Die Entwicklung der qFSM wird durch die NIH U01 GM06230 finanziert.

Abschnitt 1: Beziehen Sie Ihre fluoreszenzmarkierten Aktin für FSM Benötigte Materialien: gereinigtem Aktin, Fluorophor (Alexa, X-Rhodamin empfohlen). G-Puffer, Ultrazentrifuge <ol><li> Eine wichtige Komponente für den Erwerb guter FSM Filme erfordert die korrekte Kennzeichnung von Aktin (oder andere Zytoskelettproteine) mit dem Fluorophor Ihrer Wahl. Wir empfehlen die Verwendung von Fluorophoren Alexa (488, 568 Wellenlängen) und X-Rhodamin Succinimidylester Derivate, die Lysinreste ausgesetzt Ziel auf der Oberfläche von Aktin. </li><li> Bei der Wahl Ihres Fluorophor und seiner entsprechenden Wellenlänge, sicherzustellen, dass Ihr Mikroskop Setup die entsprechenden Filter (Anregung und Emission) und Beleuchtungen hat (Quecksilberdampf-Lampe und / oder Laser), um Ihre Fluoreszenz-Tag unterbringen. Wir empfehlen die Auswahl Wellenlängen im orange bis roten Wellenlängen (560-630 nm), um die Auswirkungen der Auto-Fluoreszenz-und Foto-Schäden zu minimieren und auf ihre Vereinbarkeit mit GFP-Konjugate zu gewährleisten. </li><li> Reine Aktin aus Muskelgewebe Zugehörigkeit zu Rat oder Huhn extrahiert werden, sondern erfordert eine langwierige Extraktion von Muskel-Aceton-Pulver. Muscle Aceton-Pulver kann von Invitrogen erworben werden. Die Kennzeichnung Verfahren ist noch nicht in diesem Protokoll diskutiert, aber finden Sie hier [1] zu finden </li><li> Alternativ können Sie markierte Aktin-Proteinen aus mehreren Anbietern, darunter Zytoskelett Inc. und Invitrogen kaufen. Benutzerdefinierte Beschriftung Dienstleistungen werden auch von Invitrogen zur Verfügung. Gereinigtes, nicht-markierten Aktin (beide Muskel-und nonmuscle Aktin) kann von Zytoskelett Inc. erworben werden </li><li> Ob zum Kauf oder bereiten Sie Ihre eigenen markiertes Aktin entscheiden, wollen Sie sicherstellen, dass die Kennzeichnung Verhältnis irgendwo um 0,3 bis 0,7 Farbstoffe pro Monomer von Aktin. Eine zu hohe Markierungsverhältnis kann Auswirkungen auf die Umsatz-Kinetik (und die Bindung an assoziierten Proteinen) des Aktin-Filamenten, während eine zu niedrige Kennzeichnung Verhältnis zu arm aussehende Flecken (niedrige Signal-Rausch-) führen wird und kann Mikroinjektion Probleme (siehe unten) führen. Dies ist ein entscheidender Faktor, um gute Specklebilder. </li><li> Vor längerer Lagerung sollten die markierten Aktin-Lösung durch das Drehen mit 75.000 geklärt werden - 80.000 xg für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius. Markiertes Aktin sollte in G-Puffer gespeichert und aufbewahrt -80 Grad Celsius. Herstellung von 2 uL Aliquots wird dringend empfohlen, die schädlichen Wirkungen von wiederholtes Einfrieren und Auftauen (führt zu unlöslichen Aggregaten) zu reduzieren. Refrain aus Freilegung der markierten Aktin-Lösung für direktes Licht (wird von Fluorophoren Bleichen). Wir empfehlen die Verwendung undurchsichtige Reaktionsgefäße für die langfristige Lagerung. </li></ol> § 2: Herstellung von Zellen und Mikroinjektion von markiertem Aktin Benötigte Materialien: Mikroinjektion Nadeln, Mikroliterspritze microloaders, vorgewärmt Zelle Medien, Injektionspuffer, Eimer mit Eis, Mikroskop (Phase Ring, Phasenkontrast Objektiv 40x, transjector-, Nadel-Abzieher, Mikromanipulator) <ol><li> Viele Zelltypen sind zugänglich für FSM, aber immer gute Specklebilder ist direkt abhängig von dem Erfolg der Mikroinjektion Verfahren. Bei der Auswahl der Zellen für die FSM, Zellen sollte groß (&gt; 50 um im Durchmesser), sollte verbreitet, wenn vernickelt, und natürlich Anhänger auf Substrate (oder Kunststoff Gewebekulturschalen). Es hilft auch, wenn die Zelle Cytosol nimmt eine Fläche größer als sein Kern. Die oben genannten Kriterien zu gewährleisten, dass die Zellen zugänglich Mikroinjektion werden. Erfolgreiche Kandidaten Zelllinien umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) PtK1 [2,3], newt Lungenzellen [4], und Aplysia [3]. </li><li> , Die mit Säure gewaschen haben; Cells sollten auf Platz Deckgläser (. Keine 1-1/2 22 x 22 mm) beschichtet werden. Standard-Substrat Beschichtung kann auf das Deckglas aufgetragen werden und wirken sich nicht auf die Mikroinjektion. </li><li> Die richtige Auswahl der Mikroinjektion Nadeln ist abhängig von der Größe der Spitze öffnen. In der Regel können Lochgrößen sehr in der Größe von 0,5 um bis so groß wie 3 um. Wir empfehlen jedoch, dass die Injektion von Aktin erfordert eine optimale Öffnung der Größe zwischen 0,5 bis 1 um. Wenn Verstopfung Probleme konsequent auftreten, können größere Loch Größen für die Lieferung von monomeren sowie unerwünschte polymerisiert Aktin-Filamenten unterzubringen. Mikroinjektion Nadeln können durch mehrere Anbieter wie Eppendorf Systeme, die femtotip Mikroinjektion Nadeln machen erworben werden. Alternativ, wenn eine kommerzielle Nadel Abzieher vorhanden ist, kann Glas Mikroinjektion Rohre von Sutter gekauft und zog nach Spezifikation. Für Anfänger empfehlen wir mit 10-20 gezogen Nadeln auf der Hand vor dem Beginn der Injektion. </li><li> Ideal &#39;Injektion Konzentration &quot;(Endkonzentration von Aktin in Ihre Nadel geladen) von Aktin liegt zwischen 0,5 bis 1,0 ug / ul auf Basis eines 40% Kennzeichnung von Farbstoff an Aktin-Monomer. Lower Kennzeichnung Verhältnis Ihrer Aktin kann durch die Injektion bei höheren Konzentrationen (1-3 ug / ul) kompensiert werden. Allerdings wird die Verstopfung Frequenz Ihrer Nadelerhöht werden. Dies kann teilweise durch Verwendung von Nadeln mit größeren Öffnungen gelindert werden. Lager-Konzentration von Aktin kann durch Zugabe von eiskaltem Injektion verdünnt werden. Eiskalte ddH2O kann auch verwendet werden, um schnelle Injektionen zu verdünnen. Zu diesem Zeitpunkt arbeiten alle Lösungen sollten auf Eis gehalten werden. </li><li> Last von 0,5 bis 1,0 uL Ihrer Aktin-Lösung mit einer Mikroliterspritze (Schmalspurbahn - Hamilton), oder alternativ mit einem Microloader Pipettenspitze. </li><li> Sorgfältig verzichten die Aktin-Lösung, durch leichtes Lösen der Lösung. Bubbles sollte vermieden werden, kann aber leicht durch die Aufnahme überschüssiger Flüssigkeit um die Blase entfernt werden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Aktin-Lösung ist komplett Ruhe an der Nadelspitze. Überschüssige Lösung überall entlang der Kapillare der Nadel kann stören die Einspritzmenge. </li><li> Nun vorsichtig die Nadel legen, Vermeidung von Kontakt mit der Nadelspitze, um den Injektor Inhaber. Positionieren Sie die Halterung, so dass die Nadel macht 35-50 Grad-Winkel an der Basis des Mikroskoptisches. Lower Winkel sind bevorzugt. </li><li> Senken Sie die Spitze der Nadel, bis er bricht kaum die Oberfläche der Medien baden Ihre Zellen. </li><li> Jetzt Position der Nadelspitze (ohne Tieferlegung), so dass es direkt über dem Mittelpunkt des Ziels liegt. Wenn die Nadelspitze mit dem Ziel ausgerichtet ist, sollten Sie einen hellen Schein durch das Okular zu sehen. Dies ist das Ende der Nadelspitze. Langsam bewegt die Nadel hin und her (mit dem Manipulator) können besser helfen suchen Sie den Heiligenschein. </li><li> Stellen Sie die z-Fokus auf das Mikroskop, bis Ihre Zellen in klare Sicht sind. Nun, langsam wieder die Spitze, bis die Halo allmählich verengt, bis schließlich konvergieren in der Nadelspitze - Sie benötigen, um den Fokus (z-Position) gleichzeitig zu steuern. Ein zusätzliches Feature zu suchen ist die Welle der Nadel, die lineare Schatten werfen wird. Senken Sie die Nadel wird nach und nach Definition der Nadelschaft. Bei richtiger Ende der Nadel und Ihre Zellen getan werden sollte, sowohl in klar sehen zu können. Leichte Einstellung der Phase-Ring erforderlich, um den Kontrast zu verbessern. </li><li> Bei der Navigation, sicherzustellen, dass die Nadelspitze ist weit über Ihre Zellen zu verhindern Bruch der Nadelspitze. </li><li> Bei der Auswahl der Zellen zu injizieren, sollten die Zellen mit freien Kanten werden vor der Nadelspitze. Dadurch wird sichergestellt, sinkende Steigung der Zelle (aus dicksten Stelle, wo der Kern liegt, um die dünnste Stelle der Vorderkante) wird die Nadelspitze, anstatt parallel zu ihr gerecht zu werden. </li><li> Die Nadel Druck sollte bei 0,3 bis 0,8 bar eingestellt werden. Der konstante Druck wird in einem stetigen Fluss des Aktin-Lösung führen. </li><li> Nach der Entscheidung über eine Zelle zu injizieren, positionieren Sie Ihren Nadel so die Spitze befindet sich neben dem Kern (perinukleären Region, dickste Teil der Zelle, wo der Kern ist nicht direkt unten). </li><li> Langsam senken, und justieren die Position der Nadel, bis die Spitze ist deprimierend die Membran, nun schrittweise abzusenken, bis die Nadelspitze die Membran durchstochen hat. Wenn die Nadel vollständig die Membran durchstochen, wird die Zelle heller erscheinen, sobald Sie sehen diesen Unterschied Heben Sie die Nadel, bis es nicht mehr berührt die Zelle. Die eigentliche Piercing und Injizieren Vorgang dauert 0,5 bis 2 Sekunden. </li><li> Wenn es richtig gemacht, wird die Zelle Form erscheinen unverändert, während zu viel Injektion in schnelle Zurückziehen der Zelle Rand führen wird und in einigen Fällen werden Sie tatsächlich sehen, die Zelle explodiert. </li><li> Wenn Sie nicht sehen, Veränderungen in der Zelle, wenn Mikroinjektion (nicht heller), kann die Nadelspitze geschlossen werden. Sie können diese durch Drücken der &quot;sauberen&quot;-Taste, wenn auf Ihrem transjector testen. Wenn geöffnet ist, wird dies deutlich erhöhen den konstanten Druck Strömung, die durch die Okulare sehen kann - es erscheint wie Wellen und in der Nähe Trümmer zu sehen Dispergieren werden. </li><li> Wenn die Nadelspitze geschlossen ist, können Sie wählen, um eine neue Mikroinjektionsnadel oder versuchen, die Spitze der Nadel durch leichtes Absenken der Nadel, bis die Spitze der Nadel drückt gegen die Deckglas einfügen, wodurch die ganz am Ende der Spitze zu brechen. Der Bruch Bereich sollte nicht mehr als ein 1 / 5 th der Bereich der Nadelspitze (der Teil der Nadel, die an einem Punkt zusammenlaufen beginnt). </li><li> Fahren Sie mit der Injektion, nicht mehr als 20 bis 45 Minuten pro Sitzung Mikroinjektion (wird vom Zelltyp abhängig). In der Regel sind kürzere Sitzungen empfohlen, Stress auf die Zellen zu minimieren. </li><li> Nach Beendigung der Mikroinjektion, ändern Sie die Zelle Medien in der Schale durch Zugabe von frischem vorgewärmten Medien. Dann können Zellen für 30 Minuten in einem Inkubator vor Sicherung wiederherstellen. Dies ermöglicht auch für die Aktin-Zytoskelett in das bestehende Netzwerk zu integrieren. </li></ol> Abschnitt 3: Zusammenbau des Imaging Chamber Benötigte Materialien: Deckglas, doppelseitiges Klebeband, Q-Tips, Pinzetten, valap, kim wischen, Oxyrase, Bildmedien, Rasierklinge, p200 piPette, reines Ethanol <ol><li> Beginnen Sie mit dem Vorwärmen der Bildmedien und Auftauen von 15 uL Aliquot Oxyrase. Achten Sie auf die lichtempfindliche Oxyrase vor Licht zu schützen. Die Zugabe von Oxyrase wird erheblich reduziert die Auswirkungen von Ausbleichen. </li><li> Vorwärmen valap, indem die Temperatur der Heizplatte zu gering. Nicht überhitzen / brennen valap es seine Wirksamkeit als Dichtstoff wird verlieren. </li><li> Wischen Sie den Knopf A Deckglas mit einem Kimwipe mit reinem Ethanol übergossen zu reinigen und zu entfernen kleine Trümmer. </li><li> Stack zwei gleich große Längen (2,5 cm lang) von doppelseitigem Klebeband auf der jeweils anderen, mit einem sauberen, ebenen Untergrund als Plattform. Drücken Sie eventuell eingeschlossene Luftblasen zu einer völlig flachen Ebene zu schaffen. </li><li> Mit einer Rasierklinge geschnitten zwei geraden Streifen entlang der Längsachse, so dass jeder Streifen 0,5 cm in der Breite misst. </li><li> Mit einer Pinzette, statt jedes Streifens an die lange Kante des Deckglas, so dass die zwei Streifen Klebeband eine Lücke in der Mitte Ihres Deckglas schafft. Drücken Sie vorsichtig auf das Band zu einem schönen Siegel mit dem Glas zu machen. Der Klebestreifen wird als Abstandshalter zwischen den Deckglas und dem Deckglas zu handeln. </li><li> Sicherstellen, dass die valap vollständig verflüssigt, bevor Sie den nächsten Schritt zu beginnen. </li><li> Rufen Sie Ihre vorgewärmten Bildmedien, Zugabe von 15 ul Oxyrase um alle 500 uL der Medien. </li><li> Falten Sie Kimwipes in Dreiecke zu erstellen 3 harte Kanten. Dies wird verwendet, um eine trockene Oberfläche für die Band zu schaffen, um auf dem Stick werden. </li><li> Rufen Sie Ihre Zellen aus dem Inkubator. Mit einer Pinzette, schnappen Sie sich einen Ecke des Deckglases. Schnell Ort das Deckglas auf einem Kimwipe (cell Seite nach oben zeigt, nicht das Gewebe zu berühren), und verwenden Sie das gefaltete Kimwipe auf zwei gegenüberliegenden Seiten des Deckglases wischen, um einen halbtrockenen Oberfläche zu erzeugen (auf der Oberfläche, wo Ihre Zellen rest). </li><li> Mit einer Pinzette, schnappen Sie sich einen Ecke des Deckglases und legen Sie es auf Ihrem Deckglas, so dass die trockenen Oberflächen, die beiden Klebestreifen ausgerichtet sind. Beachten Sie, jetzt haben Sie zwei geschlossene Seiten und zwei offene Schlitze. Langsam Pipette 200 ul Ihre Imaging-media-Oxyrase Lösung nahe einer Öffnung. Wichtig ist, dass keine Luftblasen eingeführt werden. Die Lösung sollte bis in den neu zusammengestellten Kammer durch Kapillarkräfte gesaugt werden, damit voll Eintauchen Ihre Zellen in Lösung. </li><li> Mit einem Q-Tip dab die vier Ecken des Deckglases mit zerlassener valap schnell anbringen und Stabilisierung des Deckglas. Sie werden bemerken, dass die valap trocknet sofort (innerhalb von Sekunden bei Raumtemperatur). </li><li> Nun beginnt mit den offenen Seiten (non-Band auf dieser Seite), lag ein dünner Streifen valap mit einem Q-Tip und imitiert ein Bürsten Schlaganfall. Wiederholen Sie dies für den geschlossenen Seiten. Langsam bauen den Mantel des valap, stärkt damit die Dichtung durch die Wiederholung der Beschichtung Schritte. Die valap sollte, um die Kanten zu beschränken, so dass die Mitte des Deckglases klar. </li><li> Reinigen Sie das Mittelteil des Deckglases mit einem Q-Tip mit ddH2O um restliche Medien zu entfernen, wobei darauf bedacht, nicht in die Zellen zu vernichten. Wiederholen Sie die Reinigung mit reinem Ethanol. </li><li> Sie haben jetzt ein vollständig geschlossenes Bildgebung Kammer für Speckle-Imaging optimiert. Mit einem vollständig geschlossenen Gehäuse wird Ihr Fluorophore aus schnell Ausbleichen zu verhindern. </li></ol> Abschnitt 4: Imaging-Zellen Benötigte Materialien: invertiert Weitfeld Mikroskop Mecury Lampe, entsprechende Filter, gekühlte CCD-Kamera mit 6,7 Mikron-Pixel, hohe numerische Apertur, Öl-Immersions-Plan-Apochromat Objektive (60x bis 100x, Phase oder DIC). Vibration Tisch. Imaging-Software. <ol><li> Vorwärmen des Mikroskoptisches bis 37 Grad. Zeigen Sie mit der neu abgeschlossenen Bildgebung Kammer, und warten Sie 10-15 Minuten für die Temperatur, bevor Bildgebung zu stabilisieren. </li><li> Beginnen Sie mit der Fokussierung Ihre Zellen in Hellfeld-, und dann finden Sie Ihre injizierten Zellen durch Umschalten der richtigen Fluoreszenz-Einstellungen. Versuchen Sie, die Zeit der Fluoreszenz Exposition zu verringern Ausbleichen zu minimieren. </li><li> Suchen Sie nach injizierten Zellen, die gesunde gekrümmte Kanten haben. Over-injizierten Zellen (explodierte Zellen) wird zurückgezogen und gezackte Ränder charakterisiert werden, ähnlich wie zahlreiche Filopodien - vermeiden Bildgebung dieser Zellen. </li><li> Acquisition Einstellungen werden auf dem Zelltyp, die Qualität der markierten Aktin-und Mikroskop-Komponenten ab. Allerdings sollten die Belichtungseinstellungen nicht größer als 2 Sekunden, und das Zeitintervall zwischen den Bildern sollte zwischen 5 und 10 Sekunden eingestellt werden. Typische Längen für eine Zeitreihe (pro abgebildet Zelle) kann irgendwo zwischen 10 bis 30 Minuten betragen und wird durch Bleichen Effekte begrenzt. Gain-Einstellungen an der Kamera kann bis eingeschaltet werden, um das Signal-Rausch zu steigern. </li><li> Ideal Speckle-Eigenschaften sollte Speckle-Durchmesser auf den nächsten benachbarten Speckle jeweils ~ 2 Speckle-Abstand. Dies wird gewährleistet eine optimale räumliche und zeitliche Abtasten der Aktin-Struktur. Für Epithelzellen, die gesprenkelten Aktin-Netzwerk homogen erscheinen, mit Flecken gleichmäßig auseinander. Zelllinien, die dichte Stress Fasern oder Lamellipodien Funktionwird unterscheidbar sein, sondern eine punktierte / gesprenkelte Aussehen haben. Exposure-Einstellungen sollten angepasst werden, um die besten gesprenkelt Bilder zu bekommen. </li><li> Over-mikroinjiziert Zellen müssen dicht gepackt Sprenkel, die nicht angezeigt werden diskret. Stress-Fasern und die Lamellipodien verliert seine gepunktete Aussehen. </li><li> Under-mikroinjiziert Zellen erscheint sehr dunkel durch das Okular, mit Sprenkeln, die weit voneinander entfernt sind (&gt; 10 Sprenkel auseinander) und erscheinen nach dem Zufallsprinzip verteilt. Stress-Fasern und die Lamellipodien in diesen Zellen werden ununterscheidbar. </li><li> Key zu erhalten, &quot;gut&quot; Speckle-Filmen ist die Aufrechterhaltung konzentrieren. Dies ist besonders wichtig für die post-Analyse mit Speckle-Flow und Umsatz-Messungen. Dadurch wird die Qualität der quantitativen Analyse wird zum Sperren in den Fokus für die Dauer der Zeitraffer-abhängig. Dies kann besonders anspruchsvoll, wenn die Bildebene ist ziemlich dünn. Andere Faktoren, auf die Stabilität des Mikroskop-System, insbesondere die Bühne Gehäuse und der bildgebenden Kammer ab. Kontrast-basierten Fokussierung kann verwendet werden, wenn Bild-Intervall Länge ausreicht, um diese Funktion unterbringen werden. Weitere Optionen sind den Kauf eines Nah-Infrarot-basierte Fokus-System, das zuverlässige Echtzeit-Fokuseinstellungen bietet. Sie können diese Angebote von Nikon, Olympus und ASI zu finden. </li></ol> Abschnitt 5: qFSM Analyse Dieser Abschnitt ist nicht im Detail diskutiert, aber die Informationen über die Analyse-Software finden Sie hier [5] zu finden. Software Download-Anfragen finden Sie auf unserer Website (lccb.scripps.edu) vorgenommen werden. Behandelte Themen: <ul><li> Lärm-Kalibrierung </li><li> Speckle-Erkennung </li><li> Tracking mit einem hybriden Ansatz der Bildkorrelation-basiertes Tracking der groben Bewegung Speckle-Gebiete und einzelne Partikel-Tracking der detaillierten Bewegung einzelner Flecken. </li><li> Die Berechnung der Polymer-und Abbau Preise aus dem Intensitätsschwankungen während Speckle Erscheinen und Verschwinden Veranstaltungen. </li></ul>

<ol>
	<li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+(FSM)+of+microtubules+and+actin+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li><li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow.">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li><li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells.">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Mehrere wichtige Faktoren sind entscheidend für die erfolgreiche Bilder Speckle erhalten, beginnen aber gute Speckles und enden mit der Qualität Ihrer fluoreszenzmarkierten Aktin. Ein hoher Kennzeichnung von Farbstoff an Aktin-Monomer, um 0,4 bis 0,7 eingestellt wird sichergestellt, dass Flecken erscheinen hell und diskret, während das markierte Protein selbst sollte löslich und frei von Aggregaten. Ebenso wichtig ist die Mikroinjektion Verfahren. Um normalen Zell-Homöostase (und Überleben), müssen Zellen mit ein...

Injektionspuffer (IB) 50 mM Kalium-Glutamat 0,5 M MgCl2 (Anlage 2a) Speichern Sie bis zu 2 Jahre bei -20 ° C &nbsp; G-Puffer 2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8,0 (Anhang 2a) 0,2 mM CaCl2 (Anlage 2a) Fügen Sie unmittelbar vor dem Gebrauch: 0,2 mM ATP (siehe Rezept für 100 mM) 0,5 mM 2-Mercaptoethanol Speichern Sie bis zu 1 Tag bei 4 ° C

live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)

In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Speckle Microscopy (FSM), um hochauflösende Bilder der Aktindynamik in PtK1 Zellen zu erfassen. Ein einzigartiger Vorteil der FSM ist seine Fähigkeit, die Bewegung und Umsatz Kinetik (Montage / Demontage) der F-Aktin-Netzwerk innerhalb lebender Zellen zu erfassen. Diese Technik ist besonders nützlich bei der Ermittlung quantitativer Messungen von F-Aktin-Dynamik, wenn sie mit Computer-Vision-Software (qFSM) gepaart. Wir beschreiben die Auswahl, die Mikroinjektion und Visualisierung von Fluoreszenz-Aktin-Sonden in lebenden Zellen. Wichtig ist, dass ähnliche Verfahren für die Visualisierung von anderen macomolecular Baugruppen. FSM hat für Mikrotubuli, Intermediärfilamente und Haftung Komplexe nachgewiesen.

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Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, Mikroinjektion, und Bildgebung von fluoreszenzmarkierten F-Aktin über fluoreszierende Speckle-Mikroskopie (FSM).

Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

15.8K Aufrufe.  Scripps Institute. Selection, Mikroinjektion, und Bildgebung von fluoreszenzmarkierten F-Aktin über fluoreszierende Speckle-Mikroskopie (FSM).

Serie: Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Forschung

Biologie

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Montage-, Lade-und Alignment einer analytischen Ultrazentrifuge Messkammerdirektanschluss

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Echtzeit-Imaging von Plant Cell Oberflächen Dynamics mit variabler Winkel Epifluoreszenzmikroskopie

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Dreidimensionale Super Resolution Mikroskopie von F-Aktin durch interferometrische fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

Live Cell Imaging zur Bewertung der Dynamik von Metaphasen-Timing und Zellschicksal nach mitotischen Spindelstörungen

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Oligomerisierungsdynamik von Zelloberflächenrezeptoren in lebenden Zellen durch totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Zahlen- und Helligkeitsanalyse

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...