Pool Design und Oligo Erholung <ol><li> Der erste Schritt ist, die pre-mRNA-Pool Design studiert werden. Dies kann mit Hilfe der UCSC Genome Browser und das Herunterladen bestimmter Gene, Spleißstellen oder anderen Bereichen von Interesse sein. </li><li> Sobald die Fenster von Interesse ausgewählt wurden, Fliesen über sie rechnerisch unter den folgenden Bedingungen: read Länge sollte 30 Nukleotiden mit einer 10 Nukleotid überlappen, so daß jeder Oligo ist 20 Nukleotide aus dem Stand eins verschoben werden. * Oligo überschneiden sollten in der Nähe Spleißstellen erhöht werden, um ausreichenden Versicherungsschutz zu sorgen; zunehmende Überlappung von 10 bis 20 Nukleotide können dies zu erreichen. </li><li> Flanke jedes 30-Nukleotid-Oligo mit Universal Primer-Sequenzen, mit denen in den Pool hinter verstärken wird. Tiled Oligo Aufträge sollten an Agilent, wo die Sequenzen auf einem benutzerdefinierten Oligonukleotid-Microarray gedruckt werden eingereicht werden. </li><li> Zur Wiederherstellung der DNA Oligos aus der Microarray-Oberfläche, indem Sie das Array Deckglas in einem Array Hybridisierung Kammer und sanft Pipettieren 500 &amp;mgr; l dH 2 O auf der Folie beginnen </li><li> Sandwich das Array auf der Oberseite des Deckels schieben und darauf achten, Luftblasen, die den Prozess stören können vermieden werden. Achten Sie darauf, um das Array Gesicht Platz nach unten, so dass die Seite mit den Oligos ist die Berührung der Oberfläche des Wassers. Eine gute Faustregel ist, &quot;Agilent Agilent berührt&quot; bedeutet, dass die Agilent-Label auf dem Array der Agilent-Label Gesichter auf dem Deckglas </li><li> Schließen Sie die Hybridisierung Kammer und drehen über Nacht bei 99 ° C in einem Hybridisierungsofen </li><li> Am folgenden Tag, entfernen Sie vorsichtig das Array aus der Kammer und ziehen Sie das Wasser, das nun die Oligos befreit von der Array-Oberfläche. Dies ist die Oligo-Pool </li><li> Setzen Sie den Pool in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und beschallen den Pool bei 50% Amplitude für 3-5 Sekunden-Takt </li><li> Next, verstärken den Pool von Low Cycle PCR, mit der Universal Primer mit einem T7-Tag am Ende angehängt. Für die erste Runde, denaturieren bei 94 ° C für 1 Minute bei 55 ° C tempern für 20 Sekunden, und längliche für 1 Minute bei 72 ° C. Für den folgenden Runden, do 10 Sekunden, 20 Sekunden und 10 Sekunden auf der jeweiligen Temperatur, mit einem letzten Elongationsschritt von 5 Minuten bei 72 ° C. Da die Anzahl der Zyklen notwendig, um den Pool zu verstärken, hängt von der Effizienz der Oligo Erholung, kann es notwendig sein, um mehrere Taktzahlen versuchen. Achten Sie darauf, nicht zu stark verstärken den Pool, die durch eine verschmierte Bande auf ein Acrylamid-Gel bezeichnet wird. PCR-Proben können bei 4 ° C gelagert werden, bis sie benötigt. </li><li> Der letzte Schritt in Oligo Vorbereitung ist, um RNA zu transkribieren über die MEGAshortscript ™ Kit von Ambion. * Das folgende Protokoll wurde von Ambion angepasst <ol class="lalpha"><li> Auftauen T7 10x Reaktionspuffer, vier Ribonukleotid Lösungen und Wasser bei Raumtemperatur unter Beibehaltung der T7-Enzym-Mix auf Eis </li><li> Montieren Sie die Reaktionsmischung in ein RNase-freies Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur. Komponenten der Reaktion Puffer kann Template-DNA zu fällen führen, wenn die Reaktion auf Eis vermischt wird. </li><li> In der folgenden Reihenfolge, Pipette 3 ul Nuklease-freies Wasser, 2 ul der 10x Reaktionspuffer, 2 &amp;mgr; l je 75 mM NTP-Lösung, 5 ul der Template-DNA (die PCR Oligo-Pool) und 2 ul T7-Enzym, für ein Endvolumen von 20 ul </li><li> Flick das Rohr vorsichtig, um die Reaktion dann kurz zentrifugieren der Mischung am Boden des Röhrchens zu sammeln mischen. </li><li> Inkubieren Sie die Reaktion in einem Thermocycler bei 37 ° C für 2 Stunden. Inkubationszeit werden Template-abhängigen, daher kann es erforderlich sein, um eine Zeit-Gänge-Experiment zu verwenden, um die optimale Inkubationszeit für maximale Ausbeute zu bestimmen </li><li> Nach 2 Stunden, entfernen Sie die Template-DNA durch Zugabe von 1 ul der Turbo DNase, um die Reaktion und bei 37 ° C für weitere 15 Minuten </li><li> Beenden Sie die Reaktion und Wiederherstellung der RNA durch Phenol / Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung. <ol class="lalpha"><li> Für einen 20 ul Reaktionsvolumen, fügen Sie 115 ul von dH 2 O und 15 ul 3 M Natriumacetat, um die Reaktion. </li><li> Gründlich mischen fügen Sie dann 75 ul saurem Phenol und 75 ul Chloroform. Mischen Sie die Lösung durch Vortexen, dann Mikrozentrifuge für eine Minute bei 13.000 rpm bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen und die Extraktion </li><li> Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen und fügen 150 ul Chloroform. Vortex die Mischung und Zentrifuge wie zuvor. Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen. </li></ol></li><li> Recover die RNA durch Zugabe von zwei Volumen 100% kaltem Ethanol zur wässrigen Schicht und gut mischen. Gefühlt die Mischung für mindestens 15 Minuten bei -20 ° C dann bei 4 ° C zentrifugieren für 15 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zu Pellets der RNA. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 105 ul von 0,1 x Tris-EDTA (TE) Buffer .. </li></ol></li><li> Es ist schwierig, alle freien Nukleotiden aus der T7 Kit Reaktion zu entfernen, so dass für die genauesten Ergebnisse, Quantifizierung der RNA mit RiboGreen. <ol class="lalpha"><li> Zu Beginn der Quantifizierung zunächst verdünnt genug 1x TE, 2.300 ul + 50μL/sample. </li><li> Als nächstes machen RiboGreen. Sie wird 1000 müssen ul + 50 ul / Probe. Für eine hohe Reichweite Proben (1 pg / ml bis 20 ng / mL) mischen RiboGreen 1:200 in 1x TE, für den niedrigen Bereich Proben (50 ng / ml bis 1 ng / ml) mischen RiboGreen 1:2000 mit 1x TE ; Je 50 ul der RiboGreen Lösung in jede Vertiefung eine undurchsichtige Platte, beginnend mit A1 und nach unten bewegen, nicht über </li><li> Verdünnen Sie eine RNA-Stammlösung zu 2 pg / mL für hohe Reichweite Proben oder 100 ng / ul für niedrige Bandbreite Proben </li><li> Mit der Stammlösungen, erstellen Sie eine Standard-Kurve von sechs nachfolgenden 01.02 Verdünnungen der ursprünglichen 2 pg / mL bzw. 100 ng / mL Lager Pipette 240 &amp;mgr; l der Brühe in eine PCR-Streifen-Rohr. In den verbleibenden 7 Röhren, Pipette 120 ul 1x TE. Nehmen Sie 120 ul aus der RNA Lager gut verrühren und mit Rohr 2. Nehmen Sie 120 ul von Rohr 2 und mischen sich mit Rohr 3. Wiederholen, bis das Rohr 7. Rohr 8 wird nur TE und wird Ihre blank sein. Je 50 ul der Standardkurve-Lösungen in die undurchsichtige Platte, A1: H2 (run die Kurve zweimal) </li><li> In ein neues Rohr, Mix 45 ul TE mit 5 ul der Oligo-Pool und fügen Sie alle 50 ul einer gut, dass 50 ul RiboGreen enthält. </li><li> Mit einem Platten-Lesegerät das Gerät so einstellen las-Fluoreszenz von der Spitze nach einer Minute mischen sich mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und Emissionswellenlänge von 530 nm und lesen Sie die Platte </li><li> Verwenden Sie die Standardkurve generiert, um das gewonnene RNA zu quantifizieren, die bei -20 ° C aufbewahrt werden sollte </li></ol></li></ol> Co-Immunpräzipitation der Oligo-Pool mit einer RNP von Interesse <ol><li> Vor Beginn der Co-Immunopräzipitation, bereiten die Protein A und Protein G Dynabeads von Invitrogen, indem man sie in einem Verhältnis von 1:1 bis zu einem Endvolumen von 50 ul pro Reaktion. Zum Beispiel für zwei Reaktionen würden Sie mit 50 ul jeder einzelnen Perle. </li><li> Verwenden Sie einen Magnetic Separation Stehen wie dieses von Novagen, um die Perlen in Position zu halten, während Sie den Überstand zu entfernen und waschen Sie die Perlen zweimal mit dem gleichen Volumen kalten 1x PBS </li><li> Nach dem zweiten Waschen, resuspendieren die Kügelchen in einem gleichen Volumen kalten 1x PBS und mit 2 ng des Antikörpers pro Reaktion. Dieser Betrag kann je nach den Antikörper, so Experimente notwendig, um die optimalen Bedingungen zu finden. </li><li> Inkubieren der Antikörper / Perlen Mischung über Nacht bei 4 ° C auf einer rotierenden Plattform </li><li> Am Morgen, fügen Sie 2 g pro Reaktion beschallt Hefe-Gesamt-RNA, um unspezifische Bindung zu blockieren, und drehen Sie für weitere 30 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Mit dem magnetischen Rack an die Perlen zu halten, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Perlen zweimal mit kaltem 1x PBS, so dass die PBS aus dem zweiten Waschen in die Röhre. </li><li> Nehmen Sie neue Rohre, eine für jede Reaktion und aliquote 50 ul der Raupe Mischung in jedes Röhrchen. Lassen Sie die Kugeln sitzen, während der Vorbereitung einen Master-Mix </li><li> Für jede Reaktion mit 200 ng des Oligo-Pool, einem äquimolaren Verhältnis von Primern, 2 ug beschallt Hefe-Gesamt-RNA, 20 uL HeLa Kernextrakt (dies ist die RNP-Quelle) und Puffer E, um die Lautstärke zu bringen bis zu 120 ul. Der Schutz Primer sind RNA-Versionen der universellen Primern. Auftrag Transkription Vorlagen der Universal-Primer mit einem T7-Tag am Ende angehängt, dann transkribieren RNA aus den Vorlagen mit dem MEGAshortscript ™ Kit. </li><li> Entfernen Sie den Überstand von der Perle Aliquots und resuspendieren Perlen in 120 ul des Master-Mix. Rock the Reaktionen bei 4 ° C für 1-2 Stunden. </li><li> Nach der Inkubation für jede Reaktion, entfernen Sie ein kleines Aliquot (einschließlich der Perlen) für eine &quot;totale&quot; RNA-Proben </li><li> Platzieren Sie den Rest der Reaktionen auf die magnetische Trennung stehen und entfernen Sie den Überstand. Es ist zwar nicht notwendig, diese Flow-Through-Probe Downstream zu analysieren, kann es nützlich sein, um zu sparen. </li><li> Waschen Sie die Kugeln 1-2 mal mit 50 ul kaltem 1x PBS. Die RNA gebunden an den Antikörper auf den Kügelchen ist die &quot;IP&quot;-Probe. </li><li> Resuspendieren &quot;total&quot; und der &quot;IP&quot; Perlen in 50 ul 1% SDS in 0,1 x TE-Puffer und Wärme die Proben bei 65 ° C für 15 Minuten, um die RNA zu eluieren. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, der jetzt enthält die RNA, die zuvor an die Kügelchen gebunden war und sauber durch Phenol / Chloroform-Extraktion durch eine Ethanolfällung folgte. Trocknen Sie die Pellet resuspendieren und in 50 ul 0,1 x TE-Puffer. </li></ol> Reverse Transkription und Amplifikation von Co-IP-Proben in Vorbereitung für aminoallyl Kennzeichnung <ol><li> Als nächstes muss der RNA-Proben werden revers transkribiert und mittels PCR amplifiziert. Für die Reaktion der reversen Transkription, verwenden Sie die reverse universelle Primer. </li><li> Für jede Probe durch Mischen 1 ul beginnenumgekehrt universelle Primer, mit 1 ul der Template-RNA (aus der Immunpräzipitation Reaktion) und 10 ul dH 2 O. Erhitzen Sie die Reaktionen bei 70 ° C für 5 Minuten auf Eis kühlen oder halten bei 4 ° C. </li><li> Während die Proben kühl, die folgenden Master-Mix. Für jede Reaktion kombinieren 4 ul 10 mM dNTPs, 2 ul 10x Arrayscript Puffer, 1 ul RNase-Inhibitor und 1 ul reverse Transkription Enzym. Gründlich mischen und fügen 8 &amp;mgr; l des Master-Mix für jede Reaktion der reversen Transkription. </li><li> Verwenden Sie eine PCR-Maschine, die Proben bei 42 ° C inkubieren für 2 Stunden, gefolgt von 95 ° C für 5 Minuten, dann 4 ° C, bis die Proben sind für eine Verstärkung benötigt. </li><li> Nach reverse Transkription der RNA-Proben, verstärken PCR sie mit dem Universal-Primer, mit einer der Primer mit einem T7-Tag. Die Anzahl der Zyklen erforderlich, um den Pool verstärken wird auf die Effizienz der Zusammenarbeit IP hängen so kann es notwendig sein, um mehrere Zyklen zu versuchen. Jede Reaktion erfordert 5 ul 10x Taq Reaktionspuffer, 0,2 ul von jedem Primer (100 mM), 1 ul der cDNA-Template (aus der Reaktion der reversen Transkription), 1 ul 10 mM dNTPs, 42,2 ul dH 2 O, und 0,4 ul der Taq-Enzym. Beginnen Sie mit der PCR durch Inkubation der Proben bei 94 ° C für 3 Minuten. Als nächstes für jeden Zyklus, Denaturierung bei 94 ° C für 45 Sekunden, bei 55 ° C tempern für 30 Sekunden, und längliche bei 72 ° C für 1 Minute, mit einer abschließenden Elongation bei 72 ° C für 10 Minuten. </li><li> Als nächstes transkribieren die Proben erneut mit dem MEGAshortscript ™ Kit jedoch, fügen Sie diese Zeit 2 ul der aminoallyl UTP, anstelle des T7 UTP. Die aminoallyl UTP wird verwendet, um die RNA mit dem Cy-Farbstoffe zu kennzeichnen. </li><li> Phenol / Chloroform und Ethanol Fällung der Proben. Verwenden Sie KEINE Glycoblue oder Ammoniumacetat, können beide mit Hybridisierung der Proben auf das Array stören. Trocknen Sie die Pellet resuspendieren und in 4,5 &amp;mgr; l 0,1 M Natriumcarbonat. </li></ol> Amino-allyl Markierung von RNA mit Cy Dyes <ol><li> Zu Beginn der Kennzeichnung Protokoll löst jede der Fluoreszenzfarbstoffe, Cy3 und Cy5, in 45 ul DMSO. Um zu vermeiden, Licht, wickeln Sie die Rohre in Alu-Folie und bei -20 ° C im Dunkeln </li><li> Add 2,5 ul Nuklease-freies Wasser, um Proben RNA und gründlich mischen </li><li> Als Nächstes fügen Sie 3 ul der Cy3 die &quot;total&quot;-Probe, und 3 ul Cy5 die &quot;IP&quot;-Probe. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln für 1 Stunde bei Raumtemperatur; Die Cy-3 Probe wird rot oder rosa, während die Cy-5 wird blau. </li><li> Zur Beendigung der Reaktion, man 6 ul 4 M Hydroxylamin-HCl zu jeder Probe, mischen und Spin kurz. Inkubieren für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Purify der markierten Proben durch Phenol / Chloroform-Extraktion durch Ethanolfällung und Pellet in 50 ul 0,1 x TE gefolgt </li></ol> Hybridisieren Proben, die Microarray mit dem Agilent Array Hybridisierung Kit <ol><li> Beginnen Sie mit der Hybridisierung durch vorsichtiges Mischen 50 ul 10x Blockierungspuffer, 140 ul von Nuklease-freiem H2 O, 25 ul der Cy3-markierten &quot;total&quot; Pool, 25 ul der Cy5-markierten &quot;IP&quot;-Pool, 10 ul der 25x Fragmentierung Puffer und 250 ul der 2x Hybridisierungspuffer, wobei darauf zu achten Einführung Blasen. Microfuge die Probe kurz auf die Lösung in den Boden des Röhrchens zu sammeln und zu Blasen zu reduzieren. </li><li> Setzen Sie den O-Ring Deckglas in der Hybridisierung Kammer und sorgfältig Pipette die Lösung auf die Folie. </li><li> Legen Sie die Erkennung Array auf dem Deckglas zu &quot;Sandwich&quot;-Lösung. Denken Sie daran zu orientieren Array schieben, so dass die Agilent-Label auf dem Array steht die Agilent-Label auf dem Cover schieben. </li><li> Spannen Sie die Folie / array Sandwich in der Hybridisierung Kammer und drehen bei 50 ° C für 3 Stunden. </li><li> Während die Array rotiert, nehmen Sie die folgenden 50 mL Lösungen in 50-ml konische Röhrchen: eine konische gefüllt mit 50 ml dH 2 O, zwei 1x SCC Pufferlösungen, jeweils in einem separaten Röhrchen und ein 2x SCC-Puffer. </li><li> Nach der dreistündigen Inkubation sorgfältig ausspannen Array / Dia-Sandwich und legen Sie es in der 50 ml-Erlenmeyerkolben mit den 2x SCC-Puffer. Mit einer Pinzette vorsichtig trennen das Array aus dem Deckel schieben und ziehen Sie den Deckel schieben. Achten Sie darauf, das Array als die Folie herausgezogen berühren. Schließen Sie die konische und schonend für 60 Sekunden umdrehen. </li><li> Mit der Pinzette, übertragen Sie die Array auf die 1x SCC-Lösung, Kappe der Röhre, und sanft für 1 Minute dann invertieren Transfer des Arrays auf den zweiten 1x SCC-Lösung und wieder sanft für eine weitere Minute umzukehren. </li><li> Schließlich übertragen das Array in die Röhre dH 2 O und schonend für 30 Sekunden umdrehen. </li><li> Dry das Array, indem die Ränder der Folie auf einem Kimwipe. Fahren Sie mit dem Array auf drehen Sie das Tuch und achten Sie darauf nicht stören die Seite mit den Oligos. </li><li> Setzen Sie den trockenen Array inein leeres 50-ml konischen Rohr-und Scan mit einem Microarray-Scanner </li></ol> Die Interpretation der Microarray <ol><li> Die Microarray-Scanner wird ein TIF-Bild des Arrays. Führen Sie dieses Image durch die Agilent Feature Extraction Software, mit der Grid-Datei (im Lieferumfang von Agilent), die einzigartig auf Ihre speziellen Pool ist. </li><li> Die Agilent-Software wird das Signal an jedes Feature zu interpretieren, um eine Datei, die mit einem Perl-Skript analysiert wird erstellt. Das Signal an die einzelnen Funktionen, um die gesamte Intensität bei diesem Kanal zu normalisieren. Zum Beispiel bei einer bestimmten Funktion in den grünen Kanal, ist die Intensität der grünen Kanal für die einzelnen Leistungsstufen durch die gesamte Intensität des grünen Kanals über alle Funktionen unterteilt. Die endgültige Ausgabe wird das Protokoll Verhältnis der Rot-Kanal über den grünen Kanal in jede Funktion auf dem Array. </li><li> Die Oligo-Pool-Daten aus der Microarray kann wieder auf das Genom re-mapped sich ein Bild von dem zu bekommen, und wie stark, wird die gebundene RNP von Interesse. </li></ol> Abbildung 1. Experimentelle schematische <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1a.jpg" alt="Abbildung 1a" /> A. Kachelschemas. Nach Auswahl und Download pre-mRNA-Sequenzen von Interesse, ist die Auswahl Bereich durch in 30 Nukleotid-Fenster, die Verschiebung in 10 Nukleotid-Schritten gefliest. Universal-Primer-Bindungsstellen Flanke jeder Seite des Fensters. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1b.jpg" alt="Abbildung 1b" /> B. Synthese Array. Tiled Oligo Aufträge sollten an Agilent, wo die Sequenzen auf einem benutzerdefinierten Oligonukleotid-Microarray gedruckt werden eingereicht werden. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1c.jpg" alt="Abbildung 1c" /> C. Co-Immunpräzipitation. Nach dem Kochen die Oligos aus dem Array, inkubieren in HeLa Kernextrakt, fügen Sie dann den Extrakt auf magnetische Kügelchen, die mit einem Antikörper gegen das RNP von Interesse bereit sind. Beschriften Sie die Start-Oligo-Pool mit Cy3 und die gebundene IP-Pool mit Cy5 und gelten für den Nachweis Array und scannen. Abbildung 2. Anmerkungen des Genoms mit und Analyse von Daten Bereicherung. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> A. Konvertieren Sie die durchschnittliche Punktzahl bei jedem genomische Koordinate aus der Array-Daten zur Basis-ten anmelden und Karte, die Gäste zu den angegebenen Koordinaten. Eine Darstellung dieser Mittelung Schritt ist für 3 überlappenden 30-nt Oligos mit Noten von 2, 4 und 0,5, wo die durchschnittliche Anreicherung Punktzahl für jede 10-nt-Fenster oben graphisch gegeben. Die ausgewählten genomischen Regionen wird über einen benutzerdefinierten Track in der USCS Genome Browser. Das Beispiel Browser-Fenster gegeben ist in der CLTA Gen, wo Gen-Funktionen (Exons / Introns / alternative Spleißen etc.) entlang der unteren und mittleren log Bereicherung Partituren aus dem PTB-gebundenen Oligos gegeben sind, werden durch dunkle rote senkrechte Balken dargestellt. PTB stark bindet kurz vor Exon 2 in der Polypyrimidintrakt.

Wenn Sie dieses Verfahren ihr wichtig, dass die Schöpfung des Pools erinnere, ist flexibel und offen für Veränderungen entweder an der RNA-oder Protein-Ebene. Bei der RNA-Ebene orthologen Regionen, Krankheit Mutationen, Polymorphismen oder Mutationen können in der Oligonukleotid-Sequenz eingeführt werden. Bei der Protein-Ebene der RNA-Bindung Faktor kann durch Phosphorylierung oder andere post-translationale Modifikationen verändert werden. Darüber hinaus kann die Bindung Umfeld manipuliert werden, um entweder er...

a rapid high-throughput method for mapping ribonucleoproteins (rnps) on human pre-mrna

Sequencing RNAs, dass die Zusammenarbeit Immunopräzipitat (Co-IP) mit RNA-bindende Proteine ​​hat unser Verständnis von Spleißen durch den Nachweis, dass die Bindung Standort erhöht oft Einflüsse Funktion eines Spleißfaktor. Doch wie bei jeder Strategie der Probenahme ist die Chance, eines RNA gebunden an eine Spleißfaktor ist proportional zu seiner zellulären Hülle und Fülle. Wir haben ein neues in vitro-Ansatz für die Vermessung Bindungsspezifität auf sonst vorübergehende pre-mRNA entwickelt. Dieser Ansatz nutzt eine speziell Oligonukleotid-Pool, Fliesen in Introns, Exons, Spleißstellen oder anderen pre-mRNA. Der Pool ist eine Art molekulare Selektion unterzogen. Hier zeigen wir die Methode durch die Trennung der Oligonukleotid in einen gebundenen und ungebundenen Fraktion und nutzen zwei Farb-Array-Strategie, um die Anreicherung von jedem Oligonukleotid in der gebundenen Fraktion aufzunehmen. Die Array-Daten erzeugt hochauflösende Karten mit der Fähigkeit zu identifizieren Sequenz-spezifische und strukturelle Bestimmtheiten der ribonucleoprotein (RNP) verbindlich pre-mRNA. Ein einzigartiger Vorteil dieses Verfahrens liegt in seiner Fähigkeit, die Probenahme Ausrichtung auf mRNA mit aktuellen IP und SELEX Techniken verbunden zu vermeiden, da der Pool speziell entwickelt wurde, und von prä-mRNA-Sequenz synthetisiert. Die Flexibilität der Oligonukleotid-Pool ist ein weiterer Vorteil, da der Experimentator wählt, welche Regionen zu studieren und Fliesen auf, Schneiderei am Pool auf ihre individuellen Bedürfnisse. Mit dieser Technik kann man Assay die Auswirkungen von Polymorphismen oder Mutationen auf die Bindung im großen Maßstab oder Klon der Bibliothek in einen funktionalen Spleißen Reporter und identifizieren Oligonukleotide, sind im Lieferumfang enthalten Fraktion angereichert. Dieser Roman in vitro hochauflösenden Kartierung Programm bietet die einzigartige Möglichkeit, RNP Interaktionen mit transienten pre-mRNA-Spezies, deren geringer Menge macht es schwer, sich mit aktuellen In-vivo-Techniken zu studieren.

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A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Durch die vorübergehende Natur der pre-mRNA, kann es schwierig sein zu isolieren und zu studieren<em&gt; In vivo</em&gt;. Hier präsentieren wir eine neuartige<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ansatz zur RNA-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines synthetischen Oligo-Pool zu untersuchen, die Fliesen in ausgewählten Regionen der pre-mRNA.

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

a-rapid-high-throughput-method-for-mapping-ribonucleoproteins-rnps-on

Research

JoVE Journal

Biology

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

11.7K Aufrufe.  Brown University. Durch die vorübergehende Natur der pre-mRNA, kann es schwierig sein zu isolieren und zu studieren In vivo. Hier präsentieren wir eine neuartige In-vitro- Ansatz zur RNA-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines synthetischen Oligo-Pool zu untersuchen, die Fliesen in ausgewählten Regionen der pre-mRNA.

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine (RNPs) on Human pre-mRNA