Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Isolierung von stabförmigen Kardiomyozyten aus jedem Herzgewebe, die dann verwendet werden kann, um den Ploidy- und Keimstatus dieser Kardiomyozyten ohne manuelle Analyse zu messen. Im Vergleich zu anderen Techniken bietet unser Protokoll konsistentere Zellerträge und Zellmorphologie, und im Gegensatz zur Durchflusszytometrie sind wir in der Lage, den Keim- und Ploidiestatus von Kardiomyozyten visuell zu überprüfen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die Herzgewebeteilung und -assoziation leichter zu erkennen ist.
Beginnen Sie, indem Sie die eingeschläferte Maus in eine Supine-Position setzen und die verlängerten Gliedmaßen herunterkleben. Verwenden Sie stumpfköpfige Scheren, um durch die Brust zu schneiden, um das Herz zu belichten. Dann schneiden Sie die absteigende Aorta und die inferialvencava.
Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, die an einem Infusionsset mit einer 23 Gauge Schmetterlingsnadel befestigt ist, um das Herz zu durchdringen, indem Sie drei Milliliter Kaliumchlorid-PBS-Lösung durch den linken Ventrikel injizieren. Achten Sie darauf, nicht durch das Septum zu durchbohren. Dann injizieren Sie 10 Milliliter 4%PFA Lösung für 10 Minuten mit einer Rate von einem Milliliter pro Minute.
Verwenden Sie eine Schere, um das ganze Herz zu entfernen. Und wenn gewünscht, isolieren Sie eine bestimmte Region. Legen Sie das Gewebe in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr, das einen Milliliter 4%PFA-Lösung enthält.
Inkubieren Sie es auf einem Rocker für eine Stunde. Legen Sie das Herz in eine Petrischale mit PBS-Lösung. Drücken Sie es, um alle PFA loszuwerden, die in den Ventrikeln verbleiben, und waschen Sie es in PBS.
Legen Sie das fixierte Herz in eine neue 1,5-Milliliter-Röhre mit Kollagenlösung. Dann bebrüten Das Herz auf einer Wippe bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag das Herz in eine 35-Millimeter-Petrischale mit Kollagenlösung geben und mit Zangen oder Schere in einen Millimeter zerlegen.
Verwenden Sie dann eine Transferpipette, um das dissoziierte Gewebe für zwei Minuten weiter zu trituieren. Wenn Gewebepartikel noch übrig bleiben, verwenden Sie eine Pipette mit einer schmaleren Spitze und setzen Sie die Triturierung fort, bis der Großteil des Gewebes abgebaut ist. Legen Sie ein 200 bis 600 Mikrometer Nylongewebe über ein 15-Millimeter-Zentrifugenrohr.
Fügen Sie den dissoziierten Zellen fünf Milliliter PBS hinzu und filtern Sie sie durch das Nylongewebe. Waschen Sie das Nylongewebe, indem Sie weitere vier Milliliter PBS passieren. Zentrifugieren Sie dann die gefilterte Lösung bei 10 bis 100 mal G für eine Minute.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter PBS vor der Färbung wieder auf. Nachdem Sie die Fidschi-Distribution von Bild J heruntergeladen haben, öffnen Sie Fidschi und klicken Sie auf Hilfe, aktualisieren und verwalten Sie Update-Sites. Überprüfen Sie die Biomed-Gruppe und IFPB-Plugins.
Um die Abhängigkeiten Plugins herunterzuladen, Ellipse Split und morpho lib J.Dann klicken Sie auf Schließen und Änderungen anwenden. Als Nächstes laden Sie RStudio herunter und öffnen Sie es. Kopieren Sie den Code aus dem Textmanuskript in die Befehlszeile von RConsole und drücken Sie die Eingabetaste.
geben Sie dann Y als Antwort auf alle Eingabeaufforderungen ein, um alle unsere Abhängigkeiten zu installieren. Um die Bildquantifizierung durchzuführen, öffnen Sie Fidschi und ziehen Sie die Analyse. py in die Statusleiste.
Wenn das Skriptbearbeitungsfenster geöffnet wird, klicken Sie in der linken unteren Ecke auf Ausführen. Ein Dialogfeld wird angezeigt, in dem nach dem Speicherort des Ausgabedatenverzeichnisses gefragt wird. Wählen Sie den Ordner aus, in dem alle Analysedaten, Zahlen und anderen von der Software verwendeten Daten gespeichert werden sollen.
Wählen Sie in den Analyseparametern die Position der zu analysierenden Bilder aus, und geben Sie das Bilddateinamenformat mithilfe regulärer Ausdrücke ein. Nachdem Sie die gewünschten Einstellungen ausgewählt haben, klicken Sie auf OK. Wenn Bilder aus verschiedenen Phasen der Analysepipeline auf dem Bildschirm angezeigt werden, überprüfen Sie sie, um sicherzustellen, dass die Schwellenwerte und segmentieren ordnungsgemäß auftreten. Open analyzemultinuatedserver.
r in Rstudio. Geben Sie als Nächstes den Dateipfad in den Ausgabedatenordner ein, der im letzten Schritt ohne den endgültigen Schrägstrich ausgewählt wurde. Klicken Sie in der oberen linken Ecke des Skriptbearbeitungsfensters auf App ausführen.
Verwenden Sie die Schieberegler, um Schwellenwerte für die minimale gültige nukleare Mittlere Intensität, den minimalen gültigen Schwellenwert für den Kernbereich und den maximal gültigen Mindestdurchmesser für Frettchen für Kardiomyozyten festzulegen. Scrollen Sie nach unten, und klicken Sie auf Ausgewählte Schwellenwerte anwenden, und klicken Sie dann auf die Plotintensitätsverteilung, wodurch ein Diagramm der Kernintensitätsverteilung der gesamten Stichprobe sowie separate Subplots für jede Gruppierungsvariable gerendert werden. Um die Intrasample-Variation zu berücksichtigen, scrollen Sie nach unten und überprüfen Sie die Normalisierung separat nach Gruppe, und klicken Sie dann auf Ploidie berechnen und die geschätzte Ploidieverteilung darstellen.
Sobald das normalisierte gesamte Beispieldiagramm angezeigt wird, sollten die beiden Spitzenmuster sichtbar sein. Verwenden Sie die Schieberegler und wählen Sie Schwellenwerte aus, um die diploiden und tetraploiden Spitzen voneinander und Ausreißer zu isolieren. Scrollen Sie dann nach unten und klicken Sie auf Ploidie und Keimbildung berechnen.
Klicken Sie schließlich auf das Schaltflächendiagramm und speichern Sie es im Ergebnisordner. Diese Methode kann verwendet werden, um gleichmäßig singuläre Kardiomyozyten zu isolieren, die relativ rein sind, ohne Zellen zu kontaminieren. Es ist einfach zu implementieren und bietet konsistente Cardiomyozytenausbeute und Qualität aus verschiedenen Isolationen.
Mit diesem Protokoll isolierte Kardiomyozyten können mit Antikörpern und fluorchromen konjugierten Aziden gefärbt werden. Um das charakteristische Z-Linien-Färbemuster von Sarkomen zu zeigen, wurden die Zellen mit Antikörpern gefärbt, die Alpha-Actinin erkennen. In einem separaten Experiment wurde EdU Mäusen verabreicht, bevor sie feste Kardiomyozyten isolierte.
Nach der Isolierung wurden die mononukleierten, binucleierten und trinukleierten Kardiomyozyten, die eine S-Phase durchlaufen hatten, nachgewiesen. Um einzelne Kerne zu identifizieren, wurde das ursprüngliche DNA-gefärbte Bild basierend auf der Intensität abgeschwellt. Ellipsen passten zu den Kernmasken und segmentieren einzelne Kerne.
Als nächstes wurden die Pixel des Bildes in Gebiete aufgeteilt, die auf der Ellipse basieren, zu der sie am proximalsten sind, und die Grenzen dieser Territorien wurden verwendet, um Linien durch nukleare Cluster zu zeichnen. Ein ähnlicher Segmentierungsprozess wurde verwendet, um Kardiomyozyten zu erkennen. Diese Segmentierungsstrategie zeigte, dass die Mehrheit der Kardiomyozyten von neugeborenen Mäusen mononukleiert sind.
Die Häufigkeit mononukleierter Kardiomyozyten ist bei zwei Wochen alten Mäusen, wo sie etwa 25% der gesamten Kardiomyozytenpopulation ausmachen, viel geringer. Bei der Messung des Ploidie-Status einzelner Kerne in Kardiomyozyten wurde bei jugendlichen Mäusen eine höhere Häufigkeit von Tetraploidenkernen nachgewiesen. Bei der Isolierung von Kardiomyozyten ist es wichtig zu überprüfen, ob alle Zellklumpen ihre Trituration abgebrochen haben.
