Dies ist eine neuartige Gelfärbungsmethode, die eine fluorogene Silbersonde verwendet, um die traditionelle Silberfärbung in eine fluoreszierende Silberfärbung umzuwandeln. Diese Methode zeigte eine verbesserte Leistung im Vergleich zu herkömmlichen Silbernitratfärbung und SYPRO Ruby Färbung, während ein einfaches und einfaches Protokoll ohne Aldehyde verwendet. Demonstriert wird das Verfahren von Alex Wong, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor.
Um dieses Verfahren zu beginnen, verdünnen Sie die Proteinproben mit einer Lösung, die destilliertes Wasser, EINEN LDS-Puffer und ein Probenreduktionsmittel enthält. Richten Sie einen Mini-Geltank mit MES-Puffer ein, um SDS-PAGE mit einem 4-12%Bis-Tris Proteingel durchzuführen. Laden Sie die Brunnen mit der vorbereiteten Proteinprobe, dann führen Sie das Gel mit einer konstanten Spannung von 200 Volt für 30 Minuten.
Nach der Elektrophorese tauchen Sie das Gel in eine 100-Milliliter-Lösung, die Ethanol und Essigsäure enthält, auf einem Orbitalshaker unter und inkubieren Sie das Gel zweimal für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur, während sie bei 50 U/min schütteln. Als nächstes waschen Sie das Gel dreimal mit reinem Wasser in einem sauberen Behälter mit jeder Wäsche von 10 Minuten. Lösen Sie zunächst 0,01 Gramm Silbernitrat in 10 Milliliter Reinstwasser auf, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 0,1% herzustellen, fügen Sie 100 Mikroliter der Stammlösung in 100 Milliliter Reinstwasser, um die Silbernitrat-Arbeitslösung zu machen.
In einer Dunstabzugshaube tauchen Sie das Gel in 100 Milliliter der Silbernitrat-Arbeitslösung in eine versiegelte Glaskammer. Verwenden Sie Aluminiumfolie, um das Gel während der Imprägnierung vor Licht zu schützen und eine Stunde lang zu brüten, während Sie bei 50 Umdrehungen pro Minute auf einem Orbital-Shaker schütteln. Danach das Gel zweimal mit reinem Reinstwasser in einem sauberen Behälter waschen, wobei jede Wäsche etwa 100 Milliliter Wasser und eine Dauer von 60 Sekunden beträgt.
Es ist wichtig, reines Wasser zu verwenden, um das Gel nach dem Silberimprägnierungsschritt zu reinigen, um die Hintergrundfärbung zu minimieren. Fügen Sie zunächst 50 Milliliter Reinstwasser zu drei Milligramm TPE-4TA-Farbstoff hinzu. Beschallen Sie die Lösung für drei Minuten und fügen Sie fünf Mikroliter ein-molar Natriumhydroxid-Lösung zwischen jeder Beschallungssitzung, um den Farbstoff aufzulösen, in der Regel bis zu dreimal.
Überprüfen Sie dann die Fluoreszenz der Lösung unter einer 365-Nanometer-UV-Lampe, um sicherzustellen, dass der Farbstoff vollständig gelöst ist. Nur schwache oder nicht emissive Lösungen deuten auf eine vollständige Auflösung hin. Um die fluorogene Entwicklungslösung vorzubereiten, fügen Sie 10 Milliliter der TPE-4TA-Stammlösung zu 90 MilliliterReinstwasser hinzu.
Verwenden Sie ein pH-Messgerät, um den pH-Wert der Lösung zu überprüfen. Stellen Sie die Lösung auf einen pH-Wert zwischen 7 und 9 ein, indem Sie verdünnte Natriumhydroxidlösung oder Essigsäure verwenden, wenn der pH-Wert anicht eatoriert ist. Als nächstes das Gel in einen sauberen und verschließbaren Behälter mit 100 Millilitern der fluorogenen Entwicklungslösung übertragen und sicherstellen, dass das Gel vollständig eingetaucht ist.
Versiegeln Sie den Behälter und bedecken Sie ihn, um ihn vor Licht zu schützen. Schütteln Sie den Behälter über Nacht auf einem Orbital-Shaker bei 50 Umdrehungen von Euro/Min. und bei Raumtemperatur. Das Gel in einen sauberen Behälter geben und 30 Minuten lang in 100 Milliliter 10% Ethanol entführen.
Dann spülen Sie das Gel in reinem Wasser für fünf Minuten. Das Gel kann auf einem Tischtransilluminator visualisiert oder auf einer Geldokumentationsmaschine am 365-Nanometer-Kanal oder dem 302-Nanometer-Kanal abgebildet werden. In dieser Studie wird eine neuartige fluoreszierende Silberfärbungsmethode verwendet, um Proteine in Polyacrylamidgelen zu färben.
Die Proteinbänder, die durch den fluoreszierenden Silberfleck gebeizt werden, weisen ein intensives Grün unter einer 365-Nanometer-UV-Lampe auf. Alle 14 Proteinbänder sind deutlich sichtbar und korrelieren gut mit den rot gefärbten Bändern des SYPRO Ruby Farbstoffs. Diese fluoreszierende Silberfärbungsmethode scheint eine hohe Auflösung zu haben.
Bei einigen Proteinbändern ist die Empfindlichkeit des fluoreszierenden Silberflecks auch etwas besser als die des fluoreszierenden SYPRO Ruby-Fleckens. Insbesondere die Leistung dieses Fleckens wird für die Proteinbänder zwischen 10 und 40 Kilodalton verbessert, was darauf hindeutet, dass die neue Methode besonders nützlich für den Nachweis von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht ist. Wie man sieht, deuten die Daten auch darauf hin, dass der fluoreszierende Silberfleck eine gute und gleichmäßige Linearität für alle 14 Proteine über ein relativ breites Spektrum an Proteinquantifizierung ergibt.
Während der Silbernitratfleck ein hohes Maß an Hintergrundsignal und verzerrte Spitzen lieferte, erfasste der fluoreszierende Silberfleck die Bänder mit gutem Kontrast und gleichmäßiger Intensitätsverteilung, vergleichbar mit dem SYPRO Ruby Fleck über alle 14 Proteine. Waschschritte sind wichtig, da sie die Restfixierungslösung durch Unterbrechung der Silberimprägnierung oder fluorogenen Entwicklung einschränken. Bei verwendung von Silbernitrat hautkontaktvermeiden.
Reinigen Sie alle Verschüttungen sofort. Tragen Sie Schutzkleidung und Handschuhe und entsorgen Sie sie als chemische Abfälle.
