Die Autoren danken allen Mitgliedern der Ule, Luscombe und Zupan Labors für die Diskussion und experimentelle Mitarbeit. Wir danken James Hadfield und Nik Matthews für Hochdurchsatz-Sequenzierung. Wir möchten darauf hinweisen, dass der iClip hier beschriebene Verfahren teilt mehrere Schritte mit dem Original-CLIP-Protokoll von Kirk Jensen und JU im Labor von Robert Darnell entwickelt. Diese Arbeit wurde von der European Research Council gewähren 206726-CLIP zur JU und eine langfristige Human Frontiers Science Program Stipendium für JK unterstützt

1. UV-Vernetzung von Gewebekulturzellen <ol><li> Entfernen Sie die Medien und 6 ml eiskaltem PBS, um Zellen in einer 10 cm Platte (reicht für drei Versuchen) gewachsen. </li><li> Entfernen Sie den Deckel und auf Eis stellen. Bestrahlen einmal mit 150 mJ / cm 2 bei 254 nm. </li><li> Ernten Sie die Zellen, die durch Kratzen mit einem Zell-Lifter. </li><li> Transfer 2 ml Zellsuspension jeweils drei Röhrchen. Spin bei Höchstgeschwindigkeit für 10 sec bei 4 ° C zu Pellet-Zellen, dann entfernen Überstand. </li><li> Snap-freeze die Zellpellets auf Trockeneis und bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Bead Vorbereitung <ol><li> 100 l Protein A Dynabeads (Dynal, 100,02) pro Experiment zu einem frischen Mikroröhrchen (Use Protein G Dynabeads für eine Maus oder Ziege-Antikörper). </li><li> Wash Perlen 2x mit Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdeoxycholat; 1 / 100 Protease-Inhibitor-Cocktail III, Calbiochem). </li><li> Resuspendieren Perlen in 100 ul Lysepuffer mit 2-10 pg Antikörper. </li><li> Drehen Röhrchen bei Raumtemperatur für 30-60 min. </li><li> Waschen mit 900 ul Lysepuffer 3x und verlassen in der letzten Waschung bis bereit, um fortzufahren auf 4,1 Schritt. </li></ol> 3. Zelllyse und partielle RNA Verdauung <ol><li> Zellpellet in 1 ml Lysepuffer und Transfer bis 1,5 ml Röhrchen. </li><li> Bereiten Sie eine 1 / 500 Verdünnung von RNase I (Ambion, AM2295). Fügen Sie 10 ul RNase I Verdünnung sowie 2 ul Turbo DNase dem Zelllysat (1 / 500 RNase I Verdünnungen [low RNase] sind für die Bibliothek der Zubereitung verwendet, 1 / 50 Verdünnungen [high RNase] notwendig sind, um für die Antikörper-Spezifität control) . </li><li> Inkubieren Sie die Proben für exakt 3 min bei 37 ° C, Schütteln bei 1.100 Umdrehungen pro Minute. Sofort auf Eis zu übertragen. </li><li> Spin bei 4 ° C und 22.000 g für 20 min zum Lysat klar. Vorsichtig den Überstand (leave etwa 50 ul Lysat mit dem Pellet). </li></ol> 4. Immunpräzipitation <ol><li> Entfernen Sie den Waschpuffer aus den Perlen (aus Schritt 2,5), dann fügen Sie das Zelllysat (aus Schritt 3.4). </li><li> Drehen Sie die Proben für 2 h bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und waschen Sie die Perlen 2x mit 900 ul High-Salz-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdeoxycholat). </li><li> Wash 2x mit 900 ul Waschpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl 2, 0,2% Tween-20). </li></ol> 5. Dephosphorylierung von RNA 3&#39;-Enden <ol><li> Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Kügelchen in 20 ul PNK-Mix (15 ul Wasser, 4 ul 5x PNK pH 6,5-Puffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0,5 ul PNK Enzym, 0,5 ul RNasin [Promega]). </li><li> Inkubieren für 20 min bei 37 ° C. </li><li> Add 500 ul Waschpuffer waschen 1x mit Hochsalzpuffer. </li><li> Wash 2x mit Waschpuffer. </li></ol> 6. Linkerligation bis 3 &#39;Enden RNA <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen in 20 ul Ligationsgemisch (9 ul Wasser, 4 ul 4x Ligationspuffer [200 mM Tris-HCl, 40 MM GCL 2; 40 mM Dithiothreitol], 1 ul RNA-Ligase [NEB]; 0,5 ul RNasin [Promega]; 1,5 ul pre-adenylierte Linker L3 [20 uM]; 4 ul PEG400 [81170, Sigma]). </li><li> Inkubieren über Nacht bei 16 ° C. </li><li> Add 500 ul Waschpuffer und dann waschen mit 1 ml Hochsalzpuffer 2x. </li><li> Wash 2x mit 1 ml Waschpuffer und in 1 ml der zweiten waschen zu lassen. </li></ol> 7. RNA 5 &#39;Ende Kennzeichnung <ol><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Perlen in 8 ul heißen PNK-Mix (0,4 ul PNK [NEB], 0,8 ul 32 P-γ-ATP, 0,8 ul 10x PNK-Puffer [NEB]; 6 ul Wasser). </li><li> Inkubieren für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die heißen PNK-Mix und resuspendieren die Perlen in 20 ul 1x NuPAGE Ladepuffer (Invitrogen). </li><li> Inkubieren auf einem Thermomixer bei 70 ° C für 10 min. </li><li> Unmittelbar auf einem Magneten Ort, um Niederschlag der leeren Perlen und Last der Überstand auf das Gel (siehe Schritt 8). </li></ol> 8. SDS-PAGE und Membran übertragen <ol><li> Laden Sie die Proben auf einem 4-12% NuPAGE Bis-Tris-Gel (Invitrogen) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 0,5 l 1x MOPS-Laufpuffer (Invitrogen). Auch Last 5 ul einer pre-gefärbten Protein-Größenmarker (zB PAGE Herrscher plus, Fermentas, SM1811). </li><li> Führen Sie das Gel für 50 min bei 180 V. </li><li> Entfernen Sie das Gel vor und entsorgen Sie als feste Abfälle (enthält freie radioaktive ATP). </li><li> Übertragen Sie die Protein-RNA-Komplexen aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran mit dem Novex nassen Übertragung gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen, je 1 h bei 30 V). </li><li> Nach der Übertragung, spülen Sie die Membran in PBS-Puffer, dann wickeln Sie es in Frischhaltefolie und setzen Sie es zu einem Fuji-Film bei -80 ° C (statt einem fluoreszierenden Aufkleber neben der Membran zu einem späteren Zeitpunkt align ter Film und die Membran; durchführen Forderungen für 30 min, 1h und über Nacht). </li></ol> 9. RNA-Isolierung <ol><li> Isolieren Sie die Protein-RNA-Komplexen aus dem Low-RNase Experiment mit dem Autoradiogramm von Schritt 8.5 als eine Maske. Cut dieses Stück Membran in mehrere kleine Scheiben schneiden und diese in ein 1,5 ml Mikroröhrchen. </li><li> Geben Sie 200 ul PK-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) und 10 ul Proteinase K (Roche, 03115828001) an die Membran Stücke. Inkubieren Schütteln bei 1.100 rpm für 20 min bei 37 ° C. </li><li> Add 200 ul PKurea Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 7 M Harnstoff) und Inkubation für 20 min bei 37 ° C. </li><li> Sammeln Sie die Lösung und fügen Sie ihn zusammen mit 400 ul RNA Phenol / Chloroform (Ambion, 9722) zu einem 2 ml Phase Lock Gel Schwere Rohr (713 bis 2536, VWR). </li><li> Inkubieren für 5 min bei 30 ° C, Schütteln bei 1.100 Umdrehungen pro Minute. Trennen Sie die Phasen, durch Drehen für 5 min bei 13.000 rpm bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein neues Röhrchen (darauf achten, nicht auf das Gel mit der Pipette berühren). Add 0,5 ul glycoblue (Ambion, 9510) und 40 ul 3 M Natriumacetat pH 5,5 und mischen. Dann fügen Sie 1 ml 100% Ethanol, nochmals mischen und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C. </li></ol> 10. Reverse Transkription <ol><li> Spin für 20 min bei 15.000 rpm und 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und wäscht das Pellet mit 0,5 ml 80% Ethanol. </li><li> Das Pellet in 7,25 ul RNA / Primer-Mix (6,25 &amp;mgr; l Wasser, 0,5 ul Rclip Primer [0.5pmol/μl]; 0,5 ul dNTP-Mix [10 mM]). Für jedes Experiment oder replizieren, verwenden Sie ein anderes Rclip Primer mit individuellen Barcode-Sequenzen (siehe 14). </li><li> Inkubieren für 5 min bei 70 ° C vor dem Abkühlen auf 25 ° C. </li><li> Add 2,75 ul RT-Mix (2 ul 5x RT-Puffer, 0,5 ul 0,1 M DTT, 0,25 ul Superscript III-Reverse-Transkriptase [Invitrogen]). </li><li> Inkubieren 5 min bei 25 ° C, 20 min bei 42 ° C, 40 min bei 50 ° C und 5 min bei 80 ° C vor dem Abkühlen auf 4 ° C. </li><li> Add 90 ul TE-Puffer, 0,5 ul glycoblue und 10 ul Natriumacetat pH 5,5 und mischen. Dann fügen Sie 250 ul 100% Ethanol, nochmals mischen und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C. </li></ol> 11. Gel Reinigung der cDNA <ol><li> Spin nach unten und waschen Sie die Proben (siehe 10,1), dann das Sediment resuspendieren in 6 l Wasser. </li><li> Add 6 ul 2x TBE-Harnstoff-Ladepuffer (Invitrogen). Hitze Proben bis 80 ° C für 3 min direkt vor dem Laden. </li><li> Laden Sie die Proben auf einem vorgefertigten 6% TBE-Harnstoff-Gel (Invitrogen) und führen Sie für 40 min bei 180 V, wie vom Hersteller beschrieben. Auch Last mit niedrigem Molekulargewicht-Marker für die spätere Schneiden (siehe unten). </li><li> Cut drei Bands bei 120-200 nt (hoch), 85-120 nt (medium) und 70-85 nt (low). Verwenden Sie theupper Farbstoff und die Markierungen auf der Kunststoff-Gel unterstützt Exzision Guide (siehe Abbildung 3). Beachten Sie, dass die Rclip Primer und der L3-Sequenz machen zusammen über 52 nt der CLIP-Sequenz. </li><li> Add 400 ul TE zugeben und Gelscheibe in kleine Stücke mit einer 1 ml Spritze Kolben. Inkubieren Schütteln bei 1.100 rpm für 2 h bei 37 ° C. </li><li> Legen Sie zwei 1 cm Glas Vorfilter (Whatman, 1823010) in eine Costar SpinX Spalte (Corning Incorporated, 8161). Die Flüssigkeit Teil der Probe auf die Säule. Spin für 1 min bei 13.000 rpm in ein 1,5 ml-Tube. </li><li> Add 0,5 ul glycoblue und 40 ul Natriumacetat pH 5,5, dann mischen Sie die Probe. 1 ml 100% Ethanol, nochmals mischen und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C. </li></ol> 12. Ligation der Primer 5&#39;-Ende der cDNA <ol><li> Spin nach unten und waschen Sie die Proben (siehe 10,1), dann das Sediment resuspendieren in 8 ul Ligationsgemisch (6,5 ul Wasser, 0,8 ul 10x CircLigase Buffer II, 0,4 ul 50 mM MnCl 2, 0,3 ul; Circligase II [Epicentre]) und inkubieren 1 h bei 60 ° C. </li><li> Zugabe von 30 ul Oligo Glühen Mix (26 ul Wasser, 3 ul FastDigest Buffer [Fermentas], 1 ul cut_oligo [10 uM]). Inkubation für 1 min bei 95 ° C. Dann verringern Sie die Temperatur alle 20 sec um 1 ° C bis 25 ° C erreicht sind. </li><li> Add 2 ul BamHI (Fast Fermentas) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Dann werden 50 ul TE und 0,5 ul glycoblue und mischen. Fügen Sie 10 ul Natriumacetat pH 5,5 und mischen, dann fügen Sie 250 ul 100% Ethanol. Mix wieder und Niederschlag über Nacht bei -20 ° C. </li></ol> 13. PCR-Amplifikation <ol><li> Spin nach unten und waschen Sie die Proben (siehe 10,1), dann das Pellet in 19 ul Wasser. </li><li> Bereiten Sie die PCR-Mix (19 ul cDNA, 1 ul Primer-Mix P5/P3 Solexa, 10 uM jedes, 20 ul Accuprime Supermix 1-Enzym [Invitrogen]). </li><li> Führen Sie den folgenden PCR-Programm: 94 ° C für 2 min, [94 ° C für 15 sec, 65 ° C für 30 sec, 68 ° C für 30 sec] 25-35 Zyklen, 68 ° C für 3 min, 4 ° C für immer. </li><li> Mix 8 ul PCR-Produkt mit 2 ul 5x TBE-Ladepuffer und Last auf einem vorgefertigten 6% TBE-Gel (InvitRogen). Stain das Gel mit SybrGreen I (Invitrogen) und zu analysieren, mit einem Gel-Imager. </li><li> Der Barcode in der Rclip Primer erlauben Multiplex verschiedenen Proben vor der Einreichung für Hochdurchsatz-Sequenzierung. Submit 15 ul der Bibliothek für die Sequenzierung und speichern Sie die Ruhe. </li></ol> 14. Linker und Primersequenzen Pre-adenylierte 3 &#39;Linker-DNA: [Wir bestellen die DNA-Adapter von IDT und dann Aliquots von 20 um.] <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="DNA" /> 15. Repräsentative Ergebnisse: Vor Sequenzierung des iClip Bibliothek kann der Erfolg des Experiments auf zwei Schritte überwacht werden: die Autoradiogramm des Protein-RNA-Komplex nach Membran übertragen (Schritt 8,5) und das Gel Bild der PCR-Produkte (Schritt 13,4). Im Autoradiogramm des Low-RNase Proben sollten diffuse Radioaktivität über dem Molekulargewicht des Proteins (Abbildung 2, Probe 4) gesehen werden. Für High-RNase Proben ist diese Radioaktivität konzentriert näher an das Molekulargewicht des Proteins (Abbildung 2, Probe 3). Wenn keine Antikörper in der Immunpräzipitation verwendet wird, sollte kein Signal erkannt wird (Abb. 2, Proben 1 und 2). Weitere wichtige Steuerelemente für die Spezifität der Immunpräzipitation entweder weglassen UV-Bestrahlung oder Zellen, die nicht exprimieren das Protein von Interesse 14. Das Gel Bild der PCR-Produkte (Schritt 13.4) sollte eine Größenordnung, die die cDNA Fraktion (hoch, mittel oder niedrig) in Schritt 11,4 (Abbildung 4, Spuren 4-6) gereinigt entspricht. Beachten Sie, dass die PCR-Primer P3Solexa und P5Solexa eine zusätzliche 76 nt einzuführen, um die Größe der cDNA. Wenn keine Antikörper während der Immunpräzipitation verwendet wird, sollte keine entsprechende PCR-Produkten nachgewiesen werden (Abbildung 4, Spuren 1-3). Primer-Dimer Produkt kann bei etwa 140 nt erscheinen. Für repräsentative Ergebnisse der Hochdurchsatz-Sequenzierung und anschließende bioinformatischen Analysen siehe 14. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der iClip-Protokoll. Protein-RNA-Komplexen sind kovalent in vivo mittels UV-Bestrahlung (Schritt 1)-vernetzt. Das Protein von Interesse ist zusammen mit der gebundenen RNA (Schritte 2-5) gereinigt. Um für die Sequenz-spezifische Grundierung der reversen Transkription wird eine RNA-Adapter an den 3 ligiert &#39;Ende der RNA, während das 5&#39;-Ende radioaktiv markiert wird (Schritt 6 und 7). Vernetzte Protein-RNA-Komplexe werden von freien RNA mittels SDS-PAGE und Membran übertragen (Schritt 8) gereinigt. Die RNA wird von der Membran durch Verdau des Proteins mit Proteinase K Verlassen eines Polypeptids Verbleib in der Cross-Link Nukleotid (Stufe 9) gewonnen. Reverse Transkription (RT) schneidet bei den restlichen Polypeptid und führt zwei spaltbare Adapter Regionen und Barcode-Sequenzen (Schritt 10). Größe Auswahl entfernt freies RT Primer vor Umlaufverfahren. Die folgenden Linearisierung erzeugt geeignete Vorlagen für die PCR-Amplifikation (Schritte 11-15). Schließlich erzeugt der Hochdurchsatz-Sequenzierung liest, in dem die Barcode-Sequenzen unmittelbar von den letzten Nukleotid der cDNA (Schritt 16). Da diese Nukleotid lokalisiert eine Position vor dem vernetzten Nukleotid kann die Bindungsstelle mit hoher Auflösung abgeleitet werden. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Autoradiogramm vernetzten hnRNP C-RNA-Komplexen mit denaturierende Gelelektrophorese und Membran übertragen. hnRNP C-RNA-Komplexe wurden aus Zellextrakten mit einem Antikörper gegen hnRNP C Immun-gereinigt (α hnRNP C, die Proben 3 und 4). RNA wurde teilweise verdaut mit niedriger (+) oder hohen (+ +)-Konzentration von RNase. Komplexe Verschiebung nach oben aus der Größe des Proteins (40 kDa) zu beobachten (Probe 4). Die Verschiebung ist weniger ausgeprägt, wenn hohe Konzentrationen von RNase verwendet wurden (Probe 3). Das radioaktive Signal verschwindet, wenn keine Antikörper in der Immunpräzipitation verwendet wurde (Proben 1 und 2). <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Schematische 6% TBE-Harnstoff-Gel (Invitrogen) zur Führung der Exzision iClip cDNA-Produkte. Das Gel wird für 40 min bei 180 V führt zu einem reproduzierbaren Migration Muster von cDNAs und Farbstoffe (hell-und dunkelblau) in das Gel laufen. Verwenden einer Rasierklinge zu schneiden (rote Linie) die hohe (H), medium (M) und niedrig (L) cDNA-Fraktionen. Beginnen Sie mit dem Schneiden in der Mitte des hellblauen Farbstoff und unmittelbar oberhalb der Markierung auf der Kunststoff-Gel-Kassette. Teilen Sie die mittleren und niedrigen Fraktionen und schneiden den hohen Anteil von etwa 1 cm oberhalb der leichten blauen Farbstoff. Verwenden Sie vertikale Schnitte durch die Taschen und der Farbstoff geführt, um die verschiedenen Bahnen (in diesem Beispiel 1-4) zu trennen. Der Marker Spur (m) ergibt gebeizt und abgebildet, die KontrolleGrößen nach dem Schneiden. Fragmentgrößen sind auf der rechten Seite angegeben. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Analyse von PCR-amplifizierten iClip cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von Gel-Elektrophorese. RNA erholte sich von der Membran (Abbildung 1) wurde revers transkribiert und die Größe der unter Verwendung denaturierende Gelelektrophorese (Abbildung 2). Drei Kornfraktionen von cDNA (hohe [H]: 120-200 nt-, mittel-[M]: 85-120 nt und niedrige [L]: 70-85 nt) wurden gewonnen, zirkularisiert, wieder linearisiert und PCR-amplifiziert. PCR-Produkte von unterschiedlichen Größenverteilung kann als Ergebnis der unterschiedlichen Größen der Eingangs-Fraktionen beobachtet werden. Da die PCR-Primer stellt 76 nt der cDNA sollte Größen zwischen 196-276 nt für hohe, 161-196 nt Bereich für mittlere und 146-161 nt für geringe Größe Fraktionen. PCR-Produkte fehlen, wenn keine Antikörper für die Immunpräzipitation (Spuren 1-3) verwendet wurde.

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Da die iClip Protokoll enthält ein breites Spektrum von enzymatischen Reaktionen und Reinigungsschritte, ist es nicht immer leicht zu einem Problem, wenn ein Experiment nicht zu identifizieren. Um die Spezifität der identifizierten RNA Cross-Link-Sites kontrollieren, sollten eine oder mehrere negative Kontrollen während des gesamten Experiments und anschließender rechnerische Analysen beibehalten werden. Diese Kontrollen können die nicht-Antikörper-Probe, die nicht-vernetzten Zellen oder Immunpräzipitation von Knockout-Zellen oder Gewebe sein. Idealerweise sollten diese Kontrollversuche nicht reinigen jedes Protein-RNA-Komplexen, und sollte daher kein Signal auf dem SDS-PAGE-Gel und keine nachweisbaren Produkte nach PCR-Amplifikation zu geben. Hochdurchsatz-Sequenzierung dieser Kontrolle Bibliotheken zurückgeben sollte nur sehr wenige eindeutige Sequenzen. Knockdown-Zellen sind nicht als Ablaufsteuerung empfohlen, da die resultierenden Sequenzen noch zu vernetzen Standorte des gleichen Proteins, das aus Knockdown-Zellen in kleineren Mengen gereinigt entsprechen. Es sollten Vorkehrungen getroffen werden, um eine Kontamination mit PCR-Produkten aus früheren Experimenten zu vermeiden. Der beste Weg, um dieses Problem zu minimieren, ist räumlich getrennt Pre-und Post-PCR-Schritte. Idealerweise sollte die Analyse der PCR-Produkte und alle nachfolgenden Schritte in einem separaten Raum durchgeführt werden. Darüber hinaus sollte jedes Mitglied der Labor seinen eigenen Satz von Puffern und anderen Reagenzien. Auf diese Weise können Kontaminationsquellen leichter identifiziert werden.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2638">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution</a>. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to: "...as well as 2 &#x03BC;l Turbo DNase..." instead of: "...as well as 2 ml Turbo DNase..."

A correction to the article iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution was made.

Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Für Gel-Elektrophorese und die Membran übertragen, empfehlen wir t er Einsatz von XCell SureLock ® Mini-Cell und XCell II ™ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), die mit dem Einsatz der verschiedenen vorgefertigten Minigele, dass in dem Protokoll angegeben werden, ist . Die Marke und die Bestellnummer aller verwendeten Materialien ist bei der Protokoll erwähnt. Die Liste der Enzyme in das verwendete Protokoll ist in der nachfolgenden Tabelle dargestellt. <table border="1"><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Protein A Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> Verwendung Protein G für Maus oder Ziegen-Antikörper </td></tr><tr><td> RNase I </td><td> Ambion </td><td> AM2295 </td><td> Aktivität kann von Charge zu Charge ändern </td></tr><tr><td> T4 RNA-Ligase I </td><td> NEB </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Roche </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> Superscript III-Reverse-Transkriptase </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> Epicentre </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ SuperMix I </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> Diese PCR-Mix die besten Ergebnisse in unseren Händen </td></tr></table>

iclip - transcriptome-wide mapping of protein-rna interactions with individual nucleotide resolution

Die einzigartige Zusammensetzung und räumliche Anordnung der RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) auf ein Transkript führen die vielfältigen Aspekte der post-transkriptionellen Regulation 1. Daher ist ein wesentlicher Schritt zum Verständnis Transkript Regulierung auf der molekularen Ebene bis Positionsinformationen auf die Bindungsstellen der RBPs 2 Gain. Protein-RNA Wechselwirkungen untersucht mit Hilfe biochemischer Methoden, aber diese Ansätze beziehen sich nicht auf RNA-Bindung in seiner nativen zellulären Kontext. Erste Versuche zur Protein-RNA-Komplexen in ihrer zellulären Umgebung Studie beschäftigt Affinitätsreinigung oder Immunpräzipitation mit Differential-Display-oder Mikroarray-Analyse (RIP-CHIP) 3-5 zusammengefasst. Diese Ansätze waren anfällig für die Identifizierung indirekte oder nicht-physiologischen Wechselwirkungen 6. Um die Spezifität und Ortsauflösung zu erhöhen, bezeichnet eine Strategie, um als CLIP (UV-Vernetzung und Immunpräzipitation) 7,8 eingeführt wurde. CLIP kombiniert UV-Vernetzung von Proteinen und RNA-Moleküle mit rigorosen Reinigung Systeme einschließlich denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese. In Kombination mit High-Throughput-Sequenzierung Technologien hat CLIP als ein mächtiges Werkzeug, um Protein-RNA-Wechselwirkungen auf einem genomweiten Maßstab (bezeichnet als HITS-CLIP oder CLIP-seq) 9,10 Studie unter Beweis gestellt. Kürzlich wurde PAR-CLIP eingeführt, photoreaktiven Ribonukleosid Analoga verwendet zur Vernetzung 11,12. Trotz der hohen Spezifität der erhaltenen Daten, CLIP Experimente erzeugen oft cDNA-Bibliotheken von begrenzter Komplexität Folge. Dies ist zum Teil aufgrund der beschränkten Menge an Co-gereinigten RNA und die beiden ineffizient RNA Ligationsreaktionen für Bibliotheks-Vorbereitung erforderlich. Darüber hinaus gaben Primer Extension Assays, dass viele cDNAs vorzeitig abgeschnitten bei den vernetzten Nukleotid 13. Solche abgeschnitten cDNAs sind während der Standard-CLIP-Bibliothek Vorbereitung Protokoll verloren. Wir haben vor kurzem iClip (Einzel-Nukleotid-Auflösung CLIP), der die abgeschnittenen cDNAs erfasst durch den Ersatz eines der ineffizienten intermolekularen RNA Ligationsschritten mit einer effizienteren intramolekularen cDNA Umlaufverfahren (Abbildung 1) 14 entwickelt. Wichtig ist, dass die Sequenzierung des abgeschnitten cDNAs bietet Einblicke in die Position des Cross-Link-Website unter Nukleotid-Auflösung. Wir haben erfolgreich angewendet iClip zu hnRNP C Partikel Organisation auf einem genomweiten Maßstab Untersuchung und Bewertung ihrer Rolle in Spleißen Regel 14.

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iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Die räumliche Anordnung der RNA-bindenden Proteinen auf eine Abschrift ist eine wichtige Determinante der post-transkriptionellen Regulation. Deshalb entwickelten wir individuelle-Nukleotid-Auflösung UV-Vernetzung und Immunpräzipitation (iClip), die eine präzise genomweite Kartierung der Bindungsstellen eines RNA-bindenden Proteins erlaubt.

iClip - Transkriptom-weiten Mapping von Protein-RNA Wechselwirkungen mit Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

iclip-transcriptome-wide-mapping-protein-rna-interactions-with

Research

JoVE Journal

Biology

58.1K Aufrufe.  Medical Research Council - MRC. Die räumliche Anordnung der RNA-bindenden Proteinen auf eine Abschrift ist eine wichtige Determinante der post-transkriptionellen Regulation. Deshalb entwickelten wir individuelle-Nukleotid-Auflösung UV-Vernetzung und Immunpräzipitation (iClip), die eine präzise genomweite Kartierung der Bindungsstellen eines RNA-bindenden Proteins erlaubt.

Serie: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

Nicht-invasive 3D-Visualisierung mit Sub-Mikron-Auflösung mit Synchrotron-Röntgen-Tomographie

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Forschung

Biologie

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

Freisetzung von Dopamin an den einzelnen präsynaptischen visualisiert FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mit Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

Kartierung der Nachwirkungen der Theta Burst Stimulation auf das menschliche Gehör Cortex mit Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

Genomweite Kartierung der Drug-DNA-Wechselwirkungen in Zellen mit COSMIC (Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin isolieren)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DAMiD-seq: Genomweite Mapping von Protein-DNA-Wechselwirkungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.