Wir danken Dr. Nicola Wiethölter für die Vorbereitung und Färbung der 1-D Gelen. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 bis ND und SM) gefördert und unterstützt durch ein Forschungsstipendium der Jürgen Manchot Stiftung zu ND.

Teil 1: Zweidimensionale (2-D)-Gelelektrophorese unter Verwendung cup-loading <ol><li> IPG-Streifen Rehydratation und isoelektrische Fokussierung (IEF) <ul><li> Rehydrieren Immobiline DryStrip Gele, pH 6-11 (7 cm) in 125 ul Rehydrationslösung [7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 50 mM hydroxyethyldisulfide und 2% IPG-Puffer pH 6-11] mit Immobiline DryStrip Reswelling Tray für mindestens 10 Stunden. </li><li> Lösen Sie ausgefallene Protein Probe in IEF-Probenpuffer [7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 2% CHAPS, 2% ASB-14, 50 mM hydroxyethyldisulfide und 2% IPG-Puffer pH 6-11] entspricht 60-100 ug Protein pro 100 ul . </li><li> Nach Solubilisierung (mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur), gelten Proteinprobe über anodische cup-loading mit Probengefäße. Das Volumen der Tasse ist 100 ul (Manifold Tassen ermöglichen bis zu 150 ul). Hinweis: Sie können größere Probenmengen zu laden, wenn Sie eine Low-Voltage Schritt am Anfang der Fokussierung Protokoll und füllen die Becher legen, solange es noch ein Flüssigkeitsfilm in der Tasse! </li><li> Führen Sie die isoelektrische Fokussierung für 11.1 kVh in Gradienten-Modus in der Multiphor II Elektrophorese-Einheit. </li></ul></li><li> Äquilibrierung und SDS-PAGE <ul><li> Nach IEF wurden die IPG-Streifen auf Reduktion und Alkylierung unterzogen, jedes Mal 15 Minuten auf einem Schüttler mit 1% Dithiothreitol und 2,5% iodoacetamide jeweils in Gleichgewichtseinstellung Lösung [50 mM Tris-HCl/pH 8,8, 6 M Harnstoff, 30% Glycerin und 2% SDS]. </li><li> Spülen Sie das Gleichgewicht Streifen mit H 2 O und blot sie auf Whatman-Papier, um überschüssige Äquilibrierungspuffer zu entfernen. Danach tauchen die Streifen in SDS-Laufpuffer (1X). </li><li> Zweite Dimension wird durch SDS-PAGE auf eine vertikale Elektrophorese-Systeme mit einer Gesamtleistung Acrylamid-Konzentration von 12% durchgeführt. Die äquilibriert IPG-Streifen wurden auf der Oberseite des Trenngelen platziert und mit heißen Agarose-Lösung [0,5% Agarose in Laufpuffer mit Bromphenolblau]. </li><li> Die Proteine ​​wurden für 2,5 Stunden getrennt, beginnend bei 80 V für 15 Minuten mit 120 V eingehalten werden, bis der Farbstoff vor Erreichen der Unterseite des Gels Kassette. </li></ul></li></ol> Teil 2: Kolloidale Coomassie-Färbung mit CBB G-250 1. Färbelösungen Hinweis: Für die Vorbereitung der Färbelösungen, Chemikalien mit hoher Qualität, wie analysenrein (pa) und Wasser von hoher Reinheit, wie Sie von Millipore Systeme (Milli-Q-Wasser) erhalten. <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Coomassie-Lösung: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 0,02% (w / v) </td><td> CBB G-250 </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> 5% (w / v) </td><td> Aluminiumsulfat-(14-18)-Hydrat </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> Ethanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> Orthophosphorsäure (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> Hinweis: Für die Vorbereitung der Färbelösung wurde die sequentielle Zugabe der Komponenten in der folgenden Reihenfolge einzuhalten: <ol><li> zuerst auflösen Aluminiumsulfat in Milli-Q Wasser </li><li> danach add Ethanol, homogenisieren und mischen CBB G-250, um die Lösung </li><li> wie vor kurzem als Lösung vollständig gelöst ist, fügen Sie Phosphorsäure (die Einarbeitung der Säure zu der alkoholischen Medien lässt die Coomassie Moleküle aggregieren in ihre kolloidalen Zustand) </li><li> endlich füllen sich mit Milli-Q Wasser </li></ol> Hinweis: die endgültige Färbung Lösung ist dunkel grün-bläuliche Aussehen und ist voller Partikel schwimmen um: <ul><li> Nicht Filtrat dieser Lösung! </li><li> Wenn Sie die Reihenfolge der Zubereitung verändert, bekommt man eine violett-bläuliche Lösung, die weniger empfindlich ist. </li></ul><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Entfärbelösung: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> Ethanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> Orthophosphorsäure (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> 2. Färbeverfahren <ul><li> Nach der zweiten Dimension Trennung, entfernen Sie vorsichtig die Gele von den Glasplatten und überführen sie in eine Färbung Gericht mit Milli-Q Wasser gefüllt. </li><li> Waschen Sie die Gele dreimal mit Milli-Q Wasser für 10 Minuten auf einer horizontalen Schüttler (unzureichende Reinigung führt zu einer schlechten Empfindlichkeit, weil die verbleibenden SDS auf den Gelen stört die Begrenzung der Farbstoff an das Protein). </li><li> Schütteln Sie die Coomassie-Lösung vor Gebrauch auf die kolloidalen Teilchen gleichmäßig zu verteilen. </li><li> Inkubieren Sie die Gele gut mit der Coomassie-Lösung durch Schütteln auf einem Schüttler abgedeckt für 2-12 Stunden. Diese Färbung erzeugt marginal Hintergrund, damit Sie die Färbung Fortschritt in zwischen zu beobachten. Hinweis: Nach 10 Minuten können Sie erste Protein-Spots erscheinen, innerhalb von 2 Stunden Inkubation über 80% Färbung zus Höchstmaß abgeschlossen ist. Seit fast 100% Färbung wird Inkubation über Nacht empfohlen. In einigen Fällen, wenn die Menge an Protein angefärbt ist riesig und die Lösung verwandelt sich in ein helles blau, ist eine Aktualisierung der Färbelösung notwendig. </li><li> Nach der Färbung entfernen Sie die Coomassie-Lösung und spülen Sie die Gele zweimal mit Milli-Q Wasser. Hinweis: Sie können die Färbelösung solange Wiederverwendung als Teilchen noch verbleibenden, ansonsten verwerfen (bedenken Sie, dass Ihr Labor können besondere Vorschriften für die Entsorgung haben). </li><li> Entfernen Sie kleben Farbpartikel aus der Färbung Schale mit einem fusselfreien Papiertuch und entfärben für 10 bis 60 Minuten. Hinweis: Sie können auch waschen die Gele nur mit Milli-Q Wasser, aber wir empfehlen nur für präparative Gele, denn es wird eine unregelmäßige, schwache Coomassie Film auf der Gele, die während des Scan-Verfahren entstehen dauern wird. </li><li> Schließlich spülen die Gele zweimal mit Milli-Q Wasser: die Gele werden ihre ursprüngliche Dicke zu erreichen (der Alkohol-Säure-Medien macht die Gele schrumpfen) und Neutralisation in Wasser erhöht sich zusätzlich die Coomassie der Farbintensität. </li></ul> Teil 3: Repräsentative Ergebnisse Wenn Sie die oben beschriebenen Protokoll folgen, werden Sie auf Ihrem 2-D Gel unverwechselbaren gelöst und gut gefärbte dunkelblau Proteinspots zu bekommen. Auch eine 2-D-Gel mit Silber nach Shevchenko et al. 5, ein Protokoll behauptete gute Empfindlichkeit und die Kompatibilität mit der Massenspektrometrie gebeizt Vergleich erreichen wir gleich Färbeergebnisse. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Das Endergebnis der Versuche beschrieben. Kang ist Coomassie-Protokoll (A) führt stark wie die Silberfärbung nach Shevchenko et al. (B) bei der Aufdeckung von Proteinen nach 2-D-Gelelektrophorese. Teil 4: Tipps und Tricks <ul><li> Führen Sie einige Test-Färbungen, bevor es Ihre eigenen Samples. Für unerklärlichen Gründen berichteten wir manchmal, dass ein Protein von Interesse konnte nicht erfolgreich erkannt werden, auch wenn Milligramm angewendet wurden. In diesem Fall empfehlen wir, einige Verdünnungsreihe vorzubereiten, um die Empfindlichkeit zu testen. </li><li> Wenn Sie einen niedrigen in-Gel-Detektion von Protein (en) in der Regel erfolglos Transfer vom Stapel, um das Trenngel in SDS-PAGE haben wird möglicherweise der Grund sein. Sie können nach wie klebrige Proteine ​​durch Färbung das komplette Gel einschließlich der Parkraum zu überprüfen. </li><li> Für eine schnelle Überprüfung Ihrer isoelektrische Fokussierung Ergebnisse können Sie direkt färben die IPG-Streifen ohne weitere zweite Dimension Trennung. </li><li> Gelegentlich drehen Sie die Gele während der Färbung, so dass sie gleichmäßig von beiden Seiten gefärbt sind (wenn Sie die Gele unbewegt zu halten, der Farbstoff nur bindet an einer Seite des Gels). </li><li> Wir erlebten, dass die Lagerung der Färbelösung in einer dunklen Flasche erhöht die Lebensdauer (in transparenten Flaschen bis zu 4 Monate). </li><li> Nach der Färbung und Dokumentation können Sie die Gele in den Kühlschrank für mehrere Jahre (wenn man saure Lösung fügen Sie vermeiden Kontaminationen durch Pilze). </li><li> Entfärbung des Gels Stecker für einen tryptischen Verdaus können durch Erwärmen in einem Heizblock beschleunigt werden. </li></ul>

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	<li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips.">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+Silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li></ol>

Innovative oder nur ein weiterer Coomassie-Protokoll? Im Moment gibt es mehrere Protokolle für Färbeverfahren mit Coomassie Brilliant Blue. Die meisten von ihnen aus kleineren oder größeren Modifikationen eines der am häufigsten verwendeten Protokolle, die von Neuhoff und seine Kollegen haben 2 Ergebnisse. Auch Kang-Protokoll auf Neuhoff-Formel basieren. Aber ist es wirklich eine Alternative Coomassie-Färbung für Proteomforschung? Wir werden Bild zwei Hauptthemen, Nachweisg...

<table border="1" ><tr><td> Name des Produkts </td><td> Firma </td><td> Katalog Nr. </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Für IEF und SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Gele </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> Kann auch verwendet werden 2 Jahre nach Ablaufdatum werden. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Reswelling Tray </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> Nicht mit organischen Lösungsmitteln. Konzipiert für 7-18 cm IPG-Streifen. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> Beinhaltet ein Tablett, Elektrodenhalter, Anode und Kathode Elektroden, Ausrichter und Probengefäß bar und Probengefäße. </td></tr><tr><td> EPS 3501 XL Power Supply </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> Supplies bis 3500 Spannung V. </td></tr><tr><td> Multiphor II Elektrophorese-Einheit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> Beweglichen Elektroden ermöglichen IEF in IPG-Streifen aller Länge (7-24 cm IPG-Streifen) </td></tr><tr><td> PerfectBlue Gel-System Twin S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE in 10x10 cm Mini-Gel-Format. Gel Kammer enthält ein Kühlsystem. </td></tr><tr><td> Für kolloidale Coomassie G-250-Färbung: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Färbeschalen mit Deckel </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> Passend für Mini-Gele. Steckbar auf Schüttler. </td></tr><tr><td> Aluminiumsulfat-18-Hydrat </td><td> Merck </td><td> 1.01102.5000 </td><td> Wir haben beste Erfahrungen mit Merck. Nur verfügbar in 5 kg-Paket. </td></tr><tr><td> Orthophosphorsäure </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> Verkauft in Glasflaschen. </td></tr></table>

fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) ist ein Farbstoff der Regel für die Visualisierung von Proteinen durch SDS-PAGE getrennt verwendet, bietet eine einfache Färbung und hohe Quantifizierung. Darüber hinaus ist es vollständig kompatibel mit massenspektrometrischen Identifizierung von Proteinen. Doch trotz dieser Vorteile ist CBB angesehen werden weniger empfindlich als Silber-oder Fluoreszenz-Färbungen und daher nur selten zum Nachweis von Proteinen in der analytischen Gel-Basis Proteomik Ansätze verwendet. Mehrere Verbesserungen der ursprünglichen Coomassie-Protokoll 1 wurden unternommen, um die Empfindlichkeit der CBB zu erhöhen. Zwei wichtige Änderungen eingeführt wurden, um den Nachweis von low-reiche Proteine, die durch Umwandlung der Farbstoffmoleküle in kolloidalen Teilchen zu verbessern: Im Jahr 1988 angewendet Neuhoff und Kollegen 20% Methanol und höhere Konzentrationen von Ammoniumsulfat in die CBB G-250 basiert Färbelösung 2, und im Jahr 2004 Candiano et al. etablierten Blue Silver mit CBB G-250 mit Phosphorsäure in Gegenwart von Ammoniumsulfat und Methanol 3. Dennoch, all diese Modifikationen nur erlauben eine Detektion von etwa 10 ng Protein. Ein weit fameless Protokoll für kolloidale Coomassie-Färbung wurde von Kang et al. Im Jahr 2002, wo sie Neuhoff ist kolloidales CBB Färbeprotokoll geändert in Bezug auf die komplexierenden Substanzen. Anstelle von Ammoniumsulfat sie verwendet Aluminiumsulfat und Methanol wurde durch das weniger toxische Ethanol 4 ersetzt. Der Roman Aluminium-Färbung in Kang-Studie zeigte eine überlegene Empfindlichkeit, die so niedrig wie 1 ng / Band (Phosphorylase b) mit wenig Sensibilität Variation in Abhängigkeit von Proteinen entdeckt. Hier zeigen wir Anwendung von Kang-Protokoll zur schnellen und sensitiven kolloidale Coomassie-Färbung von Proteinen in analytischen Zwecken. Wir zeigen die schnelle und einfache Protokoll mit zweidimensionalen Gels routinemäßig in unserer Arbeitsgruppe durchgeführt.

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Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Dieses Video ist eine kolloidale Coomassie G-250 Färbung Protokoll nach Kang popularisieren<em&gt; Et al.</em&gt; Für den Nachweis von durchschnittlich 4 ng Protein in Gelen. Die Färbung ist innerhalb von 2 Stunden und ohne jegliche Anstrengung abgeschlossen. Wir verwenden routinemäßig Kang-Protokoll für analytische Zwecke in Gel-Basis Proteomik.

Schnell und feinfühlig Kolloidale Coomassie G-250 Färbung für Proteine ​​in Polyacrylamidgelen

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

40.0K Aufrufe.  University Duesseldorf. Dieses Video ist eine kolloidale Coomassie G-250 Färbung Protokoll nach Kang popularisieren Et al. Für den Nachweis von durchschnittlich 4 ng Protein in Gelen. Die Färbung ist innerhalb von 2 Stunden und ohne jegliche Anstrengung abgeschlossen. Wir verwenden routinemäßig Kang-Protokoll für analytische Zwecke in Gel-Basis Proteomik.

Serie: Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Die Färbung Proteine ​​in Gelen

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Forschung

Biologie

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Denaturierung Urea Polyacrylamidgelelektrophorese (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Mess-Fast-Flux Calcium in Kardiomyozyten

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

Entwicklung eines Kolloidales-Gold-basierten Immunchromatographischer Teststreifen zum Nachweis von Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Der Nachweis von modifizierte Formen von Cytosin Mit Sensitive Immunhistochemie

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

Quantitativer Proteomik-Workflow mit multipler Reaktionsüberwachung basierender Detektion von Proteinen aus menschlichem Hirngewebe

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

Nachweis von Glykosaminoglykanen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Schnell und feinfühlig Kolloidale Coomassie G-250 Färbung für Proteine ​​in Polyacrylamidgelen

Schnell und feinfühlig Kolloidale Coomassie G-250 Färbung für Proteine in Polyacrylamidgelen