Das folgende Verfahren enthält detaillierte Schritte, die erforderlich sind, um in vivo- und ex vivo NIRF-Bilder von Kleintieren zu sammeln:

1. Experimentelle Einrichtung

1. Verbinden Sie eine Lichtwellenleiter mit dem Fluoreszenz-Bildgebungssystem über eine Lichtleiter.
2. Wählen Sie den entsprechenden Anregungsfilter für das Experiment aus. Der Anregungsfilter bestimmt die Wellenlänge des Lichts, das an die Probe geliefert werden soll, und sollte so gewählt werden, dass es dem Anregungsspektrum des in die Probe eingeführten Fluorophors entspricht.
3. Wählen Sie den entsprechenden Emissionsfilter aus. Der Emissionsfilter blockiert unerwünschte Spektralkomponenten, die der Autofluoreszenz zugeschrieben werden können, und sollte so gewählt werden, dass sie dem Emissionsspektrum des Fluorophors entspricht.

2. Probenvorbereitung

1. In Vivo
   1. Anästhetisieren Sie das Tier in einer Induktionskammer mit Isofluran in einer Konzentration von 3-4% auf dem Durchflussmesserzifferblatt.
   2. Übertragen Sie das Tier auf einen Nasenkegel, der auf dem Bildgebungsstadium fixiert ist, und halten Sie Isofluran in einer Konzentration von 1-2%. Eine Wärmequelle ist nicht notwendig, da die Tiere in der Regel nur für einen kurzen Zeitraum abgebildet werden (> 5 min), und ihre Körpertemperatur nicht wesentlich abnimmt.
   3. Befestigen Sie die Pfoten des Tieres, um Bewegungsartefakte zu minimieren. Entfernen Sie das Haar aus dem Bereich des Interesses, indem Sie eine Enthaarungscreme auftragen.
   4. Enthaarungscreme auf den kleinsten Bedarf auftragen. Nach 30 s mit einem Gazepad abwischen. Wischen Sie den Bereich ein zweites Mal mit einem Ethylalkohol befeuchteten Gazepad, um die Enthaarungscreme vollständig zu entfernen.
   5. Ophthalmologische Salbe auf die Augen auftragen, um das Trocknen der Hornhaut zu verhindern.
   6. Injizieren Sie die aktivierbare fluoreszierende molekulare Sonde in das Tier. Für diese spezifische Anwendung wurden MMP2-aktivierbare Sonden intravenös in die Schwanzvene injiziert. An diesem Punkt kann die Maus abgebildet werden. Fahren Sie mit dem "Image Acquistion" dieses Protokolls fort, um fortzufahren. Überwachen Sie das Tier während des kurzen Eingriffs auf regelmäßige atmungsaktive s.
2. Ex Vivo
   1. Nach der Injektion der Fluoreszenzsonde, euthanisieren Sie das Tier auf humane Weise nach den AVMA-Richtlinien von 2013 für die Euthaniasie von Tieren. Die Überdosierung von Kohlendioxid_(CO2) ist eine gängige Praxis für die Einschläferne von Kleintieren.
   2. Chirurgische extrahieren Sie das Gewebe oder Organ von Interesse und sorgfältig entfernen überschüssiges Fettgewebe mit Zange.
   3. Spülen Sie das Gewebe in Phosphat gepufferte Saline, um Restblut zu entfernen und legen Sie die Probe direkt auf der bildgebenden Bühne.

3. Bildaufnahme

1. Öffnen Sie die molekulare Bildgebungssoftware und schalten Sie sowohl die Lichtquelle als auch das Fluoreszenz-Bildgebungssystem ein.
2. Öffnen Sie das Erfassungsfenster, und geben Sie die Art der Exposition an, die für die Studie geeignet ist. Zu den verfügbaren Belichtungen gehören: Standardbelichtung zur Aufnahme eines einzelnen Bildes, Time Lapse Exposure zur Erfassung einer Reihe von Bildern über ein festes Zeitintervall und Progressive Belichtung zur Erfassung einer kontinuierlichen Abfolge von Belichtungen zu unterschiedlichen Belichtungszeiten.
3. Wählen Sie UV-Transillumination als Beleuchtungsquelle.
4. Passen Sie mithilfe des in der Vorschau angezeigten Bildes als Referenz den Fokus der Linse, das Sichtfeld und die Blende in der Aufnahmesystemkammer an, um die abgetastete Bildqualität zu optimieren. Passen Sie die Belichtungszeit und -position der Probe an.
5. Schließen Sie das Vorschaufenster, und stellen Sie sicher, dass alle Parameter im Erfassungsfenster mit den Kamera- und Filtereinstellungen übereinstimmen.
6. Klicken Sie auf 'Expose', um das Bild zu erfassen und zu speichern.
7. Standard-Software für molekulare Bildgebung bietet in der Regel eine Vielzahl von Analyse-, Mess- und Bildkorrekturwerkzeugen, um Fluoreszenzsignale für die Bildanalyse zu quantifizieren.
8. Entfernen Sie am Ende der Bildgebungssitzung die Probe/das Tier, schalten Sie das System aus, und reinigen Sie die Bildgebungsphase, um Schäden am System zu minimieren.