Wir danken Drs. Anthony Cornel und Laura Norris an der UC Davis und Dr. Katharina Kreppel an der Universität von Glasgow für die Bereitstellung von Moskito Proben aus Tansania. Wir danken Frau Smita Das und Dr. Douglas Norris von der Johns Hopkins School of Public Health für den Austausch von Moskito Proben aus Sambia. Wir danken auch Mr. Lee V. Millon an der Tierärztlichen Genetics Laboratory für das Training auf Assay-Design. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health gewähren R01AI 078.183 und R21AI062929.

1. PCR-Amplifikation <ol><li> Mischen Sie alle PCR-Primer (Siehe zusätzliche Tabelle S1) in einem 1,5 ml Mikroröhrchen. Jeder SNP hat zwei Primer (vorwärts und rückwärts). Sicherzustellen, dass der Stammkonzentration von jedem PCR-Primer wird bei 100 &amp; mgr; M gehalten. Stellen Sie genug Primer Mix für 500-1.000 Reaktionen zur Verringerung Pipettieren Fehler und Zeit auf der Bank (siehe ergänzende Tabelle S2). Auf Wunsch bereiten Aliquots für 100 bis 200 Reaktionen pro Röhrchen und bei -20 ° C. </li><li> Bereiten PCR-Cocktail nach dem Protokoll des Herstellers (Tabelle 1) beschrieben. Das Volumen für 96 Reaktionen enthält einen Überhang von 20%. Vortex die Röhrchen mit der PCR-Cocktail leicht und Zentrifuge für 30 Sekunden bei 2.000 x g. </li><li> Verzichtet werden 3 ul der PCR-Cocktail in jede Vertiefung einer ohne Rahmen 96 Well-Platte. Ein Repeater-Pipette kann Zeit für diesen Prozess zu speichern. </li><li> Add 2 ul der entsprechenden genomischen DNA von Moskitos in jede Vertiefung geben. HINWEIS: Prozess zur Gewinnung von genomischer DNA aus m<html> osquito Gewebe (Head / Thorax, Abdomen oder Ganzkörper) wird in anderen Literaturen 29-32 beschrieben. Wählen Sie einen geeigneten DNA-Extraktionsprotokoll zu denen mit Plasmodium im Blut (Abdomen) von infektiösen Mücken (im Head / Thorax-Plasmodium) zu differenzieren. Wir verwenden in der Regel von Körperteilen (Head / Thorax oder Abdomen) Mücken extrahierten DNA, so dass DNA-Konzentration variiert von 0.05-2ng / ul. Obwohl die Gesamt-DNA-Eingang unter der Herstellerempfehlung (5-10ng / Reaktion) ist, wir in der Regel erhalten, robust SNP Anrufe von 98% der DNA-Proben ohne Amplifikation des gesamten Genoms. </li><li> Verschließen Sie die Platte vorsichtig mischen oder vortexen und zentrifugieren Sie für 1 min bei 370 x g. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Thermocycler-Protokoll zur Durchführung von PCR-Amplifikation: (1) 94 ° C für 2 min, (2) 94 ° C für 30 Sekunden, (3) 56 ° C für 30 Sekunden, (4) 72 ° C für 1 min (5) Wiederholen der Stufe (2) - (4) für 45 Zyklen (6) 72 ° C für 1 min und 4 ° C gehalten. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. SAP-Behandlung <ol><li> Bereiten Sie die SAP Enzymlösung in einer Platte mit 96 Vertiefungen (siehe Tabelle 2). Prozess 96 Proben in einer Platte. Das Volumen für 96 Reaktionen enthält einen Überhang von 20%. </li><li> Vortex die Röhre von SAP Enzymlösung leicht und Zentrifuge für 30 Sekunden bei 2.000 x g. Dispense 2 ul des SAP Enzymlösung in jedes Well. Auch hier kann ein Repeater-Pipette Zeit für diesen Prozess zu speichern. </li><li> Verschließen Sie die Platte vorsichtig mischen oder vortexen und zentrifugieren Sie für 1 min bei 370 x g. Inkubieren der Platte wie folgt: (1) 37 ° C für 40 min, (2) 85 ° C für 5 Minuten, um das Enzym zu inaktivieren, (3) 4 ° C gehalten. Bei Beendigung dieser Stufe, speichern Sie die Platte bei -20 ° C, bevor Sie fortfahren. Verarbeiten Sie die gespeicherten Platte innerhalb von 2 Wochen. </li></ol> 3. SNP-Erweiterung <ol><li> Wenn die Probenplatte nach SAP Behandlung gefrieren, so ist es auf RT auftauen, bevor Sie fortfahren. </li><li> Bereiten Sie die Verlängerungsprimer Mix (Supplemental Tabelle S2). Jeder SNP hat einen extension Primer. Bewahren Sie die Lager Konzentration jedes Verlängerungsprimer bei 500 uM. Optional aliquoten für 100 bis 200 Reaktionen pro Röhrchen und bei -20 ° C. </li><li> Bereiten Verlängerungsmischung, wie in Tabelle 3 Reaktionsvolumen 96 enthält einen Überhang von 20% beschrieben. </li><li> Vortex die Röhre der Erweiterung Cocktail leicht und Zentrifuge für 30 Sekunden bei 2.000 x g. Dispense 2 ul des Verlängerungs Cocktail in jede Vertiefung. Auch hier kann ein Repeater-Pipette Zeit für diesen Prozess zu speichern. </li><li> Verschließen Sie die Platte vorsichtig mischen oder vortexen und zentrifugieren Sie für 1 min bei 370 x g. Thermozyklus der Platte wie in Abbildung 1 dargestellt. An diesem Punkt der Massenspektrometrie gehen oder lagern Sie die Platte bei -20 ° C bis zu 2 Wochen. </li></ol> 4. Auswertung der SNP-Verlängerungsprodukt zu Massenspektrometrie Analyse Optimieren <ol><li> Wenn die Probenplatte nach SNP-Erweiterung gefrieren, so ist es auf RT auftauen, bevor Sie fortfahren. </li><li> Übertragen Sie 15 mg Harz von seiner container auf die Grübchen Platte mit einem langgestreckten Löffel. Verwenden Sie den Schaber, um Harz in die Vertiefungen der Vertiefung Platte verteilt. Fegen Sie den Schaber von der Seite, über die Noppenplatte her, um den Harz zu verbreiten. Vergewissern Sie sich, Harz in jedem Well. </li><li> Kratzen Sie überschüssiges Harz aus der Vertiefung Platte mit dem Schaber. Lass das Harz stehen Grübchens Platte für mindestens 20 min. Während der Vermietung das Harz stehen in der Vertiefung Platte, fügen Sie 41 ul der HPLC-Wasser in jedes Well der Probenplatte. </li><li> Legen Sie vorsichtig die Probenplatte auf den Kopf, auf den Grübchen Platte. Sicherstellen, dass die Probenplatte setzt gegen den kleinen runden Beitrag der Vertiefung Platte, die die Brunnen in der Probenplatte mit den Bohrungen in der Vertiefung Platte richtet. </li><li> Halten der Probenplatte und die Grübchen Platte zusammen, sanft Flip sie über so das Harz fällt aus dem Vertiefungsplatte in die Vertiefungen der Probenplatte. Tippen Sie auf die Noppenplatte so das Harz fällt in die Probenplatte. Sicherstellen, dass alle das Harz in dem dimple Platte fällt aus auf die Probenplatte Brunnen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 3200 g für 30 Sek. </li><li> Drehen Sie den Probenteller auf einem Rotator für 5 min bei RT. Rotator muss der Probenplatte um 360 ° um die Längsachse. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe Platte bei 3200 xg für 5 min. Nach diesem Schritt speichern Sie die Probenplatte bei -20 ° C bis zu 2 Wochen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt. </li></ol> 5. MALDI-TOF-Massenspektrometrie <ol><li> Übertragen Sie die Anlage SNP Verlängerungsprodukt auf eine Bioarray wie SpectroCHIP nach Herstellerangaben. Wir verwenden Massarray Nanodispenser für diesen Schritt. </li><li> Sobald die Übertragung abgeschlossen ist, festzulegen, wie Tests und Platten sind in der Testdatenbank eingerichtet werden. Nennen Sie den Test und Platten, so dass jede Platte eindeutige Kennung, die spezifischen Assay-Design (Supplemental Tabelle S3) verbindet. </li><li> Nach dem Test und Platte festgelegt sind, zu erwerben Spektren mit einem Massenspektrometer. </li></ol><ol><li> Führen Sie die Datenanalyse unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Analyse der Dateninterpretation Software wie Typer Analyzer oder TyperViewer (Sequenom). Erhalten von Daten in .xml-Format, die die Probe Layout Massenspektrogramm für jede Vertiefung enthält, die Marker-Informationen wie Name, erwartete Masse für jede Variante des entsprechenden SNP, und jeder Fehler oder Warnungen bei jeder Reaktion verbunden. Abbildung 2 zeigt die resultierende Massenspektrogramm. </li><li> Durchführung SNP-Genotyp Clustering-Analyse durch Einstellen des Erfassungsschwellenwert (Größe oder Signal-Rausch-Verhältnis) und die Toleranz / Varianz für jeden Genotyp erlaubt, Fig. 3 zeigt ein Beispiel für ein 04707-KDR # 2 SNP-Genotyp Clustern. </li><li> Exportieren Sie die resultierenden SNP-Genotyp Anrufe in ein Tabellenkalkulationsprogramm. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

- Flugzeit (MALDI-TOF) -Massenspektrometrie 33-37 PCR-Amplifikation shrimp alkalischer Phosphatase (SAP) Reaktion SNP Verlängerung Verlängerungsprodukt Anlage und Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation: Das MDA ist aus fünf Hauptschritten zusammengesetzt. Die erste PCR-Amplifikation Schritt verstärkt DNA flankieren jedes SNP damit genügend Template-DNA wird an der SNP Verlängerungsschritt verfügbar. Der SAP-Reaktion neutralisiert ungenutzte dNTPs, die mit der folgenden SNP Verlängerungssch...

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii und Anopheles gambiae sind die wichtigsten Vektoren für Malaria-Übertragung in Afrika 1 verantwortlich. Diese drei Arten sind morphologisch nicht 2 und nur durch molekularen Assays 3-9 unterscheiden. Darüber hinaus gibt es viele Downstream-Tests routinemäßig durchgeführt, um epidemiologische und populationsgenetische Untersuchungen zu unterstützen. Diese umfassen (1) eine Genotypisierungsassay für Speziation Inseln 10-12, (2) eine Genotypisierungsassay Anerkennung nicht gleichbedeutend SNPs in der 1014 th Aminosäurecodon Position para-Gen (der Knock-down-Widerstand oder kdr, SNP) 13 -18, (3) Parasitenerkennung PCR 19-23, und (4) Screening von wirtsspezifischen DNA in Moskito midguts 24,25. Wir entwickelten eine Mehrnachweisassay (MDA), die alle diese Assays in einer einzigen Multiplex-Reaktion mit dem Ziel, eine Kombinationalyzing epidemiologisch wichtige Eigenschaften der Malariavektoren in Afrika. Die MDA-Assay umfasst mehrere Marker zum Detektieren (1) Art (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii oder andere (keiner der drei)), (2), Insektizidresistenz in kdr SNPs dargestellt (beide L1014F und L1014S) , (3) auf zwei wesentliche Malaria-Parasiten, Plasmodium falciparum und P. vivax, und (4) Blutquelle von einem aviären und sechs Säugetierwirten. Traditionell wurden diese Assays in separaten Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt. Wenn all diese Tests werden unter Verwendung einer herkömmlichen PCR-Plattform erfolgt, bedarf es der Durchführung 8-10 PCR-Assays und Begleit Gelelektrophorese Schritte. Jeder einzelne PCR-Reaktion von der Vorbereitung bis Dokumentation der Ergebnisse dauert 4-5 Stunden, während der hier vorgestellten MDA Verfahren dauert etwa 5 Stunden in der Gesamtheit. Dies entspricht einer 90% Einsparungen bei den Arbeitskosten allein. Der MDA präsentiert hier kostet $ 5pro Probe, um alle 33 SNPs Genotyp. Dies ist erheblich weniger teuer als die einzigen Agarosegel basierenden Assays, die ungefähr $ 1,50 pro Probe kostet. Assays Erkennen alle Merkmale durch die MDA abgedeckt würde ein Minimum von 8-10 verschiedenen Agarose-Gel-basierte Assays zu einem Preis von $ 15.12 pro Probe erforderlich. Darüber hinaus ist die MDA stark die Möglichkeit der Erzeugung eines falschen positiven oder negativen durch die Verwendung von mindestens drei Marker für jeden Parasiten oder Host Quellenerkennung reduziert. Die Plattform verwendeten wir nicht an Malaria Vektoren beschränkt, sondern kann in einer Vielzahl von Anwendungen, wie der Medizin, Veterinärmedizin, und grundlegende Biologie 26-28 verwendet werden. Vertiefte Assoziationsstudien oder Populationsgenetik Studien mit einer großen (in der Reihenfolge der 100s) Anzahl der Proben erfordern kosteneffiziente Tests Screening für mehrere Marker gleichzeitig. Die meisten Studien, die zwei oder mehr getrennten PCR-Assays konnte MDA für schnellere Ergebnisse zu geringeren Kosten zu realisieren. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="588">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Analyzer Compact</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">MT9</td>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">RS1000</td>
			<td>Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iPLEX Gold Genotyping Reagent Set</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">10158</td>
			<td>Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-detection assay for malaria transmitting mosquitoes

Die Anopheles gambiae Artenkomplex umfasst die wichtigsten Malariatragenden Mücken in Afrika. Da diese Arten solcher medizinischer Bedeutung, werden mehrere Merkmale in der Regel mit Hilfe molekularer Tests in epidemiologischen Studien zu helfen aus. Diese Eigenschaften umfassen Artbestimmung, Insektizidresistenz, Parasiteninfektion Status und Wirtspräferenz. Seit Populationen der Anopheles gambiae komplexe morphologisch nicht zu unterscheiden ist eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) traditionell genutzt, um Arten zu identifizieren. Sobald die Arten bekannt ist, werden mehrere Downstream-Tests routinemäßig durchgeführt, um weitere Eigenschaften zu erklären. Zum Beispiel Mutationen KDR in einer para-Gen bekannt Resistenz gegen DDT und Pyrethroid-Insektiziden. Zusätzlich werden Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) oder Plasmodium Parasiten-DNA Nachweis-PCR-Assays verwendet werden, um in Moskito Geweben vorhandenen Parasiten erkennen. Schließlich a combination der PCR und Restriktionsenzym verdaut, kann verwendet werden, um Wirtspräferenz (zB menschliche vs. Tierblut) durch Screening der Moskitoblutmehl für Host-spezifische DNA aufzuklären. Wir haben eine Mehrnachweisassay (MDA), die alle der oben genannten Assays zu einer Zeit verbindet, in einer einzigen Multiplex-Reaktion Genotypisierung 33SNPs für 96 oder 384 Proben entwickelt. Da die MDA umfasst mehrere Marker für Arten, Plasmodium Erkennung und Gastgeber Blut Identifikation, wird die Wahrscheinlichkeit der Erzeugung von falschen Positiven oder Negativen stark von vorherigen Tests, die nur eine Markierung pro Merkmal sind reduziert. Diese robusten und einfachen Test kann diese Schlüsselmoskito Eigenschaften kostengünstig und in einem Bruchteil der Zeit bestehender Assays.

Artbestimmung: Die folgenden 5 SNPs zusammen identifizieren drei Arten (A. arabiensis, A. coluzzii und A. gambiae) (Tabelle 4). Wenn eine Probe nicht einer der drei Arten, die drei SNPs (01.073-213, 04.679 bis 157 und 10.313 -052) nicht zu verstärken. kdr Genotyp zur Ableitung Insektizidresistenz: Die 1014 th Codon der para spannungsabhängigen Natriumk...

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A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Ein Multi-Nachweistest für Malaria tragenden Mücken

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

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13.0K Aufrufe.  School of Veterinary Medicine, University of California - Davis. Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.