Wir danken Drs. Anthony Cornel und Laura Norris an der UC Davis und Dr. Katharina Kreppel an der Universität von Glasgow für die Bereitstellung von Moskito Proben aus Tansania. Wir danken Frau Smita Das und Dr. Douglas Norris von der Johns Hopkins School of Public Health für den Austausch von Moskito Proben aus Sambia. Wir danken auch Mr. Lee V. Millon an der Tierärztlichen Genetics Laboratory für das Training auf Assay-Design. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health gewähren R01AI 078.183 und R21AI062929.

1. PCR-Amplifikation <ol><li> Mischen Sie alle PCR-Primer (Siehe zusätzliche Tabelle S1) in einem 1,5 ml Mikroröhrchen. Jeder SNP hat zwei Primer (vorwärts und rückwärts). Sicherzustellen, dass der Stammkonzentration von jedem PCR-Primer wird bei 100 &amp; mgr; M gehalten. Stellen Sie genug Primer Mix für 500-1.000 Reaktionen zur Verringerung Pipettieren Fehler und Zeit auf der Bank (siehe ergänzende Tabelle S2). Auf Wunsch bereiten Aliquots für 100 bis 200 Reaktionen pro Röhrchen und bei -20 ° C. </li><li> Bereiten PCR-Cocktail nach dem Protokoll des Herstellers (Tabelle 1) beschrieben. Das Volumen für 96 Reaktionen enthält einen Überhang von 20%. Vortex die Röhrchen mit der PCR-Cocktail leicht und Zentrifuge für 30 Sekunden bei 2.000 x g. </li><li> Verzichtet werden 3 ul der PCR-Cocktail in jede Vertiefung einer ohne Rahmen 96 Well-Platte. Ein Repeater-Pipette kann Zeit für diesen Prozess zu speichern. </li><li> Add 2 ul der entsprechenden genomischen DNA von Moskitos in jede Vertiefung geben. HINWEIS: Prozess zur Gewinnung von genomischer DNA aus m<html> osquito Gewebe (Head / Thorax, Abdomen oder Ganzkörper) wird in anderen Literaturen 29-32 beschrieben. Wählen Sie einen geeigneten DNA-Extraktionsprotokoll zu denen mit Plasmodium im Blut (Abdomen) von infektiösen Mücken (im Head / Thorax-Plasmodium) zu differenzieren. Wir verwenden in der Regel von Körperteilen (Head / Thorax oder Abdomen) Mücken extrahierten DNA, so dass DNA-Konzentration variiert von 0.05-2ng / ul. Obwohl die Gesamt-DNA-Eingang unter der Herstellerempfehlung (5-10ng / Reaktion) ist, wir in der Regel erhalten, robust SNP Anrufe von 98% der DNA-Proben ohne Amplifikation des gesamten Genoms. </li><li> Verschließen Sie die Platte vorsichtig mischen oder vortexen und zentrifugieren Sie für 1 min bei 370 x g. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Thermocycler-Protokoll zur Durchführung von PCR-Amplifikation: (1) 94 ° C für 2 min, (2) 94 ° C für 30 Sekunden, (3) 56 ° C für 30 Sekunden, (4) 72 ° C für 1 min (5) Wiederholen der Stufe (2) - (4) für 45 Zyklen (6) 72 ° C für 1 min und 4 ° C gehalten. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. SAP-Behandlung <ol><li> Bereiten Sie die SAP Enzymlösung in einer Platte mit 96 Vertiefungen (siehe Tabelle 2). Prozess 96 Proben in einer Platte. Das Volumen für 96 Reaktionen enthält einen Überhang von 20%. </li><li> Vortex die Röhre von SAP Enzymlösung leicht und Zentrifuge für 30 Sekunden bei 2.000 x g. Dispense 2 ul des SAP Enzymlösung in jedes Well. Auch hier kann ein Repeater-Pipette Zeit für diesen Prozess zu speichern. </li><li> Verschließen Sie die Platte vorsichtig mischen oder vortexen und zentrifugieren Sie für 1 min bei 370 x g. Inkubieren der Platte wie folgt: (1) 37 ° C für 40 min, (2) 85 ° C für 5 Minuten, um das Enzym zu inaktivieren, (3) 4 ° C gehalten. Bei Beendigung dieser Stufe, speichern Sie die Platte bei -20 ° C, bevor Sie fortfahren. Verarbeiten Sie die gespeicherten Platte innerhalb von 2 Wochen. </li></ol> 3. SNP-Erweiterung <ol><li> Wenn die Probenplatte nach SAP Behandlung gefrieren, so ist es auf RT auftauen, bevor Sie fortfahren. </li><li> Bereiten Sie die Verlängerungsprimer Mix (Supplemental Tabelle S2). Jeder SNP hat einen extension Primer. Bewahren Sie die Lager Konzentration jedes Verlängerungsprimer bei 500 uM. Optional aliquoten für 100 bis 200 Reaktionen pro Röhrchen und bei -20 ° C. </li><li> Bereiten Verlängerungsmischung, wie in Tabelle 3 Reaktionsvolumen 96 enthält einen Überhang von 20% beschrieben. </li><li> Vortex die Röhre der Erweiterung Cocktail leicht und Zentrifuge für 30 Sekunden bei 2.000 x g. Dispense 2 ul des Verlängerungs Cocktail in jede Vertiefung. Auch hier kann ein Repeater-Pipette Zeit für diesen Prozess zu speichern. </li><li> Verschließen Sie die Platte vorsichtig mischen oder vortexen und zentrifugieren Sie für 1 min bei 370 x g. Thermozyklus der Platte wie in Abbildung 1 dargestellt. An diesem Punkt der Massenspektrometrie gehen oder lagern Sie die Platte bei -20 ° C bis zu 2 Wochen. </li></ol> 4. Auswertung der SNP-Verlängerungsprodukt zu Massenspektrometrie Analyse Optimieren <ol><li> Wenn die Probenplatte nach SNP-Erweiterung gefrieren, so ist es auf RT auftauen, bevor Sie fortfahren. </li><li> Übertragen Sie 15 mg Harz von seiner container auf die Grübchen Platte mit einem langgestreckten Löffel. Verwenden Sie den Schaber, um Harz in die Vertiefungen der Vertiefung Platte verteilt. Fegen Sie den Schaber von der Seite, über die Noppenplatte her, um den Harz zu verbreiten. Vergewissern Sie sich, Harz in jedem Well. </li><li> Kratzen Sie überschüssiges Harz aus der Vertiefung Platte mit dem Schaber. Lass das Harz stehen Grübchens Platte für mindestens 20 min. Während der Vermietung das Harz stehen in der Vertiefung Platte, fügen Sie 41 ul der HPLC-Wasser in jedes Well der Probenplatte. </li><li> Legen Sie vorsichtig die Probenplatte auf den Kopf, auf den Grübchen Platte. Sicherstellen, dass die Probenplatte setzt gegen den kleinen runden Beitrag der Vertiefung Platte, die die Brunnen in der Probenplatte mit den Bohrungen in der Vertiefung Platte richtet. </li><li> Halten der Probenplatte und die Grübchen Platte zusammen, sanft Flip sie über so das Harz fällt aus dem Vertiefungsplatte in die Vertiefungen der Probenplatte. Tippen Sie auf die Noppenplatte so das Harz fällt in die Probenplatte. Sicherstellen, dass alle das Harz in dem dimple Platte fällt aus auf die Probenplatte Brunnen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 3200 g für 30 Sek. </li><li> Drehen Sie den Probenteller auf einem Rotator für 5 min bei RT. Rotator muss der Probenplatte um 360 ° um die Längsachse. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe Platte bei 3200 xg für 5 min. Nach diesem Schritt speichern Sie die Probenplatte bei -20 ° C bis zu 2 Wochen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt. </li></ol> 5. MALDI-TOF-Massenspektrometrie <ol><li> Übertragen Sie die Anlage SNP Verlängerungsprodukt auf eine Bioarray wie SpectroCHIP nach Herstellerangaben. Wir verwenden Massarray Nanodispenser für diesen Schritt. </li><li> Sobald die Übertragung abgeschlossen ist, festzulegen, wie Tests und Platten sind in der Testdatenbank eingerichtet werden. Nennen Sie den Test und Platten, so dass jede Platte eindeutige Kennung, die spezifischen Assay-Design (Supplemental Tabelle S3) verbindet. </li><li> Nach dem Test und Platte festgelegt sind, zu erwerben Spektren mit einem Massenspektrometer. </li></ol><ol><li> Führen Sie die Datenanalyse unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Analyse der Dateninterpretation Software wie Typer Analyzer oder TyperViewer (Sequenom). Erhalten von Daten in .xml-Format, die die Probe Layout Massenspektrogramm für jede Vertiefung enthält, die Marker-Informationen wie Name, erwartete Masse für jede Variante des entsprechenden SNP, und jeder Fehler oder Warnungen bei jeder Reaktion verbunden. Abbildung 2 zeigt die resultierende Massenspektrogramm. </li><li> Durchführung SNP-Genotyp Clustering-Analyse durch Einstellen des Erfassungsschwellenwert (Größe oder Signal-Rausch-Verhältnis) und die Toleranz / Varianz für jeden Genotyp erlaubt, Fig. 3 zeigt ein Beispiel für ein 04707-KDR # 2 SNP-Genotyp Clustern. </li><li> Exportieren Sie die resultierenden SNP-Genotyp Anrufe in ein Tabellenkalkulationsprogramm. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

- Flugzeit (MALDI-TOF) -Massenspektrometrie 33-37 PCR-Amplifikation shrimp alkalischer Phosphatase (SAP) Reaktion SNP Verlängerung Verlängerungsprodukt Anlage und Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation: Das MDA ist aus fünf Hauptschritten zusammengesetzt. Die erste PCR-Amplifikation Schritt verstärkt DNA flankieren jedes SNP damit genügend Template-DNA wird an der SNP Verlängerungsschritt verfügbar. Der SAP-Reaktion neutralisiert ungenutzte dNTPs, die mit der folgenden SNP Verlängerungssch...

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii und Anopheles gambiae sind die wichtigsten Vektoren für Malaria-Übertragung in Afrika 1 verantwortlich. Diese drei Arten sind morphologisch nicht 2 und nur durch molekularen Assays 3-9 unterscheiden. Darüber hinaus gibt es viele Downstream-Tests routinemäßig durchgeführt, um epidemiologische und populationsgenetische Untersuchungen zu unterstützen. Diese umfassen (1) eine Genotypisierungsassay für Speziation Inseln 10-12, (2) eine Genotypisierungsassay Anerkennung nicht gleichbedeutend SNPs in der 1014 th Aminosäurecodon Position para-Gen (der Knock-down-Widerstand oder kdr, SNP) 13 -18, (3) Parasitenerkennung PCR 19-23, und (4) Screening von wirtsspezifischen DNA in Moskito midguts 24,25. Wir entwickelten eine Mehrnachweisassay (MDA), die alle diese Assays in einer einzigen Multiplex-Reaktion mit dem Ziel, eine Kombinationalyzing epidemiologisch wichtige Eigenschaften der Malariavektoren in Afrika. Die MDA-Assay umfasst mehrere Marker zum Detektieren (1) Art (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii oder andere (keiner der drei)), (2), Insektizidresistenz in kdr SNPs dargestellt (beide L1014F und L1014S) , (3) auf zwei wesentliche Malaria-Parasiten, Plasmodium falciparum und P. vivax, und (4) Blutquelle von einem aviären und sechs Säugetierwirten. Traditionell wurden diese Assays in separaten Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt. Wenn all diese Tests werden unter Verwendung einer herkömmlichen PCR-Plattform erfolgt, bedarf es der Durchführung 8-10 PCR-Assays und Begleit Gelelektrophorese Schritte. Jeder einzelne PCR-Reaktion von der Vorbereitung bis Dokumentation der Ergebnisse dauert 4-5 Stunden, während der hier vorgestellten MDA Verfahren dauert etwa 5 Stunden in der Gesamtheit. Dies entspricht einer 90% Einsparungen bei den Arbeitskosten allein. Der MDA präsentiert hier kostet $ 5pro Probe, um alle 33 SNPs Genotyp. Dies ist erheblich weniger teuer als die einzigen Agarosegel basierenden Assays, die ungefähr $ 1,50 pro Probe kostet. Assays Erkennen alle Merkmale durch die MDA abgedeckt würde ein Minimum von 8-10 verschiedenen Agarose-Gel-basierte Assays zu einem Preis von $ 15.12 pro Probe erforderlich. Darüber hinaus ist die MDA stark die Möglichkeit der Erzeugung eines falschen positiven oder negativen durch die Verwendung von mindestens drei Marker für jeden Parasiten oder Host Quellenerkennung reduziert. Die Plattform verwendeten wir nicht an Malaria Vektoren beschränkt, sondern kann in einer Vielzahl von Anwendungen, wie der Medizin, Veterinärmedizin, und grundlegende Biologie 26-28 verwendet werden. Vertiefte Assoziationsstudien oder Populationsgenetik Studien mit einer großen (in der Reihenfolge der 100s) Anzahl der Proben erfordern kosteneffiziente Tests Screening für mehrere Marker gleichzeitig. Die meisten Studien, die zwei oder mehr getrennten PCR-Assays konnte MDA für schnellere Ergebnisse zu geringeren Kosten zu realisieren. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="588">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Analyzer Compact</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">MT9</td>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">RS1000</td>
			<td>Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iPLEX Gold Genotyping Reagent Set</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">10158</td>
			<td>Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-detection assay for malaria transmitting mosquitoes

Die Anopheles gambiae Artenkomplex umfasst die wichtigsten Malariatragenden Mücken in Afrika. Da diese Arten solcher medizinischer Bedeutung, werden mehrere Merkmale in der Regel mit Hilfe molekularer Tests in epidemiologischen Studien zu helfen aus. Diese Eigenschaften umfassen Artbestimmung, Insektizidresistenz, Parasiteninfektion Status und Wirtspräferenz. Seit Populationen der Anopheles gambiae komplexe morphologisch nicht zu unterscheiden ist eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) traditionell genutzt, um Arten zu identifizieren. Sobald die Arten bekannt ist, werden mehrere Downstream-Tests routinemäßig durchgeführt, um weitere Eigenschaften zu erklären. Zum Beispiel Mutationen KDR in einer para-Gen bekannt Resistenz gegen DDT und Pyrethroid-Insektiziden. Zusätzlich werden Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) oder Plasmodium Parasiten-DNA Nachweis-PCR-Assays verwendet werden, um in Moskito Geweben vorhandenen Parasiten erkennen. Schließlich a combination der PCR und Restriktionsenzym verdaut, kann verwendet werden, um Wirtspräferenz (zB menschliche vs. Tierblut) durch Screening der Moskitoblutmehl für Host-spezifische DNA aufzuklären. Wir haben eine Mehrnachweisassay (MDA), die alle der oben genannten Assays zu einer Zeit verbindet, in einer einzigen Multiplex-Reaktion Genotypisierung 33SNPs für 96 oder 384 Proben entwickelt. Da die MDA umfasst mehrere Marker für Arten, Plasmodium Erkennung und Gastgeber Blut Identifikation, wird die Wahrscheinlichkeit der Erzeugung von falschen Positiven oder Negativen stark von vorherigen Tests, die nur eine Markierung pro Merkmal sind reduziert. Diese robusten und einfachen Test kann diese Schlüsselmoskito Eigenschaften kostengünstig und in einem Bruchteil der Zeit bestehender Assays.

Artbestimmung: Die folgenden 5 SNPs zusammen identifizieren drei Arten (A. arabiensis, A. coluzzii und A. gambiae) (Tabelle 4). Wenn eine Probe nicht einer der drei Arten, die drei SNPs (01.073-213, 04.679 bis 157 und 10.313 -052) nicht zu verstärken. kdr Genotyp zur Ableitung Insektizidresistenz: Die 1014 th Codon der para spannungsabhängigen Natriumk...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes at JoVE.com

Ein Mehrfachnachweistest für Malaria übertragende Mücken | Biologie | Video

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Ein Multi-Nachweistest für Malaria tragenden Mücken

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

a-multi-detection-assay-for-malaria-transmitting-mosquitoes

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Evolution

Speciation and Diversity

SCIENTISTS IN ACTION

13.0K Aufrufe.  School of Veterinary Medicine, University of California - Davis. Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Serie: A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

Injektion eines. stephensi Embryonen zu generieren Malaria-resistenter Moskitos

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Forschung

Biologie

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

Protokoll für Mosquito Aufzucht (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito.    This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed.  The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protokoll für Plasmodium falciparum-Infektionen in Mücken und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Population Replacement Strategies for Controlling Vector Populations and the Use of Wolbachia pipientis for Genetic Drive

In this video, Jason Rasgon discusses population replacement strategies to control vector-borne diseases such as malaria and dengue. "Population replacement" is the replacement of wild vector populations (that are competent to transmit pathogens) with those that are not competent to transmit pathogens. There are several theoretical strategies to accomplish this. One is to exploit the maternally-inherited symbiotic bacteria Wolbachia pipientis. Wolbachia is a widespread reproductive parasite that spreads in a selfish manner at the extent of its host's fitness. Jason Rasgon discusses, in detail, the basic biology of this bacterial symbiont and various ways to use it for control of vector-borne diseases.

In this interview, Jason Rasgon explains the concept of genetic drive and the characteristics of an effective gene drive system. The use of the endosymbiotic bacterium, Wolbachia pipientis, as a means to spread genes through mosquito populations, is hypothesized.

Bevölkerung Ersatz Strategies for Controlling Vector Bevölkerung und die Verwendung von Wolbachia pipientis für Genetische Laufwerk

In this video, Jason Rasgon discusses population replacement strategies to control vector-borne diseases such as malaria and dengue. "Population ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced, as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission. Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

Verhinderung der Ausbreitung von Malaria und Dengue-Fieber mit Hilfe gentechnisch veränderter Moskitos

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

Ein besseres Mosquito: Identifizierung der Gene aktivieren Malaria und Dengue-Fieber Widerstand in A. gambiae und A. aegypti Moskitos

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several genera of these whitefly-transmitted plant viruses (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, Torradovirus) include several hundred species of emerging and economically significant pathogens of important food and fiber crops (reviewed by9,10,16). These viruses do not replicate in their vector but nevertheless are moved readily from plant to plant by the adult whitefly by various means (reviewed by2,6,7,9,10,11,17). For most of these viruses whitefly feeding is required for acquisition and inoculation, while for others only probing is required. Many of these viruses are unable or cannot be easily transmitted by other means. Therefore maintenance of virus cultures, biological and molecular characterization (identification of host range and symptoms)3,13, ecology2,12, require that the viruses be transmitted to experimental hosts using the whitefly vector. In addition the development of new approaches to management, such as evaluation of new chemicals14 or compounds15, new cultural approaches1,4,19, or the selection and development of resistant cultivars7,8,18, requires the use of whiteflies for virus transmission. The use of whitefly transmission of plant viruses for the selection and development of resistant cultivars in breeding programs is particularly challenging7. Effective selection and screening for resistance employs large numbers of plants and there is a need for 100% of the plants to be inoculated in order to find the few genotypes which possess resistance genes. These studies use very large numbers of viruliferous whiteflies, often several times per year.
Whitefly maintenance described here can generate hundreds or thousands of adult whiteflies on plants each week, year round, without the contamination of other plant viruses. Plants free of both whiteflies and virus must be produced to introduce into the whitefly colony each week. Whitefly cultures must be kept free of whitefly pathogens, parasites, and parasitoids that can reduce whitefly populations and/or reduce the transmission efficiency of the virus. Colonies produced in the manner described can be quickly scaled to increase or decrease population numbers as needed, and can be adjusted to accommodate the feeding preferences of the whitefly based on the plant host of the virus.
There are two basic types of whitefly colonies that can be maintained: a nonviruliferous and a viruliferous whitefly colony. The nonviruliferous colony is composed of whiteflies reared on virus-free plants and allows the weekly availability of whiteflies which can be used to transmit viruses from different cultures. The viruliferous whitefly colony, composed of whiteflies reared on virus-infected plants, allows weekly availability of whiteflies which have acquired the virus thus omitting one step in the virus transmission process.

Improving our understanding of and our ability to manage many of the insect-transmitted plant viruses requires the use of the vector. Insect transmission of plant viruses is a tritrophic interaction, and as such requires the manipulation of insects, virus, and plant. Vectors must be reared in large numbers and manipulated in such a way as to insure high rates of transmission to test plants. The basics of rearing and manipulating the whitefly, Bemisa tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), a vector of plant viruses belonging to several emerging plant virus genera, representing a large number of economically significant viruses is presented.

Sendeanlage Viren Mit Weiße Fliegen

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making malaria control an omnipresent problem in tropical countries. The emergence of insecticide resistant populations warrants the exploration of novel drug target pathways and compounds for vector mosquito control. Epigenetic drugs are well established in cancer research, however not much is known about their effects on insects. This study provides a simple protocol for examining the toxicological effects of 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an experimental epigenetic drug for cancer therapy, on the malaria vector, Anopheles gambiae. A concentration-dependent increase in mortality and decrease in size was observed in immature mosquitoes exposed to DZNep, whereas the compound reduced the fecundity of adult mosquitoes relative to control treatments. In addition, there was a drug-dependent decrease in S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase activity in mosquitoes following exposure to DZNep relative to control treatments. These protocols provide the researcher with a simple, step-by-step procedure to assess multiple toxicological endpoints for an experimental drug and, in turn, demonstrate a unique multi-prong approach for exploring the toxicological effects of water-soluble epigenetic drugs or compounds of interest against vector mosquitoes and other insects.

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Toxikologische Tests zur Prüfung Auswirkungen eines Epigenetische Drug für Entwicklung, Fruchtbarkeit und Hinterbliebenen von Malariamücken

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

Methods Article

Ein Multi-Nachweistest für Malaria tragenden Mücken