Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und reproduzierbare Methode zur Reinigung und Kultivierung bestimmter Arten von Primärneuronen. Diese Kulturen eignen sich für elektrophysiologische, morphologische und Überlebensanalysen. Kulturen von gereinigten Neuronen können verwendet werden, um Grundlagen der neuronalen Physiologie, Bildung von Synapsen sowie wie neuronale Netzwerke entwickeln zu studieren.
Während wir uns auf kortikale glutamaterge Hauptzellen und GABAerge Interneurons konzentrieren, kann dieses Verfahren leicht modifiziert werden, um alle neuronalen Linien zu untersuchen, die fluoreszierende Proteine exzieren. Um Glasabdeckungen zuzubereiten, tauen Sie zunächst eine fünf Milliliter Aliquot von 200 Mikrogramm pro Milliliter PLL-Lösung auf. Verdünnen Sie diese Stammlösung auf 20 Mikrogramm pro Milliliter, indem Sie 45 Milliliter reines Injektionswasser hinzufügen.
Dann sterilisieren Sie die Lösung in ein neues 50 Milliliter konisches Rohr und kennzeichnen Sie dieses Rohr als PLL steril. Als nächstes legen Sie 100 sterile runde 12 Millimeter Glasabdeckungen in die sterile PLL-Lösung. Das Rohr alle fünf bis zehn Minuten für zwei bis drei Minuten aufstellen, um eine gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten.
Nach 40 Minuten PLL-Beschichtung zwei Stück Tissuepapier nehmen und flach in den Fließschrank legen. Sterilisieren Sie das Papier mit 70% Ethanol dann abflachen, um Falten zu entfernen und trocknen lassen. Nach dem Beschichten der Glasabdeckungen für eine Stunde mit PLL, entfernen Sie überschüssige PLL-Lösung und fügen Sie steriles Injektionswasser hinzu.
Rühren Sie die Abdeckungen zwei bis drei Sekunden lang sanft, um überschüssige PLL zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Spülschritt noch zwei Mal. Entfernen Sie überschüssiges Wasser und übertragen Sie dann die Abdeckungen auf das sterile Gewebepapier.
Nach dem Trocknen die Deckel auf eine 24 Brunnenkulturplatte übertragen. Um die Zellkulturlösungen vorzubereiten, messen Sie 12 Milliliter Zellkulturpuffer zu einem 15 Milliliter konischen Rohr und etikettieren Als BSA. Messen Sie fünf Milliliter Zellkulturpuffer zu einer anderen 15 Milliliter-Röhre und beschriften Sie sie als Papain.
Anschließend beide Röhren für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie 120 Milligramm BSA in das Mitbeschriftete BSA-Rohr ein. Dann invertieren Sie das Rohr, um die Lösung aufzulösen.
Dann fügen Sie sieben Milligramm Papain in die Röhre mit der Bezeichnung Papain. Bringen Sie beide Schläuche für 15 Minuten ins Wasserbad zurück. Filter sterilisieren die BSA-Lösung in ein frisches konisches Rohr.
Teilen Sie die sterile BSA-Lösung in drei Rohre und beschriften Sie jedes Rohr als BSA steril und entweder ein, zwei oder drei. Jetzt filtern Sie das Papainrohr und kennzeichnen Sie das Rohr als papain steril. Bringen Sie alle Schläuche zurück ins Wasserbad und bebrüten Sie bis zum Gebrauch bei 37 Grad Celsius weiter.
Um sich auf die Gewebesektion vorzubereiten, legen Sie das Skalpell, die Schere, die Zange und den Spachtel aus, die für die Zerlegung des Hippocampus und des Kortex erforderlich sind. Legen Sie zwei 35 Millimeter Petrischalen und eine 100-Millimeter-Petrischale mit sterilem Filterpapier in den Fließschrank. Sammeln Sie transgene NexCre; Ai9 oder vesicular GABA Transporter Venus Maus Welpen, die mit einer Leuchtstofflampe mit geeigneten Anregung sezieren und Emissionsfilter zu unterscheiden Fluoreszenz Welpen von wilden Typ Liter Kumpels zu unterscheiden.
Unmittelbar vor der Zersebung der Tiere füllen Sie jede Petrischale mit gekühlten sterilen Zellkulturpuffer. Nach der Zerlegung das Gehirn des transgenen Welpen vorsichtig auf ein steriles Filterpapier übertragen. Zuerst sezieren Sie das Kleinhirn und trennen Sie die beiden Hemisphären.
Dann trennen Sie sorgfältig den Hippocampus und Denkorte von jeder Hemisphäre. Übertragen Sie das sezierte Gewebe in eine 35-Millimeter-Petrischale mit gekühltem Zellkulturpuffer. Dann den sezierten Hippocampus und Kortex auf den Deckel einer weiteren 35-Millimeter-Petrischale übertragen.
Mit der flachen Kante einer Skalpellklinge das Gewebe vorsichtig in einer Kreuzbewegung hacken, bis nur noch kleine Stücke übrig bleiben. Als nächstes das gehackte Gewebe mit einer kleinen Menge Papainlösung vom Petrischalendeckel in das sterile Papainrohr übertragen. Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius für 25 Minuten.
Nach der Papain-Inkubation das sterile Papainrohr und die sterilen BSA-Rohre in den Fließschrank geben. Verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Pasteur-Pipette, um nur das Kortikohippocampalgewebe aus dem Papainrohr in die BSA-Röhre zu übertragen. Um große Gewebeklumpen aufzubrechen, trituieren Sie das Gewebe mehrmals mit einer Ein-Milliliter-Pasteur-Pipette.
Anschließend trituieren Sie das Gewebe sieben Mal mit einer feinen Spitze Pasteur Pipette. Nach 30 Sekunden einen Milliliter der unteren Lösung und des Gewebes von BSA-Rohr eins in BSA-Röhre zwei übertragen. Trituieren Sie das Gewebe in BSA-Rohr zweimal mehrmals mit einer feinen Spitze Pasteur Pipette.
Nach der Triturierung einen Milliliter des unteren Gewebes und der Lösung von BSA-Röhre eins in BSA-Röhre drei übertragen. Trituieren Sie das Gewebe in BSA-Rohr dreimal mehrmals. Nach der Triturierung alle Lösung und Gewebe aus den Röhrchen zwei und drei in BSA-Röhre eins übertragen.
Trituieren Sie zwei bis drei mal und Zentrifugen bei 3.000 mal g für drei Minuten. Nach der Zentrifugation, entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus dem Pelletgewebe und suspendieren Sie die Zellen mit einer P1000 Pipette in zwei Milliliter n°Feines Vollwintern Ein niedriges Fluoreszenzmedium. Dann trituieren Sie das Gewebe 20 Mal, um eine vollständige Resuspension der Gewebelösung zu gewährleisten.
Anschließend filer die Zellsuspension durch ein 30 Mikrometer Zellsieb in ein Polystyrol-Probenröhrchen. Bereiten Sie Zellsortierungssammelrohre vor, indem Sie 300 Mikroliter vollständigen Ruhezustands-A-Medium auf die erforderliche Anzahl von Polypropylen-Rohren pipetieren. Wählen Sie für jeden zu sortierenden Fluoreszenzzellentyp die entsprechenden Anregungs- und Emissionsfilter aus.
Erregen Sie Venusprotein mit einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern und detektieren Sie das emittierte Licht durch 530/40 Emissionsfiltersatz. TdTomato-Protein mit 531 Nanometer Anregungswellenlänge excite und detektieren Sie das emittierte Licht durch 575/30 Emissionsfiltersatz. Für hohe Reinheit, sortieren hell markierte fluoreszierende Zellen.
Übertragen Sie die gesammelten Zellen nach der Zellsortierung in zwei Milliliter runde Bodenzentrifugenrohre. Zentrifugieren Sie dann die Zellen drei Minuten lang mit 3.000 mal g, um ein Zellpellet zu bilden. Setzen Sie das Zellpellet in der erforderlichen Menge an vorgewärmten vollständigen NBA-Medium, um eine Zelldichte von 1.000 Zellen pro Mikroliter zu erreichen.
Um das Vorhandensein von dissoziierten Zellen zu bestätigen, überprüfen Sie die Zelllösung unter dem Mikroskop mit einer 4X oder einer 10X Objektivlinse. Vor dem Beschichten der Zellen Wirbel mit mittlerer Geschwindigkeit für zwei bis drei Sekunden, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten. Nach Wirbeln, schnell Pipette 10 Mikroliter der Zellsuspension in die Mitte jedes Abdeckungsrutsches.
Nach einer Stunde die Zellen mit 500 Mikrolitern vorgewärmten kompletten NBA-Medium senendieren und bei 37 Grad Celsius in den Inkubator zurückkehren. Um die gereinigten Neuronen und Gliazellen mitzukulturen, werden Glialzellen auf die erforderliche Anzahl von Zellkultureinsätzen überführt. Dies geschieht durch Plattieren von 40.000 Gliazellen in einem 500-Mikroliter-Tröpfchen des gesamten NBA-Mediums.
Nach einer Stunde, übertragen Glialzellkultur Einsätze auf gereinigte Neuronen. Entfernen Sie überschüssige Medien aus den Kultureinsätzen und geben Sie die Platten zur Kultivierung an den Inkubator zurück. Nach erfolgreicher Sortierung sollten plattierte Neuronen mit einer glatten Membran rund in Form erscheinen und nach etwa einer Stunde in vitro neuroide verschonen.
Nach sieben Tagen in vitro, obwohl einige Zelltod offensichtlich sein kann, sollten lebensfähige Zellen in allen Kulturbedingungen vorhanden sein. Die Analyse von gereinigten Kulturen zeigt, dass sowohl glutamaterge als auch GABAerge Neuronen in der Lage waren, Axone und Dendriten aus ihren Zellkörpern zu erweitern und die Fähigkeit zu behalten, Aktionspotenziale als Reaktion auf superschwellende depolarisierende Strominjektionen zu erzeugen. Insbesondere nach der Reinigung, nur GABAergen Neuronen erhielten erhebliche Menge an spontanen synaptischen Übertragung und glutamaterge Neuronen erhieltsehr wenig synaptische Übertragung in Abwesenheit von Gliazellen.
Wichtig ist, dass die Kultivierung gereinigter Neuronen mit Gliazellen das Wachstum und Überleben des Neuronen verbessert und die synaptische Übertragung in glutamatergen Kulturen fördert. Eine ausreichende polarisierende Beschichtung der Abdeckungen und die Aufrechterhaltung des physiologischen pH-Werts der Kulturmedien während des gesamten Verfahrens sind der Schlüssel zur Sicherstellung einer guten Zellkulturen. Nach diesem Protokoll sollte es möglich sein, RNA-Sequenzierung und Proteinmassenspektroskopie an gereinigten Kulturen durchzuführen, so dass translationale und transkriptionelle Prozesse in bestimmten neuronalen Typen untersucht werden können.
