Autoren möchten Nancy Downer und alle Mitglieder aus dem Labor für Analytische Chemie an der Universität Rom &quot;Tor Vergata&quot; Danke für ihre Mitarbeit und logistische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das EU-Projekt &quot;Biocop&quot; unterstützt.

1) Blocking beschichteten magnetischen Kügelchen: Gehen Sie wie folgt zu beschichteten magnetischen Kügelchen Block: <ol><li> Einen Satz von 2 ml Eppendorf-Röhrchen; </li><li> Homogenisieren (Schütteln, aber nicht Vortexen) beschichteten magnetischen Kügelchen (siehe Anhang für die Herstellung von beschichteten magnetischen Kügelchen) mit der Probe rotierenden Mischer; </li><li> Unmittelbar nach der Homogenisierung, Pipette 10 ul der beschichteten magnetischen Kügelchen in jedem einzelnen Eppendorf-Röhrchen; </li><li> Add 1 ml Magermilch blockiert Lösung in jedes Eppendorf-Röhrchen des Satzes; </li><li> Lassen magnetischen Beads für 30 min bei Raumtemperatur auf der rotierenden Probe Mischer inkubieren; </li><li> Entfernen Blockierungslösung: dazu wird das Reagenzglas in magnetischen Partikel-Konzentrator mit den magnetischen Teil legte für 2 min (siehe magnetische Kügelchen kleben an der Seitenwand des Rohres); sorgfältig Pipette aus dem Überstand, so dass Perlen ungestört; </li><li> 1 ml PBS-Puffer + NaN 3 + BSA als Storage-Lösung für jede Röhre; </li><li> Shop beschichtet und blockiert magnetischen Beads bei 4 ° C (bitte beachten Sie, dass beschichteten magnetischen Kügelchen stabil sind für mindestens 2 Monate bei 4 ° C); </li></ol> 2) Immunologische Kette auf magnetische Kügelchen für den Bau der Kalibrierkurve und Analyse von Proben Gehen Sie wie folgt an magnetische Kügelchen bereit für die Messung haben: <ol><li> Nehmen Sie eine Eppendorf-Röhrchen (2 ml) von beschichteten und blockierten Lösung für jede Probe zu extrahieren willst du zu analysieren sind; </li><li> Ein Extra-Eppendorf-Röhrchen für jeden Arbeitstag Kalibrierlösung; </li><li> Homogenisieren magnetischen Beads für 2 min auf der rotierenden Probe Mischer vor dem Einsatz; </li><li> Entfernen Lagerflüssigkeit mittels magnetischer Partikel Konzentrator; </li><li> Wash magnetischen Beads dreimal mit PBS / BSA Waschlösung. Entfernen Waschflüssigkeit; </li><li> Wettbewerb Schritt: Fügen Sie für jedes Röhrchen mit den gewaschenen magnetische Kügelchen, 200 ul der Probe zu extrahieren vorbereitet, verwenden Sie eine Magnetic-Bead-Röhrchen für jede Probe. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Standard-Lösung. Geben Sie 200 ul des monoklonalen Antikörpers Lösung für jedes Magnetic-Bead-Rohr. Lassen magnetischen Beads für eine halbe Stunde auf der rotierenden Probe Mischer bei Raumtemperatur inkubieren; </li><li> Remove from Eppendorf-Röhrchen die Lösung für die Wettbewerbs-Schritt verwendet; </li><li> Labeling Schritt: Fügen Sie 400μl der markierten sekundären Antikörper gegen jedes Magnetic-Bead-Eppendorf-Röhrchen. Lassen magnetischen Beads für eine halbe Stunde auf der rotierenden Probe Mischer bei Raumtemperatur inkubieren; </li><li> Entfernen Sie die Kennzeichnung Lösung von Eppendorf-Röhrchen; </li><li> Wash magnetischen Beads dreimal mit PBS / Tween ® 20 Waschlösung. Entfernen Sie die Flüssigkeit; </li><li> Resuspendieren mit 100 &amp;mgr; l der DEA-Puffer jedem Aliquot von magnetischen Kügelchen. Nun ist die magnetische Kügelchen sind bereit zur elektrochemischen Messung Schritt; </li></ol> 3) Montage von PalmSens mit Multiplexer (Mux) Optionen Bitte beachten Sie: enzymatische Produkt Substrathydrolyse Fouls der Elektrodenoberfläche, aus diesem Grund eine neue Elektrode ist für jede Messung benötigt. <ol><li> Schließen Sie einen PC Laptop PalmSens über das serielle Kabel; </li><li> Verbinden Sie den 9-DIN-Stecker des CH8 Multiplexer mit PalmSens. </li><li> Schließen Sie serielle Kabel der Acht-Kanal Mux elektrischen Kontakt mit CH8 Multiplexer; </li><li> Die Elektrodenspitze Streifen auf den acht Magneten blockieren. Achten Sie auf jeden Magneten unter jedem Arbeitstag Elektroden Ort (beachten Sie, dass die Notwendigkeit eines einzigen Magneten für jede Elektrode Imperativ sonst die magnetischen Partikel werden nicht auf der Arbeitselektrode Bereich konzentriert werden); </li><li> Stecken Sie in Elektroden Streifen in Acht-Kanal-Mux elektrischen Kontakt; </li></ol> Für DPV-Messung die folgenden Parameter in die entsprechenden Felder: E beginnen: 0 (V); E Ende: 0,6 (V); E Schritt: 0,016 (V); E-Impuls: 0,0339 (V); E Konditionierung: 0 (V); E Deposition: 0 (V); Scan-Rate : 0,1 (V / s); T Puls: 0,06 (s); T Konditionierung: 0 (s); T Deposition: 0 (s); T Equilibrierung: 8 (s). 4) Die enzymatische Reaktion und elektrochemischen Messung <ol><li> Homogenisieren durch leichtes Schütteln jedes Eppendorf-Röhrchen mit magnetischen Beads bereit zur elektrochemischen Messung Schritt, um eine gut dispergierte Suspension von magnetischen Kügelchen zu erhalten; </li><li> Pipette aus jedem Eppendorf, unmittelbar nach der Homogenisierung, ein Aliquot von 20 ul des Magnetic-Bead-Dispersion auf der entsprechenden Arbeitsgruppe Elektrodenoberfläche. Für jede Elektrode einen Streifen verwenden 20 ul magnetische Perlen aus verschiedenen Eppendorf-Röhrchen (zB für acht Elektrode verwendet acht verschiedene Eppendorf) übernommen; </li><li> Add 80 ul der enzymatischen Substrat-Lösung auf der ersten Elektrode. Start 2 min count down. Nach 14 sec, fügen Sie 80 ul der enzymatischen Substrat-Lösung auf der zweiten Elektrode. Nach weiteren 14 sec, fügen Sie 80 ul der enzymatischen Substrat-Lösung auf der dritten Elektrode. Gehen Sie zur gleichen Zeit intErval (14 Sekunden), bis der letzte Elektrode (das heißt: drop jedem Aliquot des Substrates mit Intervallen von 14 sec). Das Intervall von 14 Sekunden wird die Zeit durch den Potentiostaten um die Messung durchzuführen benötigt berechnet; der Anmerkung, die 80 ul Lösung auf jeden Sensor sollte die Arbeits-, Referenz-und Gegenelektrode zu decken. Darüber hinaus sollten die Lösungen für jeden Sensor nicht in Berührung kommen, mit Lösungen von benachbarten Elektroden. </li><li> Nach dem 2 min Countdown von der ersten Zugabe von enzymatischen Substrat-Lösung, starten Sie den elektrochemischen Messung; </li><li> Verwenden Sie die PalmSens Lite Software Stromspitzen (uA) für jede Lösung zu erhalten. </li></ol> 5) Berechnung Stellen Sie eine Eichkurve mit einer logistischen 4 Parameter-Gleichung und berechnen Sie die Konzentration der gesamten HT-2/T-2 Toxin Menge in Nanogramm pro Milliliter für jedes Eppendorf-Röhrchen mit unbekannten Probe. Die experimentellen Daten, Peakhöhe (uA) gegen die Konzentration der Kalibrierstandards (ng / ml), müssen ausgestattet mit einem nicht-linearen Vier-Parameter logistische (4-PL) Gleichung Grundstück (1) (mit Sigma Plot 8.0 oder sein Kaleidagraph). Die nichtlineare 4-PL-Modell ist in der Regel angenommen, um Ligandenbindungsassays (LBAs) 6 beschreiben. <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq1.jpg" alt="Gleichung 1" /> (1) a, b, x0, y0 sind logistische Parameter wie die Sigma Plot Kurvenanpassung Programms. Verwenden Sie die Formel expliziert, um den Inhalt HT-2/T-2 Toxin Gesamtbetrag in der verdünnten Probe Extraktlösung berechnen <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq2.jpg" alt="Gleichung 2" /> (2) x ist die Massenkonzentration der Gesamtbetrag der HT-2/T-2 Toxine in die verdünnte Extrakt-Lösung, aus der Logistik-4 Parameter Gleichung in Nanogramm pro milliltre (ng / ml) berechnet y wird der aktuelle Wert in uA für die unbekannte Probe erhalten Appendix 6) beschichteten magnetischen Kügelchen Gehen Sie wie folgt zu beschichteten magnetischen Kügelchen haben: Waschverfahren <ol><li> Homogenisieren tosylactivated Dynabeads ® M-280 (Stammlösung 2 x 109 Beads / ml) durch Schütteln und Vortexen (max. Geschwindigkeit) für 1 min (Schaumbildung vermeiden) (bitte beachten Sie die Konzentration von magnetischen Kügelchen muss dabei immer die gleichen, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten in der Messung); </li><li> Unmittelbar Pipette 1 ml der oben homogenisiert Perlen in ein 2 ml Eppendorf-Röhrchen; </li><li> Das Röhrchen wird in magnetische Partikel-Konzentrator mit den magnetischen Teil legte für 2 min (siehe magnetische Kügelchen kleben an der Seitenwand der Röhre); </li><li> Sorgfältig Pipette aus dem Überstand, so dass Perlen ungestört; </li><li> Entfernen Sie die Eppendorf-Röhrchen aus der magnetischen Partikel-Konzentrator und Resuspendieren der Beads in 1 ml 0,1 M Boratpuffer pH 9,5. Vorsichtig mischen für 2 min in der rotierenden Probe-Mischer für 2 min; </li><li> Pipette aus dem Überstand; </li><li> 1 ml Boratpuffer-Lösung in das Eppendorf-Röhrchen. Magnetic Beads sind nun bereit für die Beschichtung Schritt; </li></ol> Coating Verfahren <ol start="8"><li> Add 600 ml HT-2 konjugiert mit KLH (Keyhole Limpet Hämocyanin) Stammlösung auf 1 ml der magnetischen Beads) (final HT-2-KLH-Konzentration von 375 mg / ml); inkubieren magnetischen Beads und HT-2-KLH-Lösung für 20h bei 37 ° C * mit langsamen Neigung Rotation auf rotierenden Probe Mischer; </li><li> Nach der Inkubation wird das Reagenzglas in die magnetischen Partikel-Konzentrator und Pipette aus dem Überstand; Wash beschichteten Beads zweimal mit 1 ml PBS / BSA-Puffer-Lösung. Zwischen jedem Waschen entfernen PBS / BSA-Lösung. Alle Waschschritt durchgeführt Einstellung magnetischen Beads und PBS / BSA auf rotierenden Mischer für 5 min; </li><li> Wash magnetischen Beads einmal mit 1 ml TRIS / BSA-Puffer-Lösung. Entfernen TRIS / BSA-Lösung. Führen Sie diesen Schritt, indem magnetischen Beads und TRIS / BSA-Puffer auf rotierenden Mischer für 4 h bei 37 ° C *; </li><li> Wash magnetischen Beads einmal mit 1 ml aktualisiert (gehalten im Kühlschrank bei 4 ° C) PBS / BSA-Puffer-Lösung. Entfernen PBS / BSA-Lösung. Führen Sie diesen Schritt Einstellung magnetischen Beads und PBS / BSA-Puffer auf rotierenden Mischer für 5min bei Raumtemperatur; </li><li> Nach dem Waschen Schritt entfernen Sie alle Waschflüssigkeit und 1 ml PBS-Puffer + NaN 3 + BSA als Speicher Flüssigkeit; </li><li> Shop beschichteten magnetischen Kügelchen bei 4 ° C (bitte beachten Sie, dass beschichteten magnetischen Kügelchen stabil sind für mindestens 2 Monate bei 4 ° C); </li></ol> * Zu diesem Zweck wird der Mischer in den Ofen mit einem Loch, die das Einführen des Kabels für die Stromversorgung ermöglicht ausgestattet ist. Alternativ kann der Mixer konnte in einem thermostatisierten Raum bei 37 ° C. 7) Probenvorbereitung und Extraktion 25 g fein gemahlene Probe (Babynahrung oder Müsli) sind wirighed in einen Mixbecher und extrahiert mit 100 ml Acetonitril / Wasser-Lösung (86/14) für 3 min in einem High-Speed-Mixer. Nach Zentrifugation bei 4000 rpm (3000 g) für 5 min, 8 ml des Überstands wurden entnommen und mit Mycosep Säule wurden 4 ml des gereinigten Extrakt unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Getrocknete Proben können bei -30 ° C gelagert werden bis zu mehreren Monaten. 8) Beispiel Rekonstitution Frühstückscerealien Bereiten Sie die getrockneten Frühstücksflocken-Extrakt (Lebensmittel mit Getreideflocken für erwachsene Verzehr bestimmt sind) mit 40 ml PBS pH 7,4. Auf diese Weise eine Probe mit einer Konzentration von Toxin gleich den vermeintlichen gesetzlichen Grenzwert (200 ng / g) wird in der Messung Schritt ein Signal geben, fällt in der Mitte des Arbeitsbereiches. Babynahrung Bereiten Sie die getrockneten Babynahrung Extrakt (Lebensmittel mit Getreideflocken für Kleinkinder Verzehr bestimmt sind) mit 4 ml PBS. Auf diese Weise eine Probe mit einer Konzentration von Giftstoffen in Höhe der angeblichen gesetzlichen Grenzwert (20-25 ng / g) wird in der Messung Schritt ein Signal geben, fällt in der Mitte des Arbeitsbereiches.

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	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

Die Verwendung von Antikörpern als biomolekularen Erkennung Sonde hat eine breite Anwendung zur Erfassung von Technologien gesehen; immunchemischen Nachweis Methoden, wie z. B. ELISAs und MEIAs sind heutzutage unter den am häufigsten verwendeten und angewandte Plattformen in vielen Labors 7. Während diese Ansätze zu erzielen außergewöhnliche Sensitivität und Spezifität, ein primäres Ziel vieler Forschergruppen in den letzten Jahren hat sich der Verbesserung und Optimierun...

Reagenzien <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumdihydrogenphosphat </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dinatriumhydrogenphosphat </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 wasserfrei </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (99,5%) </td><td> Sigma </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [hydroxymethyl]-aminomethan </td><td> Sigma </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (Rinderserum-Albumin) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-Naphthyl-Phosphat Dinatriumsalz </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Magermilch blockiert Lösung - nicht Magermilchpulver </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 konjugiert mit KLH (Keyhole Limpet Hämocyanin), Stammlösung (1 mg / ml in PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> Die HT-2-KLH-Konjugat wurde durch CDI-Methode, bei der die freie OH-Gruppen auf Position 3 und 4 an der HT-2 Toxin, das von N, N&#39;-Carbonyldiimidazol (CDI) und der aktivierten HT-2 Toxin wurde aktiviert wurden erhalten lassen sich mit Aminogruppen des Proteins (KLH) reagieren, um eine stabile carbammate Verknüpfung erzeugen. </td></tr><tr><td> Sekundäre markierte Antikörper: Anti-Maus IgG (H + L) vom Pferd, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, Konzentration 1 mg / ml. </td><td> Vector Laboratories </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2-Toxin </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnetic Beads: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Konzentration 2 x 10 9 Beads / ml. </td></tr></table> Lösungen <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Vorbereitung </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 </td><td> Dissolve 0,20 g Kaliumchlorid, 0,20 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1,16 g Dinatriumhydrogenphosphat und 8,00 g Natriumchlorid in 900 ml Wasser </td><td></td></tr><tr><td> Diethanolaminpuffer, DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl 2 + 0.15 M KCl, pH 9,8 </td><td> Lösen Sie 0.0476g von MgCl 2 wasserfrei und 7.3.59 g KCl in ~ 300 ml Wasser. Nach der Auflösung add 51 ml DEA (99,5%). Der pH-Wert auf 9,8 mit HCl (6 M). Verdünnen auf 500 ml mit Wasser. </td><td></td></tr><tr><td> Borat-Puffer, 0,1 M, pH 9,5 </td><td> Dissolve 3,09 g H 3 BO 3 in ~ 300 ml destilliertem Wasser, pH-Wert auf 9,5 mit NaOH und / oder HCl (6 M oder niedrigere Konzentrationen). Verdünnen auf 500 ml mit destilliertem Wasser. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS-Puffer, 0,2 M, pH 8,5 </td><td> Dissolve 3,85 g Tris [hydroxymethyl]-aminomethan in 100 ml Wasser. Passen Sie auf pH 8,5 mit NaOH und / oder HCl (6 M oder niedrigere Konzentrationen). Verdünnen auf 200 ml mit Wasser. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS-Puffer + BSA-Lösung (0,1%), pH 8,4 </td><td> Lösen Sie 0,050 g BSA in 50 ml Tris-Puffer pH 8,4. </td><td> Diese Lösung muss frisch am Tag der Verwendung hergestellt werden. </td></tr><tr><td> PBS-Puffer + Tween ® 0,05% </td><td> Lösen Sie 0,250 g Tween 20 in 500 ml der zuvor hergestellten PBS-Puffer, pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td> PBS-Puffer + BSA-Lösung 0,1% </td><td> Lösen Sie 0,050 g BSA in 50 ml PBS-Puffer, pH 7,3. </td><td> Diese Lösung muss frisch am Tag der Verwendung hergestellt werden. </td></tr><tr><td> PBS-Puffer + 0,1% BSA + NaN 3 0,02% </td><td> Lösen Sie 0,050 g BSA und 0,010 von NaN 3 in 50 ml PBS-Puffer, pH 7,3. </td><td> Storage-Solution </td></tr><tr><td> Enzymatische Substrat </td><td> Lösen Sie 0,010 g 1-Naphthyl-Phosphat-Natriumsalz in 100 ml DEA-Puffer pH 9,8. Der Kolben wird fest in Alufolie. </td><td> Diese Lösung muss frisch am Tag der Verwendung hergestellt werden. </td></tr><tr><td> Magermilch Blockierungslösung </td><td> Add 0,20 g Blotting Grade Blocker fettfreie trockene Milch (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) zu 200 ml PBS-Puffer pH 7,3. </td><td> Diese Lösung muss frisch am Tag der Verwendung hergestellt werden. </td></tr><tr><td> HT-2-Stammlösung </td><td> Lösen Sie 10 mg Trichothecen HT-2-Toxin Fläschchen, in 10 ml Acetonitril zu geben eine Lösung mit einer Konzentration von 1 mg / ml. </td><td> Split bis diese Lösung in Einweg-Aliquots von 30 ml und speichern sie auf weniger als -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2-Working-Standard-Lösung </td><td> Pipette 20 ml der HT-2-Toxin-Stammlösung in ein 2 ml-Messkolben und verdünnt mit Acetonitril zu einer HT-2 funktionierende Lösung mit 10 ug / ml Trichothecene Toxin zu erhalten. </td><td> Diese Lösung sollte frisch am Tag der Verwendung hergestellt werden. </td></tr><tr><td> HT-2-Working Kalibrierlösung Lösungen </td><td> Verdünnen Sie die HT-2 arbeitet Standard-Lösung (10 pg / ml) auf die Zusammenarbeit Kalibrierlösung 100 ng / ml herzustellen. Verdünnen HT-2 arbeiten Kalibrierlösung 100 ng / ml auf die Arbeitsunterlagen vorzubereiten Kalibrierlösung Lösungen der folgenden Konzentrationen 0 (leer), 0,5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> Diese Lösungen müssen bereit sein, am Tag der Verwendung frisch. </td></tr><tr><td> HT-2 konjugiert mit KLH </td><td> Split up HT-2 konjugiert mit KLH (Keyhole Limpet Hämocyanin) Stammlösung (1 mg / ml in PBS) in Einweg-Aliquots von 350 ul. </td><td> Shop Aliquots bei -30 ° C. </td></tr><tr><td> Spezifischer monoklonaler Antikörper </td><td> Verdünnen 1:350 (v: v) die Aktie Konzentration (1,383 mg / ml) des monoklonalen Antikörpers in PBS, um im Wettbewerb Schritt verwenden </td><td> Diese Lösung muss bereit sein zum Zeitpunkt der Verwendung frischer werden. 10 ml Antikörper-Stammlösung in PBS für ein Endvolumen von 3,5 ml, reichen bis 17 Normen und / oder Proben zu analysieren. </td></tr><tr><td> Sekundärer markierter Antikörper </td><td> Anti-Maus IgG (H + L) konjugiert mit alkalischer Phosphatase wird verdünnt 1:100 (v: v) in PBS, um im Wettbewerb Schritt zu verwenden. </td><td> 100 ul Antikörper-Stammlösung in PBS für ein Endvolumen von 10 ml, reichen bis 25 Normen und / oder Proben zu analysieren. Diese Lösung muss bereit sein zum Zeitpunkt der Verwendung frischer werden. </td></tr></table> Apparat <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Magnetic Particle Concentrator: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens Instrument </td><td> PalmSens </td><td> Ausgestattet mit PalmSens Lite, Serial-Kabel verbindet PC Laptop und Mux Optionen Software </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens Multiplexer </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Acht-Kanal Mux elektrischen Kontakt </td><td> Hand gemacht </td><td></td></tr><tr><td> Streifen mit acht Siebdruck-Elektroden (SPEs) </td><td> Hand gemacht </td><td></td></tr><tr><td> Speziell entwickelt für Elektroden Streifen </td><td> Hand gemacht </td><td> Inklusive 8 Neodym-Magneten von denen jeder unter jedem Arbeitstag Elektrodenfläche der SPE gelegt wird </td></tr><tr><td> Kalibriert Mikroliterpipetten </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Magnetrührer und Rührstäbchen. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bechergläser (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Messkolben (2 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2 und 2 ml Eppendorf-Röhrchen. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Falcon ™ Tuben 5ml und 15ml. </td><td> Falke </td><td></td></tr><tr><td> Laboratory Vortex Mixer </td><td></td><td> Verwenden Sie keine Vortex-Mixer an magnetische Kügelchen mit HT2-KLH beschichtet oder in Verbindung mit immunologischen Kette resuspendieren zu vermeiden Denaturierung von Proteinadsorption Teile </td></tr><tr><td> Laborofen oder thermostatisierten Raum </td><td></td><td> Wählen Sie einen Ofen in der Lage, eine Temperatur von 37 ± 3 ° C zu halten </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Immunoassays sind eine gültige Alternative zu den teuren und zeitaufwendigen quantitative HPLC-oder GC-1, 2 Methoden für das Screening Erkennung von gefährlichen Mykotoxinen in Nahrungsmitteln. In diesem Protokoll zeigen wir, wie zu fertigen und zu verhören einen elektrochemischen wettbewerbsfähigen enzyme linked immunomagnetische Assay, der auf die Verwendung von magnetischen Kügelchen als feste Unterstützung für den immunchemischen Kette 3 und Siebdruck-Elektroden als sensing-Plattform. Unsere Methode zielt darauf ab, den Gesamtbetrag der HT-2 und T-2-Toxine, Mykotoxine aus der Trichothecene Familie und von großer Bedeutung für die menschliche Gesundheit 4 zu bestimmen. Der Einsatz eines Antikörpers Klon mit einer Kreuzreaktivität von 100% gegenüber HT-2 und T-2 ermöglicht die gleichzeitige Nachweis beider Toxine mit ähnlicher Empfindlichkeit 5. Der erste Schritt unseres Tests ist die Beschichtung Schritt, wo wir immobilisieren HT2-KLH-Konjugat-Toxin auf die Oberfläche des magnetischen Kügelchen. Nach einem Blocking-Schritt notwendig, um unspezifische Absorptionen zu vermeiden, kann die Zugabe eines monoklonalen Antikörpers die Konkurrenz zwischen immobilisierten HT-2-und HT-2-freien oder T-2 in der Probe vorhanden oder gelöst in einem Standard-Lösung. Am Ende des Wettbewerbs Schritt, die Höhe des monoklonalen Antikörpers verknüpft die immobilisierten HT-2 ist umgekehrt proportional zur Menge des Toxins in der Probelösung. Ein sekundärer Antikörper mit alkalischer Phosphatase (AP) bezeichnet wird verwendet, um die Bindung zwischen den spezifischen Antikörper und dem immobilisierten HT-2 offenbaren. Die abschließende Messung Schritt wird durch Fallenlassen eines Aliquots Magnetic-Bead-Suspension durchgeführt, das entspricht einer spezifischen Probe / Standard-Lösung auf der Oberfläche eines Siebdruck-Arbeitselektrode; magnetischen Beads immobilisiert und mit Hilfe eines Magneten genau unter dem platziert konzentriert Siebdruck-Elektrode. Nach zwei Minuten der Inkubation zwischen magnetischen Kügelchen und ein Substrat für AP, ist die enzymatische Produkt durch Differential-Puls-Voltammetrie (DPV) mit einem tragbaren Gerät (PalmSens) auch in der Lage, automatisch acht Messungen in einem Intervall von wenigen Sekunden starten erkannt.

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ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Ein Protokoll, um Trichothecene (Mykotoxine, die für die menschliche Gesundheit) mit einem neu entwickelten Screening-Methode auf einem wettbewerbsfähigen immunchemischen Verfahren und eine endgültige elektrochemischer Detektion basierte Erkennung demonstriert.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Elektrochemische) Verfahren zur Mykotoxin-Erkennung

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

elime-enzyme-linked-immuno-magnetic-electrochemical-method-for

Research

JoVE Journal

Biology

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

14.1K Aufrufe.  University of Rome, Tor Vergata. Ein Protokoll, um Trichothecene (Mykotoxine, die für die menschliche Gesundheit) mit einem neu entwickelten Screening-Methode auf einem wettbewerbsfähigen immunchemischen Verfahren und eine endgültige elektrochemischer Detektion basierte Erkennung demonstriert.

Serie: ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Detektion von Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Forschung

Biologie

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulse-Chase-Analyse von N-verknüpften Zuckerketten von Glykoproteinen in Säugerzellen

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Direkter Nachweis der Acetat-bildenden Aktivität des Enzyms Acetat-Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Elektroantennographischer Bioassay als Screening-Instrument für Wirtspflanzen Volatile

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.