Wir haben die zuvor veröffentlichte RiboTag-Methode verbessert, um den Hintergrund deutlich zu reduzieren. Dies macht die Anwendung auf komplexe Modelle wie ein mutiertes System aus Analysesicht einfacher und viel kostengünstiger. Abgesehen von der experimentellen Tiererzeugung ist die RiboTag-Methode wesentlich einfacher und einfacher als andere Methoden zur Analyse ribosomassoziierter mRNAs.
Wie alle RNA-Experimente sind strenge RNase-freie Bedingungen von grundlegender Bedeutung für den Erfolg. Wenn Sie nur begrenzte Erfahrung mit RNA haben, überprüfen Sie Ihre Bedingungen, indem Sie zuerst eine grundlegende RNA-Extraktion durchführen und dann fortfahren. Die Beweisfür das Verfahren wird Lauren Chukrallah, eine Studentin aus meinem Labor.
Zur Herstellung des Homogenisierungspuffers 2,5 Milliliter eines Molarentris bei pH 7,4, fünf Milliliter eines Molkaliumchlorids, 600 Mikroliter eines molaren Magnesiumchlorids und 500 Mikroliter MP40 zu einem 50-Milliliter-Rohr hinzufügen. Fügen Sie diethylpyrocarbonat-behandeltes Wasser in das Rohr, um das Volumen auf 50 Milliliter zu bringen und mischen, bis alle Komponenten eingebaut sind. Um einen salzreichen Waschpuffer zuzubereiten, fügen Sie 2,5 Milliliter eines Molarentris bei pH 7,4, 15 Milliliter eines Molkaliumchlorids, 600 Mikroliter eines Mol-Magnesiumchlorids und 500 Mikroliter MP40 in ein 50-Milliliter-Rohr ein.
Bringen Sie es auf das Volumen von 50 Milliliter in diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser und mischen, bis alle Komponenten eingebaut sind. Alle Probenröhrchen vorwiegen, das Gewicht aufzeichnen und in flüssigem Stickstoff vorkühlen. Sterilmörtel, Stößel und Wiegeauf auf Trockeneis vorkühlen.
Dann auf Trockeneis, verwenden Sie die vorgekühlten sterilen Mörtel und Stößel, um Flash gefrorene Gewebeproben in große Stücke zu brechen und mahlen Sie es langsam in ein feines Pulver. Mit dem vorgekühlten Spachtel das Pulver aus dem Mörtel in ein vorgekühltes Sammelrohr kratzen, um möglichst auf Trockeneis zu bleiben. Wiegen Sie das Rohr mit dem Gewebepulver.
Berechnen Sie die Masse des Gewebes, indem Sie das Anfangsgewicht des Rohres vom Gewicht des Rohres mit der darin folgenden Probe subtrahieren. Zeichnen Sie diesen Wert für die spätere Berechnung von Lysepuffervolumes auf. Bereiten Sie Lysepuffer durch Zugabe von 10 Milliliter homogenisierungspuffer Dithiothreitol, RNase-Hemmer, Cycloheximid, Heparin, und eine Protease-Hemmer-Tablette.
Mischen, bis alle Komponenten eingebaut sind und bis zum Gebrauch auf Eis bleiben. Fügen Sie pro 100 Milligramm Probe einen Milliliter Lysepuffer hinzu. Mit der gleichen Pipette verwendet, um die Lyse Puffer hinzufügen, sorgfältig Pipette die resultierende Lysat nach oben und unten, um die Zellen zu fragmentieren und mischen.
Führen Sie die Pipettierung für in der Regel 25 bis 30 Striche fort, bis die Probe nicht mehr zähflüssig ist. Stellen Sie die Proben für 10 Minuten auf Eis, um zu lysieren. Dann drehen Sie die Proben in einer vorgekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 10.000 mal g.
An der Unterseite der Röhre bildet sich ein großes loses, trübes Pellet. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören, sammeln Sie das Lysat in ein neues Rohr und zeichnen Sie das Volumen für jede Probe auf. Um eine Verschlechterung der Proben zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Proben während des verbleibenden Protokolls auf Eis oder bei vier Grad Celsius kühl bleiben, wann immer dies möglich ist.
Berechnen Sie nun das erforderliche Volumen der magnetischen Perlen gekoppelt mit dem entsprechenden Antikörper-Bindungsprotein, Protein G.Für einen Milliliter Lysat, verwenden Sie 375 Mikroliter Protein G Perlen, um 30 Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Legen Sie die Perlenlösung in ein 1,7 Milliliter-Rohr auf einem magnetischen Rohrträger. Entfernen Sie das Perlenlösungsmittel und fügen Sie den Perlen ein gleiches Volumen an frischem Lysepuffer hinzu.
Auf einem Tischrohr Rotator eingestellt auf 20 U/Minbei bei vier Grad Celsius, drehen Sie das Rohr fünf Minuten zu waschen. Legen Sie das Rohr auf das magnetische Rohrgestell und entfernen Sie den Waschpuffer. Nachdem Sie die Wäsche zwei weitere Male wiederholt haben, fügen Sie den Lysepuffer auf dem ursprünglichen Volumen hinzu, um die Perlen auszueinemt.
Bei vier Grad Celsius oder auf Eis bis zum Gebrauch aufbewahren. 50 Mikroliter der ausgezählten Perlen für jeden Milliliter Lysat hinzufügen und eine Stunde lang bei vier Grad Celsius rotieren. Legen Sie dann das Rohr auf das Magnetgestell und sammeln Sie das Lysat in ein frisches Rohr.
Entsorgen Sie die verwendeten Perlen. Zum Lysat 25 Mikroliter der ausgezählten Perlen für jeden Milliliter hinzufügen und eine Stunde lang bei vier Grad Celsius rotieren. Lagern Sie das verbleibende gleichgewichte Protein G Perlen bei vier Grad Celsius über Nacht.
Am Morgen das Rohr auf das Magnetgestell legen und das Lysat in ein frisches Rohr sammeln. Entsorgen Sie die verwendeten Perlen. Vom gerodeten Lysat 50 Mikroliter als Probeneingangssteuerung aufbewahren.
Bei minus 80 Grad Celsius lagern. Fügen Sie für jeden Milliliter des gereinigten Lysats fünf Mikrogramm Anti-HA-Antikörper hinzu. Um Probenverlust zu vermeiden, versiegeln Sie die Rohrkappe mit Laborfolie und drehen Sie die Proben 16 bis 18 Stunden bei vier Grad Celsius.
Pro milliliter des gereinigten Lysats 300 Mikroliter Protein G Perlen hinzufügen. Die Rohrkappe mit Laborfolie wieder versiegeln und zwei Stunden bei vier Grad Celsius drehen. Legen Sie das Probenrohr auf das Magnetgestell, damit sich die Perlen vom IPed-Lysat trennen können.
Pipette aus fließenden Lysat und entsorgen, die Perlen zu halten. 800 Mikroliter Hochsalz-Waschpuffer zu den Perlen geben. Legen Sie das Rohr auf einen Rotator für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Legen Sie das Probenrohr auf das Magnetgestell und lassen Sie die Perlen von der Wäsche trennen. Entfernen und entsorgen Sie die Wäsche. Fügen Sie weitere 800 Mikroliter Hochsalz-Waschpuffer zu den Perlen hinzu.
Schließen Sie das Rohr und lassen Sie es für fünf Minuten bei vier Grad Celsius drehen. Legen Sie das Probenrohr auf das Magnetgestell und lassen Sie die Perlen von der Wäsche trennen. Entfernen und entsorgen Sie die Wäsche.
Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal. Nach dem Waschen 3,5 Mikroliter 14,2 Molaren-Beta-Mercaptoethanol in die Perlen geben und 15 Sekunden lang mischen. Extrahieren Sie RNA mit einem kommerziellen RNA-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Die Probe in 30 Mikroliter RNase-freiem Wasser zu entgießen. Bewahren Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius auf. In dieser Studie wurde sehr wenig RNA aus den Proben isoliert, denen entweder Cre oder Rpl22HA fehlte, die die Wirksamkeit dieses Protokolls demonstrierten, um den IP-Hintergrund zu reduzieren und echte HA-markierte ribosomale RNAs zu isolieren.
Eine Reihe von Antikörpern in RNA-Isolationsprotokollen wurden in Cre- und Rpl22HA-positiven Proben getestet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Reagenzienauswahl einen erheblichen Einfluss auf die IP-Effizienz haben kann. Die Wirksamkeit des RiboTag-Systems zur Isolierung ribosomassoziierter RNA wurde untersucht.
Sowohl bei Wildtyp-Eingangs- als auch bei IP-Genotypen war die Eingangskonzentration signifikant höher als die IP-Konzentration, was darauf hindeutet, dass mehr RNA in der Eingangsstichprobe vorhanden war. In den gesamten RNA-Pools wurden RNA-Integritätsnummernwerte nahe 10 erwartet, wobei eine höhere RIN mit einer höheren abgeleiteten Probenintegrität und -qualität korreliert. Während die IP-Proben niedrigere RIN-Proben als die Eingänge aufwiesen, befanden sich die RINs noch in einem akzeptablen Bereich und waren nicht vom Probengenotyp abhängig.
Abgesehen von der Züchtung und Aufrechterhaltung der rNase freien Bedingungen, Forscher sollten sicherstellen, dass sie sammeln und halten jede vorgeschlagene Probe. Insbesondere die Eingangs-RNA ist für mehrere Arten von nachgeschalteten Analysen von entscheidender Bedeutung. Für unser Labor führen wir in der Regel eine RNA-Sequenzierung nach Immunpräzipitation durch.
Dies ermöglicht es uns, die gesamte Transkriptkuppel auf Ribosom-Assoziation abzufragen. Alternativen wären Mikroarray-Analysen oder quantitative RT-PCR. Für uns ermöglicht uns dieses System, Veränderungen in ribosome-assoziierten RNAs mit Mutation bestimmter RNA-bindender Proteine zu identifizieren.
