezifischen physiologischen Zielen oder interessierenden Regionen verbunden sind ^1,2. Die charakteristische Sensitivität und der nicht-invasive Charakter der PET werden für die In-vivo-Visualisierung und Quantifizierung der Pathophysiologie von Krankheiten genutzt, wobei oft Ziele aufgedeckt werden, die durch eher anatomische Bildgebungsverfahren wie Computertomographie (CT)³ oder Magnetresonanztomographie (MRT)⁴ unsichtbar sind. In der modernen molekularen Bildgebung wird PET mit CT oder MRT (PET/CT bzw. PET/MR) kombiniert, wobei die hohe Kontrastauflösung und die quantifizierbaren Bildgebungsparameter von PET genutzt werden, um hochpräzise Dämpfungskorrekturkarten (PET/CT) und eine verbesserte räumliche Auflösung (PET/MR)⁵ zu erhalten, wobei einige Hürden überwunden werden, die sich aus der Variabilität der höheren kinetischen Energien von Positronen aus Radionukliden wie Gallium-68 und Rubidium-82^{ergeben 6}. Diese dual-modalen bildgebenden Verfahren kanalisieren die charakteristischen Attribute jeder einzelnen Modalität und liefern Klinikern oder Forschern eine Fülle von gemeinsam registrierten anatomischen und biochemischen Erkenntnissen über den Studienteilnehmer⁵.

Die klinische Anwendbarkeit dieses bildgebenden Verfahrens ist enorm und bietet die Visualisierung und Messung physiologischer Prozesse auf molekularer Ebene, die so unterschiedlich sind wie der Glukosestoffwechsel ^7,8, die Bindung von Neurotransmitterrezeptoren⁹, die Myokardperfusion¹⁰ und verschiedene neurologische Erkrankungen¹¹. Außerhalb der klinischen Anwendung sind die inhärenten Eigenschaften der PET so ausgerichtet, dass sie eine integrale Rolle bei der diagnostischen und therapeutischen Arzneimittelentwicklung spielen und die Quantifizierung von Parametern wie Bindungspotenzial (BP), Bioverteilung, Verteilungsvolumen (VT) und Arzneimittelrezeptorbelegung (RO%) durch direkte Beobachtung des Zusammenspiels von Pharmakologie, Pharmakokinetik und Pharmakodynamik ermöglichen. Dies wiederum trägt zu den Bestimmungen bei, einschließlich der Frage, ob eine Verbindung ein Ziel bei einer wirksamen Dosiskonzentration (ED₅₀) erreicht, des Ausmaßes der effektiven Durchdringung der Blut-Hirn-Schranke, der metabolischen Integrität der Verbindung und der geeigneten Dosis und des Dosierungsintervalls¹¹.

Bei der Entwicklung einer nützlichen Sonde für die PET-Bildgebung ergibt die Radiomarkierung des Biomoleküls nach der Identifizierung eines geeigneten Biomarkers und der Auswahl eines zugehörigen Liganden die Radiotracersonde für die PET-Studie. Unter den PET-Radionukliden zur Untersuchung biologischer, pharmakologischer oder medizinischer Fragestellungen bietet Kohlenstoff-11 eine Kombination aus synthetischer Vielseitigkeit und günstigen physikalischen Eigenschaften, die seinen breiten Einsatz in verschiedenen Biomolekülen und geeigneten Liganden ermöglicht⁶. Mit einer Positronenemission von 99,8 % und einer Halbwertszeit von 20,4 Minuten¹² ermöglicht Kohlenstoff-11 eine wiederholte Verabreichung an Probanden in kurzen Intervallen, während gleichzeitig mehrstufige Synthesen möglich sind. Diese Vorteile erfordern jedoch eine Anlage mit Zyklotron- und Radiochemie-Fähigkeiten vor Ort⁵.

Solche Anlagen erfordern zuverlässige, leistungsfähige und reproduzierbare Methylierungsverfahren, die die radioaktive Markierung von Vorläufermolekülen ermöglichen, häufig mit dem elektrophilen [¹¹C]iodomthan ([¹¹C]CH₃I) oder [¹¹C]Methyltriflat ([¹¹C]CH₃OTf) Substrat¹³. Ein Radiosynthesemodul, wie es vom Hersteller geliefert wird, ist typischerweise für einen Reaktionsgefäßansatz für [¹¹C]Methylierungsreaktionen¹⁴ konfiguriert. Dies beinhaltet das Abkühlen des Gefäßes für eine effektive [¹¹C]iodomthan- oder [¹¹C]Methyltriflat-Retention bei der Verabreichung, das Verschließen und Erhitzen des Gefäßes, um die Reaktion durchzuführen, das Abschrecken und das anschließende Übertragen des umgesetzten Inhalts in ein Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-System (HPLC) zur semipräparativen Reinigung¹³. Diese Technik ist zwar wirksam¹⁵, weist aber zahlreiche potenzielle strukturelle Versagenspunkte auf, an denen Fläschchensepten, Nadeln und zugehörige Transferleitungen beteiligt sind.

Der Bedarf an einer zuverlässigeren und reproduzierbaren Methylierungsmethode leitete die Untersuchung und Verfolgung einer unverlierbaren Lösungsmittelmodifikation für viele unserer Kohlenstoff-11-Radioliganden-Syntheseprotokolle. Dieser Ansatz zielt darauf ab, die Einschränkungen der konventionellen Reaktionsgefäßmethode zu überwinden und gleichzeitig die Effizienz der Radiomarkierung beizubehalten oder zu verbessern.

Abbildung 2: Design und Ablauf der Reaktionsgefäßsynthese und der Schleifenmethode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die unverlierbare Lösungsmittelchemie verspricht ein effizientes Einfangen und eine Reaktion mit dem radioaktiven Markierungsreagenz durch Verteilen der Vorläuferlösung über eine große Fläche eines Trägermaterials oder einer Trägerstruktur und anschließendes Lenken des gasförmigen Markierungsreagenzes in Kontakt mit dem beschichteten Material^{16, 17}. Dies erhöht das Ausmaß und die Qualität des Kontakts zwischen den beiden Reaktantenphasen^{16, 18}. Zahlreiche Implementierungen und Variationen dieser Technik wurden bereits 1985 dokumentiert 16,17,18,19,20, und sie hat Anwendung bei [¹¹C]methyliodid, [¹¹C]methyltriflat sowie Grignard-Reagenz [¹¹C]Kohlendioxid-Radiomarkierungsreaktionen ^{gefunden 20}. Eine weitere Verfeinerung wurde durch die Erörterung der ursprünglich von Wilson et al. beschriebenen Chemie der unverlierbaren Lösungsmittel-"Loop-Methode" dargestellt, die weder zusätzliche Stützen zu den bereits vom HPLC-Reinigungskreislauf angebotenen noch Erhitzen oder Abkühlen der Reaktionsumgebung¹³ benötigt. Es wurde festgestellt, dass die Radiomarkierung mit der "Loop-Methode" des unverlierbaren Lösungsmittels Iodomthan- und Methyltriflat-Methylierungsreaktionen mit den Vorzügen eines minimalen Übertragungsverlusts, einer hohen radiochemischen Ausbeute, einer hohen molaren Aktivität, einer verkürzten Reaktionszeit und einer einfachen ^7,21,22,23 hervorruft.

Hierin beschreiben wir die Implementierung der "Schleifenmethode" [¹¹C]methylierungstechnik durch unsere Gruppe, die ursprünglich von Wilson¹³ und anderen danach 14,15,18,21,22,23 (siehe Abbildung 2) beschrieben wurde, durch mechanische Modifikation (siehe Abbildung 3) an unserem Synthesemodul (im Folgenden als das Modul bezeichnet). Diese mechanischen Modifikationen hielten sich so weit wie möglich an das ehrgeizige Ethos der Einfachheit und waren minimal und zugänglich, was zu einer allgemeinen Reduzierung der technischen Komplexität führte und nur die Hinzufügung wesentlicher Komponenten zu den bereits vom Modulhersteller installierten Komponenten in Verbindung mit einer standardmäßigen Radiomarkierungsanordnung für Reaktionsgefäße ermöglichte. Dies spiegelt sich in der Entscheidung wider, die vom Modulhersteller bereits gelieferte und vorinstallierte HPLC-Aufreinigungsschleife aus Edelstahl zu verwenden, wie im Folgenden beschrieben, die sich mit den untersuchten Synthesen als kompatibel und effektiv erwiesen hat. Wir diskutieren ausführlich das vollständige und validierte Röntgenprotokoll der Schleifenmethode, das in der klinischen Forschungsproduktion für die Synthese des Radiotracers [¹¹C]-(R)-N-sec-butyl-4-(2-chlorphenyl)-N-methylchinazolin-2-carboxamid,[¹¹C]ER-176 (1) unter Verwendung von Kohlenstoff-11-Jodmethan verwendet wird. Darüber hinaus vergleichen wir zahlreiche Attribute im Zusammenhang mit der Radiomarkierungseffizienz, die sowohl mit der Reaktormethode als auch mit der Loop-Methode an drei zusätzlichen Radioliganden durchgeführt werden, darunter (S,S)-^[11C]Methylreboxetin ([¹¹C]MRB (2)),[¹¹C]-meta-Hydroxyephedrin ([¹¹C]mHED (3)) und 2-[4-[(¹¹C)methylamino]phenyl]-1,3-benzothiazol-6-ol ([¹¹C]PiB (4)), die in unserer Anlage entwickelt wurden, wie durch die Analyse synthetisierter Chargen ermittelt wurde (siehe Tabelle 1 undAbbildung 1 ). Dieser Vergleich verdeutlicht den klaren Vorteil von Parametern wie radiochemischer Ausbeute und molarer Aktivität, die mit der Implementierung der Radiomarkierung nach der "Schleifenmethode" verbunden sind, die durch zugängliche und einfache Modulmodifikationen mit minimalen Kosten für das radiochemische Labor ermöglicht wird.

Protokoll

HINWEIS: Alle Geräte und Synthesen werden entweder in einer bleiabgeschirmten Hotzelle oder in einer Minizelle durchgeführt. ACHTUNG: Aus dem Zyklotron werden hochenergetische Positronen-emittierende Teilchen erzeugt und genutzt. Der Bereich wird mit kalibrierten Geigerzählern überwacht, und die Personen tragen vom Strahlenschutz ausgestellte Dosimetrieringe und -abzeichen. Das gesamte Personal ist für die Arbeit mit hochenergetischen radioaktiven Materialien geschult.

Alle Synthesen werden auf einem sauberen und sterilisierten Modul gemäß unseren internen Standardarbeitsanweisungen (SOP) durchgeführt. Der Reinigungsprozess umfasst die Verwendung von 1 N HCl, Wasser, Aceton und Acetonitril für den Reaktionsteil des Moduls. In der Zwischenzeit wird der Formulierungsteil des Moduls gereinigt und mit Wasser und Ethanol sterilisiert.

1. Die radioaktive Markierung von [ ¹¹C]ER-176 (1) mittels Schleifenverfahren

HINWEIS: Eine Liste der Materialien, die bei der Herstellung von [¹¹C]ER-176 (1) verwendet wurden, finden Sie in der Materialtabelle.

1. Erneuern Sie das Modul für die Herstellung der Schleifenmethode (siehe Abbildung 4A-D). Befestigen Sie ein V8-Ventil an einer Verbindung, die direkt mit der HPLC-Schlaufe verbunden ist. Dadurch wird das Reaktionsgefäß umgangen.
2. Konditionieren Sie den Methanofen (CH₄) 20 Minuten lang bei 350 ^°C mit einem Wasserstoffgasstrom von 100 mL/min, bevor alle Produktionen auf dem Modul durchgeführt werden. Vor dem Fortfahren auf 45 ^°C abkühlen lassen.
3. Konditionieren Sie die CH_4-Falle 20 Minuten lang bei 120 ^°C mit einem Heliumgasstrom von 50 mL/min, bevor alle Produktionen auf dem Modul durchgeführt werden. Vor dem Fortfahren auf 70 ^°C abkühlen lassen.
4. Konditionieren Sie die Methyliodidfalle 20 Minuten lang bei 190 ^°C mit einem Heliumgasstrom von 50 ml/min, bevor alle Produktionen auf dem Modul durchgeführt werden. Vor dem Fortfahren auf 50 ^°C abkühlen lassen.
5. Reagenzienbeladung für das Modul:
   1. Injizieren Sie mit einer 100-μl-Spritze die folgende Mischung durch den Adapter an Position #1 der internen HPLC-Schleife des Sechswegeventils: (R)-N-sec-butyl-4-(2-chlorphenyl)-chinazolin-2-carboxamid (1,0 ± 0,05 mg) in Dimethylsulfoxid-d₆ (100 ± 10 μl) und 6 N Natriumhydroxid (4 μl).
      HINWEIS: Deuterierte Lösungsmittel wurden aufgrund ihrer Verfügbarkeit in Ampullenform ausgewählt und weil sie in der Regel während der Herstellung destilliert werden, um sicherzustellen, dass sie frei von Wasser sind.
   2. Befüllen Sie das V4-Reservoir mit 3,0 ml 0,9 % Natriumchlorid zur Injektion.
   3. Befüllen Sie den V5-Behälter mit 1,0 mL 200-prozentigem Ethanol.
   4. Befüllen Sie das V6-Reservoir mit 10 mL sterilem entionisiertem Wasser.
   5. Füllen Sie den großen Auffangkolben mit 25 mL sterilem entionisiertem Wasser.
   6. Füllen Sie den Formulierungskolben mit 6,0 ml 0,9 % Natriumchlorid zur Injektion.
   7. Stellen Sie sicher, dass die Verabreichungsleitung an einem sterilen, vormontierten Durchstechflasche für das Endprodukt befestigt ist.
   8. Bereiten Sie die mobile Phase mit einem 37:63 (v/v) Gemisch aus Acetonitril und 20 mM Ammoniumhydroxid vor.
   9. Konditionieren Sie die Semi-Prep-Säule mit vier Säulenvolumina der mobilen Phase.
      HINWEIS: Bei der verwendeten Säule handelt es sich um eine Umkehrsäule C₁₈ 100 mm x 10 mm.
6. Während der Vorbereitung des automatisierten Moduls wird das Kohlenstoff-11-Zyklotron-Target (1 % Sauerstoff, 99 % Stickstoff) auf einem 11 MeV-Zyklotron bei 55 μA für 60–80 Minuten auf Dual-Beam-Targets bombardiert, um [¹¹C]Kohlendioxid durch die ¹⁴N(p,α) ¹¹C-Kernreaktion zu erzeugen.
7. Etwa 20 Minuten vor dem Entladen von [¹¹C]Kohlendioxid aus dem Zyklotron auf das Modul starten Sie die validierte Zeitliste für die [¹¹C]ER-176-Synthese, indem Sie auf die Schaltfläche Start klicken. Die CH_4-Säule auf 45 ^°C abkühlen lassen, bevor sie radioaktives Kohlendioxid (^{11 °}C) erhält (siehe Abbildung 3). Die Carbosphärensäulenfalle (CH_4-Falle ) auf -75 ^°C abkühlen lassen.
8. Das in das Modul eingebettete Verfahren zur Umwandlung von [¹¹C]Kohlendioxid in [¹¹C]methyliodid durch einen trockenchemischen Prozess gehe wie folgt vor:
   1. Die Kohlendioxidaktivität von [¹¹C] wird in [¹¹C]Methan umgewandelt, indem mit Wasserstoffgas bei 350 ^°C über einem Nickelkatalysator (Shimalit-Nickel) reagiert wird. Verwenden Sie eine Askaritfalle (Natriumhydroxid), um das nicht umgewandelte ^Kohlendioxidund das gebildete Wasser zurückzuhalten.
   2. Das gebildete [¹¹C]Methan wird zur weiteren Reinigung und Konzentration auf einer Carbosphärensäulenfalle (CH_4-Falle ) bei -75 ^°C eingeschlossen. Um das eingeschlossene [¹¹C]Methan freizusetzen, wird die Carbosphärensäule auf 80 ^°C erhitzt.
   3. Das gereinigte [¹¹C]Methan wird mit elementarem Jod bei 720 ^°C zu [¹¹C]methyliodid ([¹¹C]CH₃I) über eine Helium-Rezirkulationsgaspumpe umgesetzt, wobei der einfallend erzeugte Wasserstoffiodid von einer anderen Askanitfalle zurückgehalten wird, während unumgewandeltes [¹¹C]Methan in den Zirkulationsprozess zurückkehrt.
   4. Das gebildete [¹¹C]CH₃I wird bei Raumtemperatur auf der Methyliodid (MeI)-Säule eingeschlossen, die sich während des Rezirkulationsprozesses angesammelt hat.
   5. Am Ende des Zirkulationsprozesses wird das gesammelte [¹¹C]CH₃I durch Erhitzen auf 190 ^°C unter Heliumstrom (15 mL/min) aus der MeI-Falle freigesetzt, von der MeTf-Säule umgangen und durch ein Rückschlagventil in den 1,5-ml-Edelstahlkreislauf geleitet, der die vorgeladene Vorläuferlösung enthält (Schritt 1.5.1).
9. Sobald das [¹¹C]CH₃I die Schleife 180 s lang durchlaufen hat, injizieren Sie das Reaktionsgemisch zur Reinigung auf die Semi-Prep-HPLC-Säule. Unter folgenden HPLC-Bedingungen sind folgende Bedingungen zu verwenden: mobile Phase mit 37:63 (v/v) Acetonitril: 20 mM Ammoniumhydroxid bei einer Flussrate von 5,0 mL/min und einer UV-Wellenlänge von 235 nm; Retentionszeit (t_R) von [¹¹C]ER-176: ca. 12–14 min. Siehe Abbildung 5.
10. Die Fraktionsprobe wird in einen großen Auffangkolben gegeben, der 25 ml steriles entionisiertes Wasser enthält. Laden Sie das verdünnte Gemisch auf eine C_18-Patrone für die Leichtphasenextraktion (SPE).
11. Waschen Sie das Produkt (1) mit zusätzlichen 10 mL sterilem entionisiertem Wasser.
12. Eluieren Sie das gewünschte Produkt von der C₁₈ light SPE mit Hilfe von 200-prozentigem Ethanol (1 mL). Diese Elution wird zur Injektion in einen mit 0,9 % Natriumchlorid vorgeladenen Formulierungskolben (6 ml) geleitet.
13. Spülen Sie das C₁₈ light SPE mit zusätzlichen 3 mL 0,9 % Natriumchlorid zur Injektion über das V4-Reservoir.
14. Sammeln Sie die endgültige Lösung im Formulierungskolben (~10 mL) und geben Sie sie durch einen 0,22-μm-Sterilisationsfilter in ein vormontiertes steriles, apyrogenes USP Typ I 50 mL-Glasfläschchen, das mit einem Gummiseptum verschlossen und mit einer Aluminiumkappe gecrimpt ist.
15. Entfernen Sie mit Hilfe von Telemanipulatoren ein Aliquot aus dem Fläschchen des Endprodukts als Probe für die Qualitätskontrolle (QC). Unterziehen Sie diese Probe zahlreichen QK-Tests, um sicherzustellen, dass sie den festgelegten Spezifikationen entspricht, bevor sie freigegeben und einem Patienten verabreicht wird (siehe Tabelle 2).
    ANMERKUNG: Wenden Sie dieses Verfahren der Schleifenmethode unter Verwendung von [¹¹C]CH₃I für die Radiomarkierung von (2) an; [¹¹C]CH₃OTf erzeugen und verwenden, um (3) und (4) zu erzeugen (siehe Zusatzdatei 1).
    1. Um der typischen Qualitätskontrollanalyse zu folgen, die in der Einrichtung durchgeführt wird, verwenden Sie Telemanipulatoren, um eine Probe aus dem Fläschchen des Endprodukts in eine TB-Spritze und dann mit einem bleiabgeschirmten Träger in den Qualitätskontrollraum zu übertragen.
    2. Stoßen Sie die Probe in einem bleigeschützten Bereich (L-Block) in ein pyrogenfreies Röhrchen aus und geben Sie sie dann in kleinere Glasfläschchen (50–100 μl) für HPLC- und Gaschromatographie-Analysen (GC) ab.
    3. Verdünnen Sie eine zweite Probe mit pyrogenfreiem Wasser auf die für die bakterielle Endotoxinanalyse geeignete Konzentration.
    4. Beimpfen Sie eine Probe der Endproduktlösung (sowohl in tryptischer Sojabrühe (TSB) als auch in flüssigem Thioglycolatmedium (FTM) als Sterilitätsprobe). Inkubieren Sie diese Proben und beobachten Sie sie auf Wachstum über einen Zeitraum von 14 Tagen.
    5. Tragen Sie ein kleines Aliquot auf einen pH-Streifen auf, um den Säuregehalt/die Basizität der Endproduktlösung visuell zu bestimmen.

2. Reaktionsgefäßverfahren für die radioaktive Markierung von [¹¹C]ER-176 (1)

1. Stellen Sie sicher, dass das Modul gemäß dem internen Reinigungsprotokoll gründlich gereinigt wird.
   1. Verwenden Sie 1 N HCl, Wasser, Aceton und Acetonitril zur Reinigung des Reaktionsteils des Moduls und Wasser gefolgt von Ethanol, um den Formulierungsteil des Moduls zu reinigen und zu sterilisieren.
   2. Konditionieren Sie den Methanofen (CH₄) 20 Minuten lang bei 350 ^°C mit einem Wasserstoffgasstrom von 100 mL/min, bevor alle Produktionen auf dem Modul durchgeführt werden. Vor dem Fortfahren auf 45 ^°C abkühlen lassen.
   3. Konditionieren Sie die CH_4-Falle 20 Minuten lang bei 120 ^°C mit einem Heliumgasstrom von 50 mL/min, bevor alle Produktionen auf dem Modul durchgeführt werden. Vor dem Fortfahren auf 70 ^°C abkühlen lassen.
   4. Konditionieren Sie die MeI-Falle 20 Minuten lang bei 190 ^°C mit einem Heliumgasfluss von 50 mL/min vor allen Produktionen. Vor dem Fortfahren auf 50 ^°C abkühlen lassen. Stellen Sie sicher, dass der V8-Schlauch mit der Nadel im Behälter verbunden ist.
2. Eine Dichtheitsprüfung mit Heliumgas vom Aufnahmeventil (V24 bis V16) bis zum internen MeI-Kreislauf und von V8 zum Behälter unter Verwendung von V23 als Dichtungs-/Abgasquelle durchführen.
3. Reagenzienbeladung für das Modul:
   1. Folgendes hinzufügen: (R)-N-sec-butyl-4-(2-chlorphenyl)-chinazolin-2-carboxamid (1,0 ± 0,05 mg) in Dimethylsulfoxid-d₆ (100 ± 10 μl) und 6 N Natriumhydroxid (4 μl) in den Reaktorbehälter.
   2. Befüllen Sie das V2-Reservoir mit 1,0 mL 37:63 Acetonitril:20 mM Ammoniumhydroxid.
   3. Befüllen Sie das V4-Reservoir mit 3,0 ml 0,9 % Natriumchlorid zur Injektion.
   4. Befüllen Sie den V5-Behälter mit 1,0 mL 200-prozentigem Ethanol.
   5. Befüllen Sie das V6-Reservoir mit 10 mL sterilem entionisiertem Wasser.
   6. Füllen Sie den großen Auffangkolben mit 25 mL sterilem entionisiertem Wasser.
   7. Füllen Sie den Formulierungskolben mit 6,0 ml 0,9 % Natriumchlorid zur Injektion.
   8. Stellen Sie sicher, dass die Zuführleitung mit dem vormontierten sterilen Fläschchen des Endprodukts verbunden ist.
   9. Füllen Sie ein Reservoir mit der mobilen HPLC-Phase (37:63 (v/v) Acetonitril:20 mM Ammoniumhydroxid) und schließen Sie es an die HPLC-Pumpe an.
      HINWEIS: Die verwendete Semi-Prep-Säule ist die gleiche wie oben und mit der mobilen Phase (4 Säulenvolumen) vorkonditioniert.
4. Während der Vorbereitung des automatisierten Moduls wird das Kohlenstoff-11-Zyklotron-Target (1 % Sauerstoff, 99 % Stickstoff) auf einem 11 MeV-Zyklotron bei 55 μA für 60–80 Minuten auf Dual-Beam-Targets bombardiert, um [¹¹C]Kohlendioxid durch die ¹⁴N(p,α) ¹¹C-Kernreaktion zu erzeugen.
5. Etwa 20 Minuten vor dem Entladen von [¹¹C]Kohlendioxid aus dem Zyklotron auf das Modul starten Sie die validierte Zeitliste für die [¹¹C]ER-176-Synthese, indem Sie auf die Schaltfläche Start klicken. Die CH_4-Säule auf 45 ^°C abkühlen lassen, bevor sie radioaktives Kohlendioxid (^{11 °}C) erhält (siehe Abbildung 3). Lassen Sie die Carbosphärensäulenfalle (CH_4-Falle ) auf -75 ^°C abkühlen
6. Das in das Modul eingebettete Verfahren zur Umwandlung von [¹¹C]Kohlendioxid in [¹¹C]methyliodid durch einen trockenchemischen Prozess gehe wie folgt vor:
   1. Die Kohlendioxidaktivität von [¹¹C] wird in [¹¹C]Methan umgewandelt, indem mit Wasserstoffgas bei 350 ^°C über einem Nickelkatalysator (Shimalit-Nickel) reagiert wird. Sowohl nicht umgesetztes [¹¹C]Kohlendioxid als auch gebildetes Wasser werden mit einer Ascaritfalle (Natriumhydroxid) zurückgehalten.
   2. [¹¹°C]Methan wird zur weiteren Reinigung und Konzentration auf einer Karbosphärensäule bei -75 ^°C eingeschlossen. Um das Methan [^{11 °}C] freizusetzen, wird die Karbosphärensäule auf 80 ^°C erhitzt.
   3. Reagiert das gereinigte [¹¹C]Methan mit elementarem Jod bei 720 ^°C zu [¹¹C]methyliodid über eine Umwälzgaspumpe, wobei der einfallend erzeugte Wasserstoff von einer anderen Ascaritfalle zurückgehalten wird, während unumgewandeltes [¹¹C]Methan in den Zirkulationsprozess zurückkehrt, der als interne Kreislaufrezirkulation bezeichnet wird.
   4. Das gebildete [¹¹C]methyliodid wird bei Raumtemperatur auf der MeI-Säule eingeschlossen, das sich während des Rezirkulationsprozesses angesammelt hat.
   5. Am Ende des Zirkulationsprozesses wird die poröse polymere Adsorptionsfalle unter Heliumfluss (30 ml/min) auf 190 ^°C erhitzt, um das gesammelte [¹¹C]methyliodid freizusetzen und durch ein Rückschlagventil in das 3-ml-Reaktionsgefäß für die Kohlen-11-Radiomarkierung von (1) zu leiten.
7. Sobald die Erzeugung und Akkumulation von [¹¹C]methyliodid ein Plateau erreicht haben, wird die Silbertriflatsäule umgangen und das radioaktive Gas durch V8 in das Reaktionsgefäß geleitet, das das Vorläufergemisch enthält. Lassen Sie das [¹¹C]Methyliodid 3 min lang sprudeln, verschließen Sie dann das Reaktionsgefäß und erhitzen Sie es 5 min lang auf 80 ^°C.
8. Sobald die Markierung abgeschlossen ist, wird das Reaktionsgefäß nach 5 Minuten auf 30 ^°C abgekühlt und mit 1 ml mobiler Phase aus dem V2-Reservoir verdünnt.
9. Injizieren Sie das Gemisch zur Reinigung unter den folgenden HPLC-Bedingungen auf die Semi-Prep-HPLC-Säule: mobile Phase von 37:63 (v/v) Acetonitril: 20 mM Ammoniumhydroxid bei einer Flussrate von 5,0 mL/min und einer UV-Wellenlänge von 235 nm; t_R von [¹¹C]ER-176 (1): ca. 9–11 min, siehe Abbildung 6.
10. Die Fraktionsprobe wird in den großen Auffangkolben gegeben, der 25 ml steriles entionisiertes Wasser enthält. Laden Sie diese verdünnte Mischung auf eine SPE-Kartusche C₁₈ light.
11. Waschen Sie das eingeschlossene Produkt (1) mit zusätzlichen 10 ml sterilem entionisiertem Wasser.
12. Eluieren Sie das gewünschte Produkt von der C₁₈ light SPE unter Verwendung von 200 Proof Ethanol (1,0 mL) und leiten Sie es in einen Formulierungskolben, der mit 0,9 % Natriumchlorid zur Injektion (6,0 mL) vorgeladen ist.
13. Spülen Sie das C₁₈ light SPE mit zusätzlichen 3,0 ml 0,9% Natriumchlorid zur Injektion.
14. Sammeln Sie die endgültige Lösung im Formulierungskolben (~10 mL). Führen Sie dieses Medium durch einen 0,22-μm-Sterilisationsfilter in ein vormontiertes steriles, apyrogenes USP Typ I 50-ml-Glasfläschchen, das mit einem Gummiseptum versiegelt und mit einer Aluminiumkappe gecrimpt ist.
15. Verwenden Sie Telemanipulatoren, um ein Aliquot aus dem Durchstechzeug des Endprodukts als Qualitätskontrollprobe (QC) zu entnehmen (siehe Schritt 1.15). Die Probe wird mehreren Tests unterzogen, bei denen der Radiotracer alle Akzeptanzkriterien erfüllen muss, bevor er freigesetzt und an einen Patienten verabreicht wird (siehe Tabelle 2).
    ANMERKUNG: Dieses Reaktorgefäßverfahren unter Verwendung von [¹¹C]CH₃I für die radioaktive Markierung von (2) anwenden; [¹¹C]CH₃OTf erzeugen und verwenden, um (3) und (4) zu erzeugen (siehe Zusatzdatei 1).

Ergebnisse

Die Radiochemie-Gruppe der New York University Langone Health (NYULH) bietet verschiedene Kohlenstoff-11-, Fluor-18- und Gallium-68-Radiotracer an, die sowohl für die Humanforschung als auch für präklinische Anwendungen verwendet werden. Für die Herstellung der PET-Radiotracer werden verschiedene Verfahren eingesetzt. Unser Team verwendet die Schleifenmethode für die Synthese von (1), (2), (3) und (4) (siehe Abbildung 1 und Abbildung 8). Nach Abschluss der Produktion wird ein Aliquot aus dem sterilen Fläschchen mit dem Endprodukt entfernt. Diese Probe wird sowohl für die Inokulation der Endproduktlösung (sowohl in tryptischen Sojabrühe (TSB) als auch in flüssigen Thioglycolatmedien (FTM) als Sterilitätsprobe verwendet) als auch für eine repräsentative Probe der Bulk-Lösung für QC-Tests. Jeder Radiotracer wird QC-Tests unterzogen, bevor das Produkt zur Verabreichung freigegeben wird (siehe Tabelle 2).

Die Qualitätskontrollprüfung umfasst die Visualisierung des Produktaussehens, die Überprüfung der Filterintegrität, die Bestimmung der radionukliden Identität, des pH-Werts, der radiochemischen Identität (Radio-HPLC), der radiochemischen Reinheit (Radio-HPLC), der chemischen Reinheit (HPLC), der molaren Aktivität, der Stärke, des Restlösungsmittels, der Endotoxine und der Sterilität (siehe Tabelle 2). Die folgenden Ergebnisse wurden aus der klinischen Herstellung jedes oben genannten Radiotracers erzielt (siehe Tabelle 1).

Ein repräsentatives analytisches HPLC-Chromatogramm finden Sie in Abbildung 7 und in der ergänzenden Datei 1. Jeder Radiotracer muss alle Spezifikationen der Qualitätskontrolle (siehe Tabelle 2) erfüllen, bevor er freigegeben und einem Probanden verabreicht werden kann.

In der Ergänzenden Datei 1 finden Sie die Mengen an Vorläufern und Reagenzien sowie die analytischen HPLC-Chromatogramme von [¹¹C]MRB (2) (Ergänzende Abbildung 1), [¹¹C]mHED (3) (Ergänzende Abbildung 2) und [¹¹C]PiB (4) (Ergänzende Abbildung 3).

Verbindung	Parameter	Loop-Methode (durchschnittlich ± std)	Reaktormethode (durchschnittlich ± std)
[11K]ER-176	Anzahl der Produktionen	25	6
	Start der Synthese	86 ± 5,0 GBq	52 ± 25,7 GBq
	Ende der Synthese	5,4 ± 2,2 GBq	1,6 ± 0,5 GBq
	Radiochemische Reinheit	99,6 ± 0,6 %	99,9 ± 0,1 %
	ER-176-Konzentration	1,1 ± 0,5 μg/ml	0,63 ± 0,37 μg/ml
	molare Aktivität	194 ± 66 GBq/μmol	132 ± 78 GBq/μmol
	Totale Synthesezeit	36 ± 3 min	44 ± 6 Minuten
[11K]MRB	Anzahl der Produktionen	70	6
	Start der Synthese	84 ± 5,4 GBq	39 ± 11.9 GBq
	Ende der Synthese	3,0 ± 1,2 GBq	1,9 ± 0,7 GBq
	Radiochemische Reinheit	99,5 ± 0,5 %	99,7 ± 0,8 %
	MRB-Konzentration	0,52 ± 0,24 μg/ml	0,68 ± 0,41 μg/ml
	molare Aktivität	190 ± 50 GBq/μmol	99 ± 55 GBq/μmol
	Totale Synthesezeit	35 ± 3 Minuten	42 ± 3 min
[11C]mHED	Anzahl der Produktionen	5	11
	Start der Synthese	69 ± 10,5 GBq	82 ± 4,3 GBq
	Ende der Synthese	5,5 ± 1,3 GBq	3,3 ± 1,0 GBq
	Radiochemische Reinheit	98,2 ± 1,3 %	99,1 ± 0,7 %
	mHED-Konzentration	0,40 ± 0,10 μg/ml	0,52 ± 0,37 μg/ml
	molare Aktivität	301 ± 48 GBq/μmol	155 ± 77 GBq/μmol
	Totale Synthesezeit	27 ± 4 min	32 ± 2 min
[11K]PiB	Anzahl der Produktionen	51	10
	Start der Synthese	86 ± 5,4 GBq	57 ± 17,2 GBq
	Ende der Synthese	3,2 ± 0,8 GBq	1,4 ± 0,2 GBq
	Radiochemische Reinheit	97,0 ± 1,5 %	99,1 ± 1,4 %
	PiB-Konzentration	0,22 ± 0,51 μg/ml	0,30 ± 0,24 μg/ml
	molare Aktivität	201 ± 68 GBq/μmol	207 ± 124 GBq/μmol
	Totale Synthesezeit	35 ± 2 Minuten	36 ± 5 Minuten

Tabelle 1: Ergebnisse aus der Herstellung von [¹¹C]ER-176 (1), [¹¹C]MRB (2), [¹¹C] m HED (3) und [¹¹C]PiB (4) mittels Schleifenmethode oder Reaktionsgefäßmethode. Alle Werte werden am Ende der Synthese angegeben. Abkürzungen: [¹¹C]ER-176 = [¹¹C]-(R)-N-sec-butyl-4-(2-chlorphenyl)-N-methylchinazolin-2-carboxamid; [¹¹K]MRB = (S,S)-[¹¹C]methylreboxetin; [¹¹K]mHED = [¹¹C]-Meta-Hydroxyephedrin; [¹¹K]PiB = 2-[4-[(¹¹C)methylamino]phenyl]-1,3-benzothiazol-6-ol.

Abbildung 1: Strukturen von [¹¹C]ER-176 (1), [¹¹C]MRB (2), [¹¹C] m HED (3) und [¹¹C]PiB (4). Abkürzungen: [¹¹C]ER-176 = [¹¹C]-(R)-N-sec-butyl-4-(2-chlorphenyl)-N-methylchinazolin-2-carboxamid; [¹¹K]MRB = (S,S)-[¹¹C]methylreboxetin; [¹¹K]mHED = [¹¹C]-Meta-Hydroxyephedrin; [¹¹K]PiB = 2-[4-[(¹¹C)methylamino]phenyl]-1,3-benzothiazol-6-ol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Änderungen, die am automatisierten Modul vorgenommen wurden. In Rot ist der Umbau des Synthesemoduls dargestellt, um den Kreislauf für die Herstellung von PET-Radiotracern durch Kohlenstoff-11-Methylierung einzubauen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Modulinstallation und -erneuerung zur Integration der Schleifenmethode für die Kohlenstoff-11-Methylierung von PET-Radiotracern. (A) HPLC-Injektionsschleife mit Verbindungsanschlüssen. (B) Methode des Reaktionsgefäßes. Der rote Pfeil zeigt die V8-Verbindung. (C) Neuinstallation der Loop-Methode, Umgehung des Reaktorbehälters. Es ist zu beachten, dass die V8-Verbindung zum HPLC-Einlass das Reaktionsgefäß umgeht und so den direkten Zugang von [¹¹C]iodomethan oder [¹¹C]methyltriflat zur HPLC-Schleife ermöglicht. (D) Platzierung der Verbindung in Bezug auf den Reaktorbehälter. Beachten Sie die Verbindung zur HPLC-Schlaufe aus Edelstahl. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Semi-Prep HPLC Profile von ER-176 und [¹¹C]ER-176 mit Loop Method Herstellung. (A) Semi-Prep HPLC Profil für ER-176 (1) mittels Loop-Methode bei UV = 235 nm; t_R = 13,2 min. (B) Semi-Prep-Radio-HPLC-Profil für [¹¹C]ER-176 (1); t_R = 12,4 min. Bedingungen: mobile Phase von 37:63 (v/v) Acetonitril: 20 mM Ammoniumhydroxid bei einer Flussrate von 5,0 mL/min. Abkürzung: [¹¹C]ER-176 = [¹¹C]-(R)-N-sec-butyl-4-(2-chlorphenyl)-N-methylchinazolin-2-carboxamid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Semi-Prep-HPLC-Profile von ER-176 und [¹¹C]ER-176 mit Reaktormethode. (A) Semi-Prep-HPLC-Profil von ER-176 (1) mittels Reaktormethodenproduktion bei UV = 235 nm; t_R = 9,8 min. (B) Semi-Prep-Radio-HPLC-Profil für [¹¹C]ER-176 (1); t_R = 9,2 min. Bedingungen: mobile Phase von 37:63 (v/v) Acetonitril: 20 mM Ammoniumhydroxid bei einer Flussrate von 5,5 mL/min. Abkürzungen: [¹¹C]ER-176 = [¹¹C]-(R)-N-sec-butyl-4-(2-chlorphenyl)-N-methylchinazolin-2-carboxamid; t_R = Verweilzeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Analytische HPLC-Profile für ER-176. (A) Analytisches HPLC-Profil der UV-Spektren für ER-176 (1) bei 235 nm; t_R = 6,10 min. (B) Analytisches HPLC-Profil des Radiotracers für [¹¹C]ER-176 (1); t_R = 6,36 min. Bedingungen: 10 μm C18 (2) 100 LC Säule 250 x 4,6 mm; Methanol/Wasser 74/26 mit einer Durchflussrate von 1,5 mL/min. Abkürzung: [¹¹C]ER-176 = [¹¹C]-(R)-N-sec-butyl-4-(2-chlorphenyl)-N-methylchinazolin-2-carboxamid; t_R = Retentionszeit Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Syntheseschema für die Synthese von Kohlenstoff-11-Verbindungen. (i) Die Bildung von [¹¹C]CH₃I und [¹¹C]CH₃OTf, und (iia) die radioaktive Markierung von [¹¹C]ER-176 (1), (iib.) [¹¹K]MRB (2), (iic.)[¹¹K]mHED (3) und (iid.) [¹¹K]PiB (4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Test/Parameter	Leistungsbeschreibung
Aussehen (Sichtprüfung)	Klare, farblose Lösung, die frei von Feinstaub ist
Integrität des Membranfilters	≥ 50 psi
Ph	4.5 - 8.0
Radionuklide Identität (Halbwertszeit)	19,3 - 21,3 Minuten
Radiochemische Identität (Radio-HPLC)	0,90 ≤ tR Prod / t R Std ≤ 1,10
Radiochemische Reinheit (Radio-HPLC)	≥ 95,0 %†
Wirkstoffkonzentration (HPLC)	siehe Anmerkungen*
Chemische Verunreinigungen insgesamt (HPLC)	Siehe Anmerkungen**
Molare Aktivität (@ EOS)	> 9,25 GBq/μmol
Restacetonitril (GC)	≤ 410 Seiten/Min.
Restaceton (GC)	≤ 5.000 ppm
Rückstand von Dimethylsulfoxid (GC)	≤ 5.000 ppm
Restethanol (GC)	≤ 10% (v/v)
Restmethanol (GC)	≤ 3.000 ppm
Restliches N,N-Dimethylformamid (GC)	≤ 880 Seiten/Min.
Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL)	≤ 17,5 EU/ml
Sterilität (innerhalb von 30 h einleiten)	Steril (14 Tage)
Aufzeichnungen über die Vorbereitung	Vollständig und genau
Etiketten	Vollständig, genau, abgestimmt

Tabelle 2: Qualitätskontrollkriterien für die Zulassung oder Ablehnung von Kohlendioxid-11-Radiotracern. † Radiochemische Reinheit ≥ 90,0 % für [¹¹C]mHED; * Wirkstoffkonzentration: [¹¹C]ER-176 ≤ 10 μg/Dosis; [¹¹K]MRB ≤ 10 μg/Dosis; [¹¹K]mHED ≤ 50 μg/Dosis; [¹¹K]PiB ≤ 13,4 μg/Dosis; ** Chemische Verunreinigungen insgesamt: [¹¹C]ER-176 ≤ 1,0 μg/Dosis; [¹¹K]MRB ≤ 1,0 μg/Dosis; [¹¹K]mHED ≤ 5,0 μg/Dosis; [¹¹K]PiB ≤ 1,34 μg/Dosis. Abkürzungen: [¹¹C]ER-176 = [¹¹C]-(R)-N-sec-butyl-4-(2-chlorphenyl)-N-methylchinazolin-2-carboxamid; [¹¹K]MRB = (S,S)-[¹¹C]methylreboxetin; [¹¹K]mHED = [¹¹C]-Meta-Hydroxyephedrin; [¹¹K]PiB = 2-[4-[(¹¹C)methylamino]phenyl]-1,3-benzothiazol-6-ol; EOS = Ende der Synthese; GC = Gaschromatographie; LAL = Limulus-Amöbozyten-Lysat.

Ergänzende Datei 1: Chemikalien und Materialien, Reagenzien für die Schleifen- oder Reaktorgefäßmethode, Qualitätskontrolltests, analytische HPLC-Chromatogramme. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Bei der traditionellen Radiomarkierung von terminalen Heteroatomen mit Kohlenstoff-11-Jodmethan oder Methyltriflat wird das radioaktive elektrophile Gas in ein Reaktionsgefäß geblasen, eingefangen und die Lösung über längere Zeiträume reagieren lassen¹⁸. Das konventionelle Blasenblasen der heterogenen Reaktion kann träge sein und erfordert möglicherweise eine Erwärmung, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu beschleunigen. Vor der Aufreinigung kann ein Abkühlen des Reaktionsmediums auf Raumtemperatur erforderlich sein, gefolgt von der Überführung in eine HPLC-Schleife unter Verwendung von Lösungsmittel (z. B. mobile Phase) zur Aufreinigung des gewünschten Radiotracers. Diese Schritte sind zeitaufwändig, und flüchtige radioaktiv markierte Produkte können während des Transports solcher Materialien verloren gehen.

In unserer Anlage haben wir die Rechtfertigung für die Verwendung der Loop-Methode demonstriert, bei der die Vorläuferlösung auf eine HPLC-Edelstahlschleife aufgetragen wird und die Radiomarkierung der Verbindung innerhalb der Schleife bei Raumtemperatur stattfindet. Die Schleife wird in Linie mit der Abgabe des radioaktiven [¹¹C]CH₃I oder [¹¹C]CH₃OTf gebunden und mit dem Injektionsanschluss eines HPLC-Systems verbunden. Für die Radiomarkierung ist keine Erhitzung erforderlich, und in allen in diesem Manuskript gezeigten Fällen findet die Reaktion in weniger als 3 Minuten statt.

Die Durchflussrate und die Größe der HPLC-Schleife aus Edelstahl scheinen entscheidend für den effizienten Ablauf dieses Prozesses zu sein. Die Tests begannen mit der Variation der Durchflussrate des Trägergases Helium von 8,0 mL/min auf 15,0 mL/min, damit das radioaktive Gas in den Kreislauf eingespeist werden konnte. Buckley untersuchte, wie wichtig es ist, die richtige Durchflussrate anzuwenden und das geeignete Lösungsmittel und Schlingenmaterial^{zu verwenden 15}. Für unser System ist die Flussrate von 15 mL/min für entweder radioaktive elektrophile Spezies von [¹¹C]CH₃I oder [¹¹C]CH₃OTf gut für die Radiomarkierung aller vier in diesem Manuskript diskutierten Radiotracer geeignet. Die für alle Synthesen verwendete Schleife ist eine HPLC-Injektionsschleife aus Edelstahl bei 1,5 mL mit einem Außendurchmesser von 1/16 Zoll und einem ID von 1 mm.

Beim Vergleich der beiden Methoden (Reaktionsgefäß versus Loop-Methode) zeigte die Loop-Methode in unseren Händen eine erhöhte Effizienz der Radiomarkierung zusammen mit einer erheblichen Steigerung der molaren Aktivität am Ende der Synthese (EOS) für die Herstellung von vier am Menschen zugelassenen Radiotracern. Als Beispiel zeigte der Radiotracer [¹¹C]mHED (3) eine 1,6-fache Steigerung der isolierten Endproduktaktivität bei gleichzeitiger Verdoppelung der molaren Aktivität bei EOS. Dieser Trend einer erhöhten Gesamtaktivität ist bei allen vier Radiotracern zu beobachten (siehe Tabelle 1). Zu den weiteren positiven Ergebnissen bei der Verwendung der Loop-Methode gehören eine um 5 Minuten verkürzte Einrichtungszeit und die Tatsache, dass das Reaktionsgefäß nicht gereinigt werden muss, wodurch der Bediener Zeit und den Einsatz von Lösungsmitteln für ein Reinigungsprotokoll spart.

Zu den Nachteilen dieser Methode gehören die Grenzen, an denen Radiotracer mit der Schleifenmethode effektiv markiert werden können. Wenn Wärme für die Radiomarkierung erforderlich ist, ist es schwierig, dieses System so zu modifizieren, dass eine Erwärmung im Inneren der HPLC-Schleife möglich ist. Dieses System erfordert Änderungen an den Rohrleitungen; Diese Eigenschaft, wenn sie nicht "out of the box" bereit ist, kann andere Benutzer davon abhalten, solche Änderungen an ihrer automatisierten Plattform^{vorzunehmen 14}. Da für diese Methode zusätzliche Rohrleitungen und Verschraubungen erforderlich sind (siehe Abbildung 4A-D), steigt das Potenzial für zusätzliche Stellen für radioaktive Freisetzungen bei der Markierung unter diesen Bedingungen. Es ist ratsam, vor jedem Lauf des Moduls eine Dichtheitsprüfung durchzuführen.

Unser Team hat die Loop-Methode implementiert, die bei der von der Investigational New Drug Application (IND) und dem Radioactive Drug Research Committee (RDRC) zugelassenen Produktion von vier Kohlenstoff-11-Radiotracern verwendet wird. In unseren Händen erwies sich diese Methode als ein effizienteres und ergiebigeres Verfahren als die traditionelle Reaktionsgefäßmethode. Zusätzliche Rohrleitungen und Anpassungen der Durchflussrate des Träger-Heliumgases müssen berücksichtigt werden, wenn diese Methode auf die meisten automatisierten Module angewendet wird. Schließlich weist dieses Verfahren Einschränkungen auf und ist nicht geeignet für bestimmte Kohlenstoff-11-Radiotracer, wie z. B. [¹¹C]UCB-J, das eine Aktivierung des Palladium(II)-Zwischenprodukts und das Erhitzen²⁴ des Reaktionsgemisches erfordert.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(4'-Aminophenyl)-6-hydroxybenzothiazole	ABX	5101	Precursor for PiB synthesis (6-OH-BTA-0)
(2S,3S)-Desethylreboxetine	ABX	4407	Precursor for MRB synthesis
Acetic acid	Sigma Aldrich	695092	Reagent used for the synthesis of [11C]PiB
Acetone-d6	Sigma Aldrich	444863	Solvent used for the synthesis of [11C]PiB
Acetonitrile, HPLC-grade	Sigma Aldrich	34998	Various concentrations used in the mobile phase for radiotracer productions
Acetonitrile-d3	Sigma Aldrich	151807	Solvent used for the synthesis of [11C]mHED
Ammonium formate	Sigma Aldrich	798568	Reagent used for the synthesis of [11C]MRB
Ammonium hydroxide	Ricca Chemical	642-16	Reagent used for the synthesis of [11C]ER-176
Analytical balance	Mettler Toledo	M-XS104	Balance used to weigh out materials for productions
Ascarite II	Thermo Fisher	CN-C049U90	Used in drying columns for FxC Pro Module
Biosafety cabinet	Comecer	M-BH4	Used for FPV assembly
(R)-N-sec-Butyl-4-(2-chlorophenyl)-quinazoline-2-carboxamide	ABX	1665.0001	ER-176 precursor
C18 Light Sep-Pak cartridge	WATERS	WAT023501	Solid phase extraction cartridge used in the synthesis of carbon-11 radiotracers
Carboxen, 60 – 80 mesh	Supelco	CN-10478-U	Used in the FxC Pro Module
Compressed – NOS (99% nitrogen/1% oxygen)	Airgas	CN-X02NI99C3003091	Target gas used in cyclotron bombardment
Dispensing hot cell (DHC)	Comecer	M-MIP1-1390	Dispensing radiotracers
Dose calibrator	Capintec	M-CRC-55t	Measuring activity of radiotracers
Endosafe nexgen-PTS	Charles River	PTS150	Endosafe PTS, portable test sytem
Endotoxin PTS - Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Test Cartridge	Charles River	PTS20F	LAL cartridges used to test endotin levels on radiotracers
Ethanol, 200 proof, HPLC-grade	Sigma Aldrich	459828	Used for  final product and  mobile phase of ER, MRB, mHED and PiB
Gas Chromatogram 2030	Shimadzu	M-GC-2030	Measure excipients from radiotracer productions
Graphpac	Supelco, Millipore Sigma	10258	Used in FxC Pro Module for the synthesis of [11C]ER-176, [11C]MRB, [11C]mHED and [11C]PiB
Helium, research grade	Airgas	CN-HER-300	Helium tank, 99.9999% (research grade tank)
Shimadzu LC-20 Series	Shimadzu	Various	Analytical HPLC system
Hydrogen, ultra high purity grade	Airgas	CN-HYUHP-300	Hydrogen tank used for the FxC Pro Module
Iodine	Thermo Fisher	I35	Used in FxC Pro Module, conversion of [11C]CH4 to [11C]CH3I
Luna 10 mm C18 (2) 100 Å 250 x 10 mm column	Phenomenex	00G-4253-N0	Semi-prep column for MRB synthesis
Luna 5 mm C18 (2) 100 Å 250 x 10 mm column	Phenomenex	00G-4252-N0	Semi-prep column for PiB synthesis
Macherey-Nagel MN VP 250/10 Nucleosil 100-5 C18 Nautilus column	Macherey-Nagel	715412.1	Semi-prep column for mHED synthesis
Metaraminol (free base)	ABX	3380.0001	Precursor used in the production of [11C]mHED
Milli-Q Direct 8 DI system	Millipore	M-ZROQ00800	De-ionized water system
N,N-Dimethylformamide-d7	Sigma Aldrich	189979	Solvent used for the synthesis of [11C]MRB
Needle, 18 G x 1	Becton Dickinson	BD 305195	Needles used at various stages of production setup
Needle, 20 G x 1-1/2”	Becton Dickinson	BD 305176	Needles used at various stages of production setup
Needle, 22 G x 4”, Spinal	Air-Tite Products	N224	Needles used at various stages of production setup
Onyx Monolithic C18 100 x 10 mm column	Phenomenex	CH0-7878	Semi-prep column for ER-176 synthesis
Phosphorus Pentoxide with Sicapent indicator	Sigma Aldrich	79610	Used in the synthesis Modules for carbon-11 radiotracer productions
Porapak N	Waters	WAT027047	Material used to pack MeI column in FxC Pro Module
Pressure gauge	Omega	M-DPG1100B-100G	Used for filter integrity test
Shimalite-Ni	Shimadzu Corporation	221-66062	Material packed in CH4 oven of FxCPro Module for conversion from [11C]CO2 to [11C]CH4
Siemens Eclipse 11-MeV cyclotron	Siemens	RDS 111	Particle accelerator used to generate [11C]CO2 gas for carbon-11 productions
Silver Triflate	Sigma Aldrich	483346	Material packed in triflate column of the FxC Pro Module for the production of [11C]mHED and [11C]PiB
Sodium chloride injection (saline, 0.9%), 50 mL	Hospira	0409-4888-50	Saline used in the formulation process of radiotracers
Sodium chloride injection (saline, 0.9% ), 500 mL	Braun	L8001	Reagent used in the synthesis of [11C]mHED, and mobile phase.
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	221465	Reagent used in the synthesis of [11C]ER-176 and other components at different concentration.
Sodium iodide detector	Eckert & Ziegler	PMT/Na-BFC3200	Gamma detector used in-line with HPLC unit
Sterile vial, 50 mL	ALK Allergy	SEV50	50 mL sterile vials used as the
Stainless steel loop	GE	980314/IEG-005118	HPLC injection loop at 1.5 mL possessing an OD 1/16”, ID: 1 mm.
Syringe, 1 mL	Braun	NJ-9166017-02	Syringe used at various stages of production set-up
Syringe, 10 mL	Henke Sass Wolf	4100-X00V0	Syringe used at various stages of production set-up
Syringe, 20 mL	Henke Sass Wolf	4200-X00V0	Syringe used at various stages of production set-up
Syringe, 5 mL	Becton Dickinson	309632	Syringe used at various stages of production set-up
TracerLab FX2C Module	GE	M-P5360QB	Automated module of production of carbon-11 radiotracers
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent used for the synthesis of [11C]PiB
Tuberculin Syringe, with 21 G x 1 Needle, Single-Use, Sterile (1 mL)	Becton Dickinson	BD 309624	Syringe used in pre-assembled final product vials