Die Autoren bedanken sich bei Jeanette Schermuly danken für die Herstellung von rekombinantem T7-RNA-Polymerase und Norman Ebelt für die Unterstützung bei der Vorbereitung Abbildung 1. Diese Arbeit wurde vom Fonds der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) und dem Max-Planck-Gesellschaft finanziert.

Ein. Generation langes Pre-crRNA Substrate mittels PCR <ol><li> PCR-Primer-Design gezielt die Spacerbereiche eines CRISPR Cluster. Hinzufügen des T7-RNA-Polymerase (T7RNAP) Promotorsequenz (5&#39;-taatacgactcactata-3 &#39;) mit dem Vorwärts-Primer und Restriktionsschnittstellen zur Klonierung des PCR-Produkt in einen Vektor für beide Primer (zB BamHI und HindIII für pUC19, Fig. 2A) . Hinweis: Die T7RNAP erfordert eine Guanidinrest für die ordnungsgemäße Initiation der Transkription. </li><li> Amplifizieren pre-Sequenz von Interesse crRNA aus genomischer DNA durch PCR. </li><li> Trennen Sie die PCR-Produkte durch Agarosegelelektrophorese und Gel extrahiert das gewünschte Band. Verdauen das PCR-Produkt mit den Restriktionsenzymen zu klebrigen Enden (zB BamHI und HindIII, Fig. 2A) zu schaffen. Entschlacken Sie Ihren PCR Produkt mit einer PCR-Reinigungskit zur Spaltung Nebenprodukte zu beseitigen. </li><li> Einrichten einer Ligationsreaktion die T4 DNA Ligase enthält, T4-DNA-Ligase-Puffer undein 3:1 Molverhältnis des gespaltenen PCR-Produkt und der dephosphorylierte linearen pUC Vektor mit entsprechenden kohäsiven Enden. Inkubieren der Mischung bei 16 ° C über Nacht. Wandeln Sie die Ligationsgemisch in kompetente Escherichia coli DH5 Zellen durch Standard-Protokolle und verwenden blau weiß Screening erfolgreiche Ligation zu identifizieren. </li><li> Isolieren Plasmiden aus weißen Kolonien mit einem Plasmid Vorbereitung Kit. Identifizieren positive Klone durch Plasmid-Sequenzierung. Alternativ könnte Kolonie-PCR für das Screening verwendet werden. </li></ol> 2. Erzeugung von Zwischen-pre-crRNA Substrate durch Temperung von DNA-Oligonukleotiden <ol><li> Gestalten Sie vorwärts und rückwärts Oligonukleotide mit der gewünschten CRISPR repeat / Spacer-Sequenz. Die Oligonukleotide enthalten die Sequenz eines T7 RNAP Promotor sowie Terminal Restriktionsstellen (zB BamHI und Hind III für pUC19). Beenden Sie die Oligonukleotide, dass sticky ends Form nach dem Glühen zu gewährleisten (siehe Abb. 2B </strong&gt;). </li><li> 5&#39;-phosphorylieren 1 nmol jedes Oligonukleotids in einer separaten Reaktion mit 20 ul 5 ul T4-Polynukleotid-Kinase (PNK), 2 ul T4 PNK 10X Puffer, 2 ul ATP (10 mM). Inkubieren jeder Probe für 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Hybridisieren die beiden phosphorylierten Oligonukleotiden. Kombinieren Sie 1 ul des phosphorylierten Vorwärts Oligo-Mischung (vom 2.2.), 1 ul des phosphorylierten umgekehrter Oligo-Mischung (vom 2.2.), 1 ul T4-DNA-Ligase 10x Puffer in einem 10 ul Reaktion. Inkubieren Sie die Proben für 5 min bei 95 ° C auf einem Heizblock oder in kochendes Wasser, schalten Sie die Wärmequelle und lassen Sie die Mischung abkühlen auf Raumtemperatur (~ 2-3 Stunden). Anmerkung: In diesem kritischen Schritt begünstigt die langsame Abkühlung das Annealing der beiden Oligonukleotide gegenüber der Bildung von Strukturen innerhalb jeder einzelnen Oligonucleotid. </li><li> Ligieren 4 ul der Hybridisierung mix, 1 ul verdaut und dephosphoryliert pUC-Vektor (0,1 ug /ul) mit T4 DNA-Ligase, T4-DNA-Ligase 10x Puffer und 10 mM ATP in einem 20 ul Ligationsgemisch. Inkubieren Sie die Probe bei 16 ° C über Nacht. </li><li> Verwandeln Sie die ligierten Plasmide in kompetente Escherichia coli DH5 Zellen durch Standard-Protokolle und nutzen blau weiß-Screening. Isolieren und zu identifizieren Plasmide positive Klone durch Verdauung (für Einsätze mit der gewünschten Größe zu screenen) und anschließende Sequenzierung Plasmid. </li></ol> 3. Erzeugung von kurzen Cas RNA-Substrate über benutzerdefinierte RNA-Oligonukleotid-Synthese Design kurzen Cas RNA-Substrate (zB Single Repeat-Sequenzen, Fig. 2C) und nutzen eigene RNA-Oligonukleotid-Synthese Einrichtungen. Anmerkung: Die Aufnahme eines Desoxyribonucleotids an einer festgelegten Position eines RNA-Oligonukleotid (2C) verwendet werden, um den Ort der RNA-Spaltung auszumachen ist. 4. In vitro T7 RNA-Polymerase-Transkription <ol><li> Isolieren Plasmide mit Ihrem konzipiert Konstrukt (ab 1.9. Oder 2.7.) Mit einem Maxipräp Plasmid Purification Kit. </li><li> Linearisierung des Plasmids mit dem Restriktionsenzym, das stromabwärts des klonierten Fragments (z. B. HindIII) spaltet. Eine vollständige Verdauung. Anmerkung: Wenn ein divergenter definierten 3&#39;-Terminus des RNA-Transkript wird gewünscht, die ausgelegt Konstrukt sollte eine zusätzliche spezifische Restriktionsstelle für &quot;Run-off&quot; Transkription stromaufwärts der HindIII-Sequenz enthalten. </li><li> Reinigen das linearisierte Plasmid durch Phenol: Chloroform (1:1) und Ethanolfällung. Wiederherstellen der Nukleinsäuren durch Resuspendieren des Pellets in DEPC behandeltem steriles Wasser. </li><li> Richten Sie ein in vitro T7 RNAP ablaufen Transkription Mischung, die 40 mM Hepes / KOH (pH 8), 22 mM MgCl 2, 5 mM Dithiothreitol, 1 mM Spermidin, 4 mM jedes Nukleosid-Triphosphat (ATP, CTP, GTP, UTP enthält ), 40-100 pg / ml verdautPlasmid und 0,1 mg / ml T7 RNAP in DEPC behandeltem Wasser. Einer Inkubationszeit von 3 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Analysieren der erhaltenen RNA-Transkripte auf einem denaturierenden 8 M Harnstoff 12% Polyacrylamid-Gel (Abb. 3A). Die RNA-Transkripte können über Mono Q Anionenaustauschchromatographie 13 gereinigt und durch Ethanolfällung gewonnen der RNA-Fraktionen und Resuspension des Pellets in DEPC behandeltem steriles Wasser. Für die zukünftige Verwendung speichern die RNA bei -80 ° C. </li></ol> 5. Cas6 Endonuklease Assay <ol><li> Einrichten eines 20 ul in vitro T7 RNAP ablaufen Transkription Mischung (siehe 4.4), die einen reduzierten Betrag von 2 mM ATP enthält, und wird ergänzt 2,5 ul α-[32 P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Läutern Reaktionsprodukte über Gel Extraktion aus einem denaturierenden 8 M Harnstoff 12% Polyacrylamidgel. Visualisieren Banden durch Autoradiographie. </li><li> Herstellen und reinigen Sie die gewünschten rekombinanten Cas Proteine. In diesem Beispiel Cas6 aus Clostridium thermocellum wurde über Hitzefällung und Ni-NTA-Chromatographie gereinigt. </li><li> Einrichten einer Endonuklease Assayreaktion (zB für Clostridium thermocellum Cas6 enthält das Reaktionsgemisch 20 mM Hepes (KOH pH 8), 250 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 12.000 cpm RNA Substrat und Enzym und 1 pM wurde bei inkubiert 37 ° C für 30 min). </li><li> Beladung 5 ul der Reaktionsmischung (10 ul + RNA Ladepuffer, der 95% Formamid) auf einer 8 M Harnstoff 12% Polyacrylamidgel. Visualisieren Sie die Spaltprodukte nach der Elektrophorese durch Autoradiographie. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für RNA-Substrate für die Analyse von Cas Endonucleaseaktivität ist in 3A gezeigt. Ein Aliquot von 5 ul einer analytischen 100 ul in vitro Transkription geladen wurden. Bitte beachten Sie, dass die Effizienz der RNA-Produktion zwischen verschiedenen Konstrukten variiert. Einige Faktoren, tHut wurde beobachtet, dass die Menge der erhaltenen RNA sind (i) der anfänglichen Folge im Anschluss an die ein G für Transkriptionsinitiation erforderlich, (ii) die Möglichkeit der RNA Strukturbildung während der Transkription und (iii) die Auswahl der Restriktionsstelle für die Erzeugung beeinflussen der Run-off Spaltstelle. Die Untersuchung von RNA Endonucleaseaktivität erfordert sowohl hochgereinigten rekombinanten Proteinen Cas (3B) und die ordnungsgemäße Negativkontrollen. Idealerweise unterscheidet sich diese negative Kontrollprobe so wenig wie möglich von der untersuchten Cas Endonuklease Reaktion. Dies kann durch Inkubation der RNA mit Reaktionspuffer und Zell-Lysat ohne Cas Ausdruck (und nach dem identischen Reinigungsprozedur) erreicht werden. Eine ideale Negativkontrolle ist der Zusatz eines Desoxyribonucleotid in der vorgeschlagenen Spaltstelle. In 3C wird die Spaltung eines 5&#39;-terminalen Repeat-Sequenz markiert für Clostridium thermocellum Cas6 gezeigt. Unter<html> identischen Bedingungen, ist diese Wiederholung kein Substrat mehr, wenn ein Desoxyribonukleotid an Position -9 eingeführt. Diese Methode liefert auch Informationen über die Spaltstelle. Schließlich wird eine lange intern markiert pre-crRNA durch Cas6 gespalten und zwei Spaltungsfragmente beobachtet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Übersicht CRISPR / Cas Aktivität. Die Übersicht folgt das Einführen eines viralen DNA-Sequenz (protospacer) in die CRISPR-Cluster (Adaption) die Transkription und die Verarbeitung des CRISPR-Array in kleine crRNAs durch eine Cas6 Endonuklease, die Verbreitung von crRNAs in die Kaskade komplexer und die Interferenz ein wiederholten viralen Angriff auf die Komplementarität zwischen crRNA und protospacer basiert. Protospacer angrenzenden Motive (PAM) mark viralen protospacer Sequenzen. BBILDUNG 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Erzeugung von RNA-Substrate für Cas Proteine. Das Schema zeigt den Workflow zur Erzeugung von (A) lange Vor-crRNA Substraten, (B) Zwischen pre-crRNA Substrate und (C) kurz Cas RNA-Substrate für Pre-crRNA Produktion. Beispiel Sequenzen für die CRISPR Reihe von Clostridium thermocellum vorgestellt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> Abbildung 3. Cas6 Endonuklease Assay. A.) Toluidinblau gefärbten Polyacrylamidgel einer maßgeschneiderten RNA-Oligonukleotid (250 pmol) und zwei in vitro RNA-Transkripte (5 ul einer typischen 100 ul-Reaktion). B.) SDS-PAGE-Gel von einem Cas6 Zubereitung (80 pmol) aus Clostridium thermocellum nach ThermischerFällung bei 50 ° C für 1 Stunde und Ni-NTA-Chromatographie. C) Detektion von endonukleolytische Cas6 Aktivität für 5 &#39;Anschluss mit der Bezeichnung Repeatsequenzen und Pre-crRNA in vitro Transkripte. Die Einführung eines dNTP an Position -9 abschafft Cas6 Spaltung für eine kurze Cas RNA-Substrat (S, Abb. 2C). A 5 &#39;Klemme 8 nt tag ist auch für crRNA Reifung von langen pre-crRNA Substrate (L, Fig. 2A) erzeugt. Die Bänder wurden auf einem denaturierenden 8 M Harnstoff 12% Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und durch Autoradiographie visualisiert.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die vorgestellten Verfahren ermöglichen die Erzeugung von Cas Endonuklease Substraten unterschiedlicher Größenbereiche und mit unterschiedlicher Sequenz in Freiheit Design. Die geradlinigen Ansatz zur Erzeugung von synthetischen RNA-Oligonukleotid Substrate auf kurze RNA Designs aufgrund steigenden Kosten und technischer Beschränkungen bei der Schaffung längere RNA-Oligomeren begrenzt. Während erfolgreiche RNA-Synthese wurde für unmodifizierte RNA-Oligomere von über 100 Nukleotiden Länge berichtet, liegt die praktische und wirtschaftliche Maximum für benutzerdefinierte RNA-Synthese unter 40 Nukleotiden. Jedoch kann jede gegebene Sequenz synthetisiert und die gezielte Einführung von modifizierten Nukleotiden (zB Desoxyribonukleotiden) kann verwendet werden, um Spaltstellen im Detail analysiert werden. Mehr pre-cRNAs sollte über in vitro Transkription erzeugt werden. Das Glühen von Oligonucleotiden, die ein T7-RNA-Polymerase-Promotor enthalten können zur Herstellung von Pre-Zwischenlänge CRRNAs. Die maximale Länge der routinemäßig und wirtschaftlich synthetisierte DNA-Oligonukleotiden ist nur oberhalb von 150 Nukleotiden und stellt die maximale synthetischer pre-crRNAs mit dieser Methode. Die Anordnung von mehreren DNA geglühten Oligonukleotidpaare, die klebrigen Enden miteinander bilden erstrecken kann diese maximale Länge erfordert aber immer größeren Schwierigkeiten, die Klonierung des Konstrukts. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens ist die Möglichkeit vor, eine crRNA Konstrukte (und daher Cas Endonuklease Substrate) mit einer beliebigen gewünschten Sequenz zu erzeugen. Dies ermöglicht das Testen von synthetischen crRNA Designs. Schließlich können größere Vor-crRNAs aus PCR-Amplifikate der gesamten genomischen CRISPR Elemente oder Fraktionen davon erhalten werden. Änderungen an den in vitro Transkriptions-Vorlage Plasmid kann über ortsspezifische Mutagenese zur Erzeugung von Vor-crRNA Varianten eingeführt werden. Diese Konstrukte können verwendet werden, um die globale endonukleolytische Spaltung Muster innerhalb eines gesamten analysierenPre-crRNA. Die Pionierarbeit für die Herstellung von unmodifizierten RNA mittels T7-RNA-Polymerase in vitro-Transkription wurde am Transfer-RNAs 14 und Trespenmosaik-Virus-RNA 15 basiert. Die Konsensus-T7-RNA-Polymerase-Promotor aus einem Erkennungs-Domäne (-17 bis -5) und einer Initiationsstelle Domäne (-4 bis 6) mit Transkriptionsinitiationsregion in einer entscheidenden Guanosin +1 16. Positionen stromabwärts 1 kann variiert werden, die die Transkription von fast jeder gewünschten RNA-Sequenz ist. Die vorgestellten Verfahren zur Erzeugung von in-vitro-run-off-Transkription Vorlagen ermöglichen zur in vitro Synthese von vollständigen Vor-crRNAs die genomische Regionen CRISPR oder synthetische Varianten vor crRNA übereinstimmen. Die Transkripte sind mit einem 5&#39;-Triphosphat-terminalen vorliegenden erzeugt, wenn der Transkriptionsreaktion mit GMP grundiert wird auf 5 &#39;Termini Monophosphat 14 zu erhalten. Solche Termini sind erforderlich, wenn die Transkripte beschriftet werdenmit T4 Polynukleotidkinase und γ-[32 P]-ATP. Spaltungsaktivität Cas6 und Cas6-ähnliche Enzyme erzeugt crRNA, die 5&#39;-Hydroxy-und a 2 &#39;, 3&#39;-cyclisches Phosphat-Enden enthalten. Diese RNAs können dann für die Anerkennung durch die Cascade komplexen analysiert werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Antarctic Phosphatase </td><td> NEB </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> in vitro Transcription Grade Ultrapure Nukleotidtriphosphate </td><td> Jena Bioscience </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> Flüssigchromatographie, ktapurifier 100 </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DNA-Oligonukleotide </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RNA-Oligonukleotiden </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Purification Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Spin Miniprep Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> Plasmid Maxi Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> NEB </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> NEB </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> T4-DNA-Ligase </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> T4 Polynukleotidkinase </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7-RNA-Polymerase </td><td> eigene Vorbereitung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Desoxynukleotid Lösung Mix </td><td> NEB </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> Mini-PROTEAN Tetra Elektrophorese-System </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> Sturm 840 Scanner </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> Lagerung Phosphorscreen </td><td> Molecular Dynamics </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> Mono Q 5/50 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion High-Fidelity DNA Polymerase </td><td> NEB </td><td> M0530L </td><td> verwenden Sie den GC-Puffer </td></tr><tr><td> Toluidinblau </td><td> Sigma </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> NEB </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32 P]-ATP, α-[32 P]-ATP </td><td> Hartmann Analytic </td><td> SRP-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems

Das Zusammenspiel von Viren und deren prokaryotischen Wirten prägte die Entwicklung der Bakterien und Archaeen Leben. Prokaryoten entwickelt verschiedene Strategien, um Viren-Attacken, die Restriktions-Modifikations-, abortive Infektion und CRISPR / Cas-Systeme gehören zu entziehen. Diese adaptive Immunsystem in vielen Bakterien und am meisten Archaea gefunden bestehen aus c glänzendes r i egularly nterspaced s p hort alindromic r iederholen (CRISPR) Sequenzen und eine Anzahl von C RISPR als sociated (Cas) Gene (Abb. 1) 1-3. Verschiedene Sätze von Cas Proteine ​​und Wiederholungen definieren mindestens drei große divergierenden Arten von CRISPR / Cas-Systeme 4. Die universellen Proteine ​​und CAS1 CAS2 werden vorgeschlagen, um bei der Aufnahme der viralen DNA eingebunden werden, dasseine neue Abstandselement zwischen zwei Wiederholungen am 5&#39;-Terminus eines erstreckenden CRISPR Cluster 5 erzeugen. Der gesamte Cluster wird in einem Vorläufer-crRNA die alle Abstandhalter und Repeat-Sequenzen transkribiert wird und anschließend durch ein Enzym der Familie vielfältigen Cas6 in kleinere crRNAs 6-8 verarbeitet. Diese bestehen aus der crRNAs Spacersequenz durch eine 5&#39;-Terminal (8 Nucleotide) und einem 3&#39;-terminalen-Tag aus der Repeatsequenz 9 abgeleitet flankiert. Eine wiederholte Infektion des Virus kann nun blockiert, da der neue crRNA wird von einem Proteinkomplex Cas (Cascade) an die virale DNA gerichtet werden und als solche zu kennzeichnen über Basenkomplementarität 10 unterzogen. Schließlich, für CRISPR / Cas-Typ-1-Systeme, wird die Nuklease CAS3 zerstören erkannt invader DNA 11,12. Diese Prozesse zu definieren CRISPR / Cas als adaptive Immunsystem Prokaryoten und eröffnet einen faszinierenden Forschungsgebiet für das Studium der beteiligten Cas Proteine.Die Funktion vieler Cas Proteine ​​ist noch schwer zu fassen und die Ursachen für die scheinbare Vielfalt der CRISPR / Cas Systeme bleiben beleuchtet werden. Mögliche Aktivitäten der meisten Cas Proteine ​​wurden durch detaillierte rechnerische Analysen vorhergesagt. Ein großer Teil der Cas Proteine ​​werden entweder angezeigt oder vorgeschlagen zu funktionieren, wie Restriktionsendonukleasen 4. Hier präsentieren wir Methoden, um crRNAs und Vorläufer-cRNAs für das Studium der Cas Endoribonukleasen generieren. Endonuklease verschiedenen Assays erfordern entweder kurzen Wiederholungssequenzen, die direkt als RNA-Oligonukleotide oder länger crRNA und pre-crRNA Sequenzen, die über in vitro RNA-Polymerase T7 run-off-Transkription erzeugt werden, synthetisiert werden können. Diese Methodik erlaubt den Einbau von radioaktiven Nukleotiden zur Erzeugung von intern markiert Endonuklease Substrate und die Schaffung synthetischer oder Mutante crRNAs. Cas6 Endonucleaseaktivität wird verwendet, um pre-crRNAs in crRNAs mit 5&#39;-hydr reifenOxyl und a 2 &#39;, 3&#39;-cyclisches Phosphat-Termini.

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Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

CRISPR / Cas-Systeme vermitteln adaptive Immunität in Bakterien und Archaea. Viele Cas Proteine ​​vorgeschlagen, als Endoribonukleasen die auf crRNA Vorläufer von unterschiedlicher Länge handeln. Hier erläutern wir drei verschiedene Ansätze vor, crRNA Substrate für die biochemische Analyse von Cas Endonucleaseaktivität generieren.

Substrat Generation für Endonukleasen der CRISPR / Cas-Systeme

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

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Research

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Biology

27.2K Aufrufe.  Max-Planck-Institute for Terrestrial Microbiology. CRISPR / Cas-Systeme vermitteln adaptive Immunität in Bakterien und Archaea. Viele Cas Proteine ​​vorgeschlagen, als Endoribonukleasen die auf crRNA Vorläufer von unterschiedlicher Länge handeln. Hier erläutern wir drei verschiedene Ansätze vor, crRNA Substrate für die biochemische Analyse von Cas Endonucleaseaktivität generieren.

Serie: Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

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Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of cells (approximately 25 in C. borealis) which are well characterized. The cells in the STG exhibit a broad range of outputs and are responsible for the motor actions of the stomach. The stomach contains the gastric mill which breaks down food with three internal teeth, and the pylorus which filters the food before it reaches the midgut. The STG produces two rhythmic outputs to control the gastric mill and pylorus known as central pattern generators (CPGs). Each cell in the STG can participate in one or both of these rhythms. These CPGs allow for the study of neuromodulation, homeostasis, cellular and network variability, network development, and network recovery.
The dissection of the stomatogastric nervous system (STNS) from the Jonah crab (Cancer borealis) is done in two parts; the gross and fine dissection. In the gross dissection the entire stomach is dissected from the crab. During the fine dissection the STNS is extracted from the stomach using a dissection microscope and micro-dissection tools (see figure 1). The STNS includes the STG, the oesophageal ganglion (OG), and the commissural ganglia (CoG) as well as the nerves that innervate the stomach muscles. Here, we show how to perform a complete dissection of the STNS in preparation for an electrophysiology experiment where the cells in the STG would be recorded from intracellularly and the peripheral nerves would be used for extracellular recordings. The proper technique for finding the desired nerves is shown as well as our technique of desheathing the ganglion to reveal the somata and neuropil.

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric nervous system (STNS) of the Jonah crab (C. borealis) can be used for electrophysiology, immunohistochemistry, and cell culture studies. The STNS extraction is done in two parts: the gross and fine dissection.

Cancer Borealis stomatogastrischen Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Gross Dissection der Magen der Lobster, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

Biophysikalische Assays auf die mechanischen Eigenschaften der Interphase Zellkern Probe: Substrat Dehnungs-Anwendung und Mikronadel Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...