Dieses Projekt wurde von der Illinois Department of Public Health und der National Science Foundation (DBI-0852416) gefördert.

1. Gerätefunktion <ol><li> Die hypoxische einfügen Gerät enthält 6-Säulen, Nest in einem Standard-6-Well-Platte. Gas strömt in die Säule, auf einem mikrofluidischen Netzwerk an der Basis der Säule, und fließt wieder aus dem Gerät. An der Basis der Säule bildet die untere Wand des Mikrokanals ist ein 100 um dick gasdurchlässige PDMS-Membran, die Sauerstoffdiffusion erlaubt zwischen dem Gas Mikrokanal und Kulturmedien. Somit arbeitet das Gerät durch die Errichtung eines Konzentrationsgradienten, dass die Medien Sauerstoffkonzentration Laufwerke zu einem gewünschten Wert ein. </li><li> Das Gerät bietet eine Reihe von Vorteilen gegenüber dem hypoxischen Kammer und andere Zelle Sauerstoffzufuhr: 1) minimiert die Sauerstoffdiffusion Weg ermöglicht schnellere zeitliche Steuerung, 2) erhöht die räumliche Kontrolle über Sauerstoffversorgung, da abhängig von der Säule Mikrokanal Design, 3) besitzt eine kleinere Labors Stellfläche und einen höheren Durchsatz zu experimentellen Effizienz zu steigern, und 4) passt sich an gemeinsamen Zellkultur-Tools (zB Mikrotiterplatte), ohne die Forderung nach Fachwissen und Ausrüstung. </li></ol> 2. Bauelementherstellung <ol><li> Zunächst wird die Säule Array Replikat mit PDMS in einer zuvor bearbeiteten Delran Form geformt. </li><li> Als nächstes werden die Gas-Mikrokanal am unteren Rand jeder Säule wird hergestellt unter Verwendung von Standard SU-8 Photolithographie und PDMS Replikat. </li><li> Das Gas-durchlässige Membran ist definiert durch Spinnen von PDMS auf einem Silizium-Wafer auf die gewünschte Dicke erreicht hergestellt. In diesem Beispiel verwenden wir eine 100 um dicke Membran, die durch Schleudern 500 Umdrehungen pro Minute für 10 Sekunden und dann 900 rpm für 30 Sekunden hergestellt wurde. </li><li> Alle Komponenten sind zusammen nach Sauerstoff-Plasma-Behandlung mit einem Handheld-Plasma-Gerät (Modell BD-20, Electro-Technic Products) gebunden. </li></ol> 3. Geräte-Setup <ol><li> Schieben Sie Gerät in die Platte, achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden. Angling das Gerät beim Einstecken hilft, Blasen zu vertreiben aus einer Seite. Für aktuelle zellbasierten Experimenten, müssen Sie diesen Schritt in einem sterilen Laminarströmungshaube durchgeführt werden. Die Chancen für Verunreinigungen stark reduziert, wenn das Gerät eingelegt wird, so dass die Baugruppe über können in den Inkubator durchgeführt werden in einem nicht-sterilen Umgebung. </li><li> Die Leitungen von der Quelle Gastank mit dem Einlass-und Auslasskanäle des Gerätes. Für zellbasierten Experimenten sollte der Inkubator ein Loch mit dem Schlauch die Einreise und den Schlauch sollte nach Durchführung des Geräts und stellen Sie es in den Inkubator angeschlossen werden zulassen. Achten Sie darauf, zu vermeiden, dass Überdruck auf dem Gerät, das die PDMS verformen könnte genug, um die darunter liegenden Zellen zu vernichten. </li><li> Achten Sie darauf, die Präzision Durchflussregler vor dem Öffnen des Tank-Top Regler zu vermeiden überfüllt das Gerät geschlossen wird. Starten Sie den Gasstrom. Öffnen Sie vorsichtig Präzision Durchflussregler zur gewünschten Durchfluss (50-100 ml / min). Sehen Sie den Wert genau in den nächsten Stunden und nehmen Sie bei Bedarf, da der Druckabfall wird sich ändern, während das System im Gleichgewicht, Veränderung der Durchflussmenge. Zur Vermeidung der Bildung von Blasen in den Medien, reduzieren den Durchfluss zwischen 10-20 ml / min nach einer ersten 15 Minuten Äquilibrierung Dauer mit der höheren Fließgeschwindigkeit. </li><li> Nach gewünschten Versuchsdauer, stop Gasstrom, entfernen Sie die Platte und Prozess-Zellen entsprechend (zB lysieren, Beize, zählen, etc.). </li></ol> 4. Geräte-Validierung <ol><li> Kalibrierung <ol><li> Wählen Sie die Anzahl und Lage der Positionen auf dem fluoreszierenden Sauerstoff (FOXY) Sensor schieben (abhängig von der Validierung Anforderungen), die für Sauerstoff-Messung verwendet werden. Die Folie enthält einen fluoreszierenden Ruthenium-Farbstoff-Beschichtung, die durch Sauerstoff gelöscht wird. </li><li> Expose Bild direkt auf 0, 10 und 21% Sauerstoff aus Gastank und die Aufnahmen nach 5 Minuten für die richtige Gleichgewicht. </li><li> Export der mittleren Bildintensität für jede Position und Plot Sauerstoffversorgung Konzentration abhängig Fluoreszenzintensität. </li><li> Generieren Kalibrierkurve durch den Einbau lineare Kurven, die 0-10% Linie und 10-21% Linie. </li></ol></li><li> Heterogenität <ol><li> Richten Sie mehrere Punkte über die gesamte Breite des Kanals in einem definierten Intervall (zB alle 1 mm). Beachten Sie, dass es Überschneidungen der Bilder je nach Abstand werden. </li><li> Messen Sie die Sauerstoffkonzentration an der Oberfläche auch durch die Einrichtung </li></ol></li><li> Äquilibrierung <ol><li> Wählen Sie drei Punkte auf dem FOXY Folie, in der die Sauerstoffkonzentration messen. </li><li> Unmittelbar nach der Aufnahme ein erstes Bild bei Umgebungstemperatur Sauerstoff, öffnen Sie die Präzision Durchflussregler, um den Gasfluss in das Gerät zu starten. Aufnehmen von Bildern zu einem geeigneten, um die Dauer und das Ausmaß von Sauerstoff konzentr bewertenATION Gleichgewichts (z. B. alle 10 Sekunden für 30 min). </li></ol></li></ol> 5. Anwendungen <ol><li> Wound Healing <ol><li> Einen Tag vor dem Experiment, genießen die sterilisierten PDMS einfügen in serum-freiem Medium zu reduzieren hemmen Gasblasenbildung in den Brunnen. </li><li> Kultur-Zellen zu 100% Konfluenz in einer 6-Well-Platte. </li><li> Erstellen Sie direkt Kratzer in der Monoschichten mit einem p200 Pipettenspitze, um Wunden zu simulieren. </li><li> Saugen Sie die Zelle Medien, mit 5 ml Medium spülen und absaugen wieder. Es ist wichtig, nicht stören Monoschicht von Zellen. </li><li> Füllen Sie den Brunnen mit 4 ml serum-freiem Medium, um die Zellproliferation zu reduzieren. </li><li> Legen Sie in die Vertiefungen einzufügen und eine Verbindung jeweils auch eine entsprechende Sauerstoffkonzentration. </li><li> Legen Sie 6-Well-Platte mit Einsatz auf beheizten Bühne bei 37 ° C. </li><li> Erfassen Zeitreihen-Aufnahmen der Zellen im gewünschten Intervall und Gesamtdauer. MATLAB ist T_Scratch, eine Wunde Mess-Algorithmus kann verwendet werden, um die vernarbte Fläche zu analysieren. </li></ol></li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Geräte-Validierung Die hypoxische einfügen Gerät weist große Verbesserungen gegenüber dem hypoxischen Kammer in Bezug auf Sauerstoff Gleichgewichtszeit und Umfang, die weniger als 2 Minuten auf 0,5% Sauerstoff zu stabilisieren. Das Gerät Membran-und Unterseite Spaltmaß war der kritische Faktor bei der Bestimmung des Gleichgewichts Effizienz, mit größeren Spaltmaßen, die mehr Zeit, um steady-state Sauerstoffkonzentration Werte erreichen. Das Gerät ermöglicht auch ein hohes Maß an Kontrolle über die räumliche Sauerstoffzufuhr in einem einzigen, gut, so dass die Bildung von mehreren Bedingungen, und selbst erzeugen eine zyklische Sauerstoff-Profil über die Oberfläche des Brunnens. </li><li> Die Wundheilung Zellmonoschichten wurden zu 10% oder 21% Sauerstoff und die Oberfläche der Wunde freigelegt wurde im Laufe der Zeit analysiert. Kratzer ausgesetzt zu 21% Sauerstoff schloss die langsamste und 10% der am schnellsten. Abbildung 1 zeigt Bilder eines Kratzers im Laufe von 17 Stunden. Die Diagramme in Abbildung 5 zeigen die Prozent der offenen Wundfläche sowohl für Sauerstoff-Konzentrationen für die Dauer des Experiments. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="Abbildung 1" border="0" /></a> Abbildung 1. Schaltplan und Diagramme, die Gerätefunktionen. Der Sauerstoff einfügen Gerät ist durch konventionelle Photolithographie (Mikrofluidik-Netzwerk), Replikat (Mikrofluidik-Netzwerk und legen Gerüst) hergestellt und definiert von PDMS Spinnen (Gas-Membran). A) Der Sauerstoff-Gerät in einem 6-Well-Platte verschachtelt. B) Beispiele 24 und 96-Well-Säule Arrays. C) Ein Querschnitt schematisch eine Säule. Sauerstoff strömt in das Gerät durch den Einlass und fährt über eine mikrofluidische Netzwerk an der Unterseite des Ständers. Sauerstoff kann frei über die gasdurchlässige PDMS Membran diffundieren am unteren Rand der Säule und lösen sich in den Kulturmedien. D) eine mikroskopische Aufnahme zeigt die verschiedenen Funktionen eines Single-Channel-Säule von oben, mit gebundenen Glas Beiträge für die Äquilibrierung Studien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="Abbildung 2" border="0" /></a> Abbildung 2. Validierung der das Gerät mit Sauerstoff-Sensoren. Sauerstoff-Partialdruck in jeder Vertiefung wurde unter Verwendung eines planaren Ruthenium Sauerstoffsensor. Alle Sauerstoff-Gemischen enthaltenen ausgewogenen Stickstoff und 5% CO 2 für Medien-Pufferung. A) Darstellung, die die Wirkung der post Höhe, und damit Sauerstoffdiffusion Abstand zwischen der Membran und Zellen, auf die Gleichgewichtseinstellung und Effektivität. Heights wurden von geschliffenem Glas Beiträge verpflichtet, die Unterseite des Gerätes festgelegt. Alle drei post Größen ergeben Äquilibrierungszeiten viel über die hypoxischen Kammer verbessert. Beachten Sie, dass Zeit auf einer logarithmischen Skala ist. B) Plot Darstellung der schnellen Sauerstoff Equilibrierung Ansprechzeit des 0,2 mm Abstand Gerät. C) Multi-Position linescans wurden auch über die weit unter den Mikrokanal ergriffen, um die Homogenität der Sauerstoffkonzentration durch das Gerät eingeführt wurden. Graph zeigt die Sauerstoffkonzentration nach Infusion von 0%, 10% und 21% Sauerstoff für 10 min gemessen. D) Geräte effektiv hält 10% Sauerstoff über 5 Tage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="Abbildung 3" border="0" /></a> Abbildung 3. Experimentieren mit komplexeren Sauerstoff Mikrokanal Designs. A) Dual-Zustand Mikrokanal Setup ergibt sich eine stabile 0% und 21% Sauerstoff-Profil über 14 Tage. B) Ein verzahnt und gewundenen Muster von 500 um Breite Mikrokanälen sich über the Säule ergibt sich eine zyklische Sauerstoff Profil. Beachten Sie, dass die Daten nur zeigt einen Vertreter Studie als Mikrokanal Ausrichtung war schwierig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="Abbildung 4" border="0" /></a> Abbildung 4. Timelapse Bilder Wundverschluss 0, 7, und 17 Stunden nach der ersten Kratzer. Die Zellen wurden 21% Sauerstoff im gesamten Dauer des Experiments geliefert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="Abbildung 5" border="0" /></a> Abbildung 5. Wirkung von Sauerstoff-Konzentration auf die Wundheilung Rate in einen Kratzer Assay.

Das Gerät wird durch Standard-SU-8 Photolithographie, Replikat, und definiert Spinnen und ganz aus Polydimethylsiloxan gemacht hergestellt. Gas wird in das Gerät eingeführt, um einen Konzentrationsgradienten zwischen der Säule Mikrokanal und die Kultur Mittel herzustellen, fahren das System in Richtung eines gewünschten Gleichgewichts-Sauerstoff-Konzentration. Das Gerät hat sich gezeigt, um effektiv zu modulieren die zeitliche und räumliche Sauerstoffzufuhr in einem Brunnen, sowie modulieren zelluläre Verhalten angemessen. Die räumliche Strukturierung der Oxygenierung durch den Mikrokanal ist an der Basis der Säule definiert, so eine Vielzahl von Designs in Handarbeit die Photomaske umgesetzt werden könnten. Darüber hinaus ist die Infusion von der gewünschten Gas in die Gasphase der auch erwartet, dass Gleichgewichtszeit und das Ausmaß der Hypoxie zu verbessern. Ein mikrofluidischen Mischen Netzwerk könnte, um das Gerät angepasst werden, um ein Mittel bereitzustellen, um neue Gasgemische aus nur ein paar Lager Gastanks zu produzieren. Schließlich würde ein Mechanismus für Austausch von Medien überflüssig für die Entfernung des Geräts vom Multiwellplatte, von denen die Zellen reagieren. Das Gerät verfügt über Anwendungen in allen in vitro oder ex vivo Experiment erfordert die Kontrolle über Sauerstoffkonzentration. Da Sauerstoff eine wichtige physiologische Variablen beeinflussen die überwiegende Mehrheit der Signalwege, die Bereiche Forschung, die profitieren würden durch die Kreativität des Forschers begrenzt. Einige Felder, die von der erweiterten zeitliche Steuerung der Sauerstoffkonzentration profitieren würde Krebsmetastasen, Schlafapnoe, und kardialen Ischämie Reperfusionsschaden, unter vielen anderen. Zum Beispiel hat intermittierende Hypoxie mit mehr invasiven Karzinomen korreliert, heraufregulierende eine Reihe von metastastis-assoziierter Gene in Bezug auf kontinuierliche Hypoxie und Normoxie. Räumliche Steuerung ist auch wichtig, wie Sauerstoff-Gradienten kritisch in der Entwicklung, Leber Zonierung, Drogen Toxizität und die Stammzell-Nische sind. Das Gerät in diesem Artikel vorgestellt werden eine Reihe von Bereichen der Forschung durch die Bereitstellung eines Systems mit einem kleineren Labor Stellfläche, relativ einfach, den operativen Bedarf und weit größere Kontrolle über die Sauerstoffsättigung, um Zellen zu profitieren.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS-Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Planar FOXY sensor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ocean Optics</td>
<td>FOXY-SGS-M</td>
<td>Coated microscope slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega</td>
<td>FL-1472-G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>Custom mixes</td>
<td>All have 5% CO2</td>
</tr>
<tr>
<td>SU-8 2150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microchem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>M3803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-2020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication and operation of an oxygen insert for adherent cellular cultures 

Sauerstoff ist ein wichtiger Modulator der vielen zellulären Signalwege, aber die aktuellen Geräte erlauben<em&gt; In-vitro-</em&gt; Sauerstoff-Modulation nicht auf die Bedürfnisse der biomedizinischen Forschung gerecht zu werden. Die hypoxischen Kammer bietet ein einfaches System zur Sauerstoffanreicherung in Standard-Kulturgefäße Kontrolle, aber es fehlt präzise zeitliche und räumliche Kontrolle über die Sauerstoff-Konzentration an der Zelloberfläche und verhindert so deren Anwendung bei der Untersuchung einer Vielzahl von physiologischen Erscheinungen. Andere Systeme sind auf die hypoxischen Kammer verbessert, sondern erfordern spezielle Kenntnisse und Ausrüstung für ihren Betrieb, so dass sie einschüchternd für den durchschnittlichen Forscher. Eine mikrostrukturierte Einsatz für Mikrotiterplatten wurde entwickelt, um besser steuern die zeitliche und räumliche Sauerstoffkonzentration auf besseres Modell physiologischen Erscheinungen gefunden<em&gt; In vivo</em&gt;. Die Plattform besteht aus einem Polydimethylsiloxan einzufügen, Nester in eine Standard-Mikrotiterplatte und dient als passive mikrofluidische Gasnetz mit einem Gas-durchlässige Membran zielte darauf ab, die Sauerstoffversorgung zu modulieren adhärenten Zellen. Das Gerät ist einfach zu bedienen und ist an Gasflaschen, dass der Druck auf die gewünschte Sauerstoffkonzentration in die Plattform vorstellen zu liefern. Fabrication beinhaltet eine Kombination von Standard-SU-8 Photolithographie, Replikat, und definierte PDMS Spinnen auf einem Silizium-Wafer. Die Komponenten des Geräts sind nach der Oberflächenbehandlung mit einem Hand-Plasma-System gebunden. Validation ist mit einer planaren fluoreszierenden Sauerstoff-Sensor erreicht. Gleichgewichtseinstellungszeit ist in der Größenordnung von Minuten und einer Vielzahl von Sauerstoff-Profile können auf dem Gerät Design, wie das zyklische Profil in dieser Studie erreicht und sogar Sauerstoff-Gradienten erreicht werden, um diese zu imitieren<em&gt; In vivo</em&gt;. Das Gerät kann für die Zellkultur sterilisiert werden mit üblichen Methoden, ohne Verlust der Funktion. Das Gerät ist Anwendbarkeit auf die Untersuchung der<em&gt; In-vitro-</em&gt; Wundheilung Reaktion nachgewiesen werden kann.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures at JoVE.com

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Herstellung und Validierung eines Add-on-Plattform, die eine verbesserte Kontrolle über die räumliche und zeitliche Sauerstoffzufuhr in ein 6-Well-Platte bietet. Das Gerät lässt sich an einer Reihe von Kultur-Systeme und kann verwendet werden, um die Wirkung von Sauerstoff auf die Wundheilung zu untersuchen.

Herstellung und Betrieb eines Oxygen Insert für adhärente Zellkulturen

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

fabrication-operation-an-oxygen-insert-for-adherent-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

9.6K Aufrufe.  University of Illinois. Herstellung und Validierung eines Add-on-Plattform, die eine verbesserte Kontrolle über die räumliche und zeitliche Sauerstoffzufuhr in ein 6-Well-Platte bietet. Das Gerät lässt sich an einer Reihe von Kultur-Systeme und kann verwendet werden, um die Wirkung von Sauerstoff auf die Wundheilung zu untersuchen.

Serie: Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Forschung

Biologie

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Klonogene Test: adhärenter Zellen

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Objektiv-kostenlose Videomikroskopie für die Dynamik und Quantitative Analyse der adhärente Zellkultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

Echtzeit-Detektion der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies bei der Immunantwort in Reis mit einem Chemilumineszenz-Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

Ein innovativer 3D-gedruckter Einsatz, der für einfache 2D- und 3D-Zellkulturen entwickelt wurde

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...