This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.

1. Fibers <ol><li> Herstellung der Fasern durch Phasenumkehr Schleudergießen (Spinnen). Details zu dieser Methode kann in 23,24 zu finden. HINWEIS: Bei dieser Arbeit werden die Fasern werden im Haus hergestellt , das eine biologisch nicht abbaubare proprietären Polymer verwendet, NMP als Lösungsmittel und H 2 O als das Nicht-Lösungsmittel. Details von anderen geeigneten Polymeren können in der Diskussion finden. Die Fasern in dem System verwendet wird hier beschriebenen 1,05 mm Außendurchmesser mit einer 600-700 um Lumendurchmesser. Die Fasern sind porös mit einem Porendurchmesser 2,28 &amp; mgr; m ± 1,5 &amp; mgr; m (Mittelwert ± Standardabweichung) zu messen. Dies dient dazu, Zellen aus der Medienzufuhr in das Faserlumen zu trennen, die Lebersinusoid oder Gefäße anderer Gewebe zu replizieren. Die Fasern können auch aus Membranlieferanten wie Pall erworben werden. </li></ol> 2. Module Fabrication HINWEIS: Die Module in dieser Studie verwendet werden, von 1 mm dicken Borosilikatglas mit 2 Seitenöffnungen gemacht(2A). Die Fasern in dem Modul hier beschriebenen einen äußeren Oberflächenbereich von 4,95 cm 2 , die das Äquivalent von etwa der Hälfte einer Vertiefung einer 6-Well - Platte ist. <ol><li> Silikonisieren Module vor dem ersten Gebrauch durch Beschichten der inneren Oberfläche mit Sigmacote (Tabelle 1) und damit in einem Abzug trocknen. Autoklav (121 ° C, 1 atm, 20 min), um die Lebensdauer der Behandlung zu erhöhen. </li><li> Verwendung eines Skalpellschnitt 75 mm langen Fasern und legen drei Fasern in jedes Modul an jedem Ende (3A) ~ 7 mm Überlänge zu verlassen. </li><li> Ort ~ 0,5 ml Silikonkleber (Tabelle 1) in ein Wägeschiffchen. Verwenden Spitze eine P200 Pipette eine kleine Menge Silikon zu holen und arbeiten , um den Klebstoff in die Enden des Moduls um die Fasern eine 3-5 - mm - Stecker (3B) zu bilden. Lassen Sie für&gt; 3 Stunden trocknen lassen. </li><li> Mit einem Skalpell geschnitten das Silikon bündig mit den Glasmodul Enden (3C). </li><li> Wickeln Sie einkleine Menge (~ 4-Schichten) aus Polytetrafluorethylen (PTFE) Band um einen Seitenanschluss. </li></ol> 3. System-Setup und Sterilisation HINWEIS: Pumpenschläuche und Module mit Fasern nicht autoklaviert und sterilisiert 70% Ethanol verwendet wird. Die Autoren empfehlen, die Pumpenschläuche mit der Pumpe Kalibrierung verwendet zu werden. Das folgende Verfahren wird in einem Laminar-Flow-Haube durchgeführt. <ol><li> Autoklav (wie Abschnitt 2.1) alle autoklavierbar Komponenten vor dem Set-up. </li><li> Konfiguration <ol><li> Platz 10 ml 70% Ethanol in die Vorratsflasche und Set-up der Vorratsflasche, Q-Serie Kappe, Futterrohr, Pumpe und Pumpenschlauch (Tabelle 1) , wie in Abbildung 4. </li><li> Locker legen eine Endkappe über die PTFE-Klebeband Seitenöffnung. Schieben Sie die Enden der L / S16 Modulanschlüsse über den Modulenden und freien Seite Port. Verbinden einen 40 mm Abschnitt L / S13 Schlauch an den Modulanschluss am nächsten zu dem verkappten Seitenöffnung (Tabelle 1) , wie in 2B </strong&gt;. </li><li> Verbinden des Moduls mit dem Pumpenschlauch, um sicherzustellen, das Modul zu orientieren, so dass die verkappten Seitenöffnung am nächsten zu der Pumpe ist. </li><li> Schließen Sie die Permeatleitung und Retentat Leitung zu den Modulverbinder und dem L / S14 des Y-Anschluss auf der Vorratsflasche (Tabelle 1). Stellen Sie sicher , dass die Einrichtung die Schaltpläne in Abbildung 4 ähnelt. </li></ol></li><li> Sterilisation <ol><li> Pumpe Ethanol durch das Modul bei 800 &amp; mgr; l / h (267 &amp; mgr; l / h pro Faser) für genügend Zeit unautoclaved Komponenten für&gt; 30 min zu behandeln (justieren Zeiten , wenn andere Sterilisationsverfahren verwendet werden, siehe 25). </li></ol></li><li> Waschen <ol><li> Zum Waschen des Ethanols aus dem System, schalten Sie zuerst die Pumpe und die Schläuche entleeren. Zuerst nehmen Sie den Pumpenschlauch aus dem Moduladapter Schläuche. Halten Sie aloft das Modul das Ethanol aus dem Fasern und Retentatleitung abzulassen, zurück in die Vorratsflasche. Entfernen Sie die Seitenöffnung Endkappe aus dem Modul th abzulassene Ethanol aus dem Modul selbst, und die Permeatleitung. Bringen Sie die Seitenöffnung Endkappe. Kehren Sie den Fluss von Medien an der Pumpe den Pumpenschlauch und Zuleitung von Ethanol zu entleeren. Schalten Sie die Pumpe, und befestigen Sie den Pumpenschlauch mit dem Modul-Adapter. </li><li> Lösen Sie die Ethanolflasche aus dem Deckel und ersetzen mit einer Flasche mit 10 ml Zellwachstumsmedium (wie EMEM, GMEM, DMEM oder RPMI) ohne Serum. Pumpe das Medium durch das System bei 800 &amp; mgr; l / h, bis die Retentatleitung ist voll von Medien. Klemmen Sie die Retentatleitung zu zwingen Durchdringung der Medien durch die Fasern des Moduls zu waschen. Waschen Sie für ~ 2 Std. </li></ol></li></ol> 4. Seeding HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Medien und Ergänzungen sollten diejenigen sein, die für den gewünschten Zelltyp festgelegt werden. Bitte beachten Sie die Literatur, die Europäische Sammlung von Zellkulturen (ECACC) und American Type Culture Collection (ATCC) für weitere Informationen. Vor dieser Methode Zellen sollte maintained nach der gewünschten Zelltyp zu etablierten Protokollen. Für diese Arbeit wurden die hepatocarcinoma HepG2 / C3A Subklon nach den Verteilern Empfehlungen gehalten (ATCC). HINWEIS: Das Protokoll seeding unten vorgestellt dient das Modul mit Zellkulturmedium zu Vorkultur vor der Zellwachstum. Sollte eine weitergehende Vorkultur erforderlich sein, dann sollten diese vor durchgeführt werden, um das Modul zu Impfen durch die Waschmedien aus dem System entleeren und ersetzt mit Wachstumsmedien und durchdringt diese durch das Modul für ein paar Stunden. Abschnitt 7.5.2.1 für Details auf Medien im System zu ersetzen. <ol><li> Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension durch Trypsinisierung nach etablierten Protokollen für den gewünschten Zelltyp. Ein allgemeines Protokoll für eine T75-Kultur ist wie folgt: HINWEIS: Die Anzahl der Zellen in der Impfschritt verwenden sollte für den gewünschten Zelltyp empirisch ermittelt werden. Die Bioreaktoren hier beschrieben sind, bei einer 35-fach höheren cel ausgesätls Dichte (Zellen / cm 2) als für eine 7 - Tage - Kultur in 2D Gewebekulturkunststoff verwendet. <ol><li> Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 10 ml Phosphat - gepufferter Salzlösung (PBS), absaugen, dann 3 ml 0,05% Trypsin Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (genug , um die Zellen zu bedecken) und inkubiere bei 37 ° C, 5% CO 2 für 5 min. </li><li> Ernte Zellen in 7 ml Wachstumsmedium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, um das Trypsin zu neutralisieren. Gut mischen, mit 10 &amp; mgr; l in die Kammer eines Hämocytometer und die Zellen zu zählen. </li><li> Zentrifuge bei 200 × g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren. </li><li> Den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen bei 4x10 6 / ml in Wachstumsmedien ergänzt wie für den gewünschten Zelltyp erforderlich. </li></ol></li><li> Schalten Sie die Pumpe ab und lassen Sie das Zuführungsrohr und Modul wie in 3.4.1. </li><li> Nehmen Sie das Modul aus dem Modulverbinder und befestigen Modul Endkappen (Tabelle 1) vorsterilisiert in 70% Ethanol, so dass eine Seitenöffnung frei. &lt;/ Li&gt; <li> Übertragung von ~ 500 &amp; mgr; l der Zellsuspension (2x10 6 Zellen) (4.1.4) an das Modul eine 18 G Nadel und 1 ml Spritze, dabei eine Blasenbildung zu vermeiden , und nicht um die Fasern zu beschädigen. <ol><li> Verschließen Sie die Seitenöffnung mit einer Endkappe. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 2-4 h bei manueller Drehung des Moduls um 180 ° alle 5 min. Alternativ können die Module mit einem intermittierenden Mischstellung (Tabelle 1) mit einem Rohr Rotator befestigt werden. </li></ol></li><li> Nach der Aussaat, befestigen Sie eine Endkappe auf eine Injektionsöffnung (Tabelle 1) vorsterilisiert in 70% Ethanol, und befestigen Sie diese an den PTFE-verschweißte Seitenöffnung. Entfernen Sie die andere Seite Port Endkappe und langsam die Zellen ablaufen, indem Luft in die angeschlossene Injektionsöffnung unter Verwendung einer 27 G-Nadel und 1-ml-Spritze injiziert wird. <ol><li> Ersetzen Sie die Injektionsöffnung mit einer Endkappe. Füllen Sie langsam das Modul mit den Medien den freien Seitenanschluss und eine 18 G-Nadel mit einer 1 ml-Spritze. Remounter Verwendung der Modulverbinder ve die Modul Endkappen und das Modul an den Schlauch anschließen. </li></ol></li><li> Ersetzen Sie die Waschmedien-Flasche mit einem Gehalt an 50 ml Wachstumsmedium und Ergänzungen nach dem beschriebenen Verfahren in 7.5.2.1. Pumpe das Wachstumsmedium durch das System bei 800 &amp; mgr; l / Std. </li></ol> 5. Proliferation HINWEIS: Die Fasern in der Forschungssystem verwendet hier beschrieben eingestellt sind bei ~ 80 &amp; mgr; l / h Permeat, mit einem 800 &amp; mgr; l / h Beschickungsrate. <ol><li> Verwenden , um die Fasern , die die Zellen für einen Zeitraum von bis zu 7 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 eingestellt zu werden. HINWEIS: Überwachung von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten während der Wachstumsphase können nützliche Informationen über die Proliferation, metabolische Aufnahme und Ausgabe der Zellen und Nährstoff- und Metabolitenspiegel in den Medien bereitzustellen. Zum Beispiel für die Verwendung und die Laktatproduktion Glukose. Kits sind erhältlich von verschiedenen Anbietern, die diese Faktoren von Medien Quantifizieren können (siehe <strong&gt; Tabelle 1 für die in dieser Studie verwendet wurden ). Einspritzöffnungen können in das Permeat und Retentat Schlauch- und Medien über eine 27 G Nadel und Spritze und Medien aus dem Medienvorratsflasche werden können abgetastete abgetastet hinzugefügt werden. Dies gibt Nährstoff- und Stoffwechsel-Informationen für den Eingang und den beiden Ausgangsströmen. Probenahme sollte in einer Laminarbox durchgeführt werden. Sterilisieren Injektionsöffnungen vor der Probenahme durch ein Ethanol getränkten blauen Rolle gegen den Hafen hält für&gt; 30 sec. </li></ol> 6. Excision HINWEIS: Die Fasern können aus dem Modul am Ende eines Experiments zur Analyse ausgeschnitten werden. <ol><li> Ziehen Sie und die HFB abtropfen lassen. </li><li> Legen Sie ein Skalpell / Mikro Messer (Tabelle 1) Klinge zwischen dem Glas und Silikon. Schalten Sie das Modul, um das Silikon aus dem Glas wegzuschneiden. Wiederholen Sie diesen Vorgang an beiden Enden des Moduls. </li><li> Mit der Klinge Haken aus dem Silikon-Stecker an einem Ende und ziehen Sie vorsichtig. Stellen Sie sicher, dass die Fasern mit ihm gekommen. </li></ol&gt; 7. Zellanalyse <ol><li> Die Zellzahlen HINWEIS: Für die C3A in dieser Studie verwendeten Zellen beliebige Zeitpunkte innerhalb der 7-tägigen Wachstumsphase geeignet sind für die Verwendung in dieser Berechnung als Wachstumsraten im Wesentlichen nicht über die Zelldichten in diesem Zeitraum erreicht wechseln. <ol><li> Nach Exzision (§ 6), um die Fasern in PBS tauchen sie in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 0,5 ml Tris-EDTA (TE) Puffer zu waschen und schneiden. Betreff dies zu zwei Gefrier-Auftau-Zyklen in einem -80 ° C Gefrierschrank. Messen Sie den DNA - Gehalt unter Verwendung von PicoGreen und bestimmen die Zellzahlen durch diesen Wert mit einer Standardkurve verglichen , die mit dem gewünschten Zelltyp 26. </li></ol></li><li> Zellproliferationsraten <ol><li> Verwendung der Zellzahlen bei zwei unterschiedlichen Zeitpunkten berechnet berechnen, ist die spezifische Wachstumsrate μ (Gleichung 1) wobei Ln (X1) ist der natürliche Logarithmus der Zellzahl bei dem ersten Zeitpunkt und Ln (X2) der natürliche Logarithmus der Zelle Nummer am zweiten Zeitpunkt. μ = (Ln (X2) -Ln (X1)) / Zeit (Std) (1) Daraus errechnen die Bevölkerung Verdopplungszeiten (dT) (Gleichung 2) wobei μ die spezifische Wachstumsrate ist. dT = Ln2 / μ (2) </li></ol></li><li> Zellengesundheit <ol><li> Nach Exzision (§ 6), um die Fasern in PBS tauchen sie in ein 1,5-ml-Röhrchen (EDTA), die 500 &amp; mgr; l 0,05% Trypsin zu waschen und schneiden. für 10 min bei 37 ° C inkubieren. </li><li> Mischen Sie und fügen Sie 10 ul Zellsuspension zu 10 ul Trypanblau. Last 10 &amp; mgr; l auf ein Hämozytometer und zählen die Anzahl der Toten (blau) und lebendig Zellen. </li></ol></li><li> Imaging <ol><li> Nach Exzision tauchen die Fasern in PBS Schere zu waschen und verwenden sie in kleinere Längen in eine 24-Well-Platte zu schneiden. Werden 400 &amp; mgr; l 4% Paraformaldehyd (in PBS) und 20 Minuten lang bei RT inkubieren. </li><li> Waschen mit PBS von 400 Pipettieren ul ein- und ausgeschaltet. Wiederholen Sie this Schritt mit frischem PBS. </li><li> In 400 ul 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in PBS verdünnt ca. 100 ng / ml und für 20 min bei RT inkubiert. Vor Licht schützen. </li><li> Waschen mit PBS zweimal (wie 7.3.2) und einmal mit H 2 O. Fügen Sie ein Fluoreszenz Eindeckmediums die Faser und Bild zu decken sofort Daten, bevor die Proben zu sammeln, trocken (DAPI ex / em; 359/461 nm). </li><li> Nehmen Sie Bilder mit verschiedenen Brennebenen und verwenden &quot;Focus Stacking&quot; Software (zB Stack OAZ - Plugin für ImageJ, unten) ein zusammengesetztes Bild zu machen , eine stark erweiterte Schärfentiefe zeigt. Dies ist erforderlich, da die Fasern nicht flach sind. <ol><li> Herunterladen ImageJ (http://imageJ.nih.gov/ij/) und die &quot;Stack-OAZ &#39;Plugin (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/stack-focuser.html). </li><li> In ImageJ öffnen die Bilder gestapelt werden. Dann im Menü &#39;Bild&#39; gehen &#39;Stacks&#39; - &#39;Bilder zu Stack&#39;. Im Menü &#39;Plugins&#39; gehen &#39;Stack Focuser&#39;. Geben Sie einen n für nxn-Kernel. Versuch und Irrtum mit &#39;n&#39; kann erforderlich sein, um ein Bild mit wenig &quot;Rauschen&quot; zu erzeugen. Werte zwischen 11 und 77 sind in der Regel gut zu funktionieren. </li></ol></li></ol></li><li> Albuminsekretion ANMERKUNG: Dies ist ein Hepatozyten-Zellfunktionstest und keine allgemeine Test der Zellfunktion. <ol><li> Samenzellen (HepG2 / C3A) auf 2D auf Gewebekulturkunststoff 10.667 / cm 2 und für 6 Tage gezüchtet. Seed HFBS, wie in Abschnitt 4 beschrieben und wachsen für 6 Tage. </li><li> Im Anschluss an diese Proliferation Zeit der Kulturmedien ändern (EMEM + 10% FBS, 1x Glutamin &amp; 1x Penicillin / Streptomycin) für die Gewebekultur Kunststoff und HFB einem Serum Medien kostenlos Williams E ergänzt mit 1x Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin 24 h: <ol><li> Lassen Sie den Schlauch und HFB-Modul nach den Schritten in 3.4.1. Lösen Sie die Vorratsflasche und ersetzen Sie diese mit einer Flasche, die Williams E Medium enthält. Pumpe dies durch die HFB 800 &amp; mgr; l / h. </li></ol></li><li> Nach 24 Stunden, nehmen Medienproben. Quantifizierung sezernierten Albumins durch ELISA nach den Anweisungen des Herstellers (Tabelle 1). Verdünnte Medienproben 1 in 10 bis 1 in 40 vor dem Gebrauch um Albuminkonzentrationen innerhalb des Bereichs der Standardkurve zu bringen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lewis, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evidence+in+support+of+the+theory+of+outgrowth+of+the+axis+cylinder.">Experimental evidence in support of the theory of outgrowth of the axis cylinder.</a> American J Anat. 6 (1), 461-471 (1906).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+peripheral+nerve+fibers+in+altered+surroundings.">The development of peripheral nerve fibers in altered surroundings.</a> Wilhelm Roux Arch Entwickl Mech Org. 30 (2), 15-33 (1910).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+Embryonic+Stem+Cell+identity.">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for Embryonic Stem Cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4 (5), 403-415 (2009).</li><li>Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+tissue+engineering+-In+vivo+and+in+vitro+applications.">Skin tissue engineering -In vivo and in vitro applications.</a> Adv Drug Deliv Rev. 63 (4), 352-366 (2011).</li><li>Sinden, J. D., Vishnubhatla, I., Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+for+stem+cell-derived+therapy+in+stroke.">Prospects for stem cell-derived therapy in stroke.</a> Prog Brain Res. 201, 119-167 (2012).</li><li>Ouyang, A., Yang, S. -. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-stage+perfusion+fibrous+bed+bioreactor+system+for+mass+production+of+embryonic+stem+cells.">A two-stage perfusion fibrous bed bioreactor system for mass production of embryonic stem cells.</a> Expert Opin Biol Ther. 8 (7), 895-909 (2008).</li><li>Carnachan, R. J., Bokhari, M., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taloring+the+morphology+of+emulsion-templated+porous+polymers.">Taloring the morphology of emulsion-templated porous polymers.</a> Soft Matter. 2 (7), 608-616 (2006).</li><li>Deshpande, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+corneal+surface+regeneration+using+a+biodegradable+synthetic+membrane+and+limbal+tissue+explants.">Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants.</a> Biomaterials. 34 (21), 5088-5106 (2013).</li><li>Storm, M. P., Orchard, C. B., Bone, H. K., Chaudhuri, J. B., Welham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+for+the+expansion+of+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Three-dimensional culture systems for the expansion of pluripotent embryonic stem cells.</a> Biotechnol Bioeng. 107 (4), 683-695 (2010).</li><li>Wung, N., Acott, S. M., Tosh, D., Ellis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+fibre+membrane+bioreactors+for+tissue+engineering+applications.">Hollow fibre membrane bioreactors for tissue engineering applications.</a> Biotechnol Lett. 36 (12), 2357-2366 (2014).</li><li>Ellis, M., Jarman-Smith, M., Chaudhuri, J. B., Chaudhuri, J., Al-Rubeai, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+systems+for+tissue+engineering:+A+four-dimensional+challenge.">Bioreactor systems for tissue engineering: A four-dimensional challenge.</a> Bioreactors for tissue engineering; principles, design and operation. , 1-18 (2005).</li><li>Silva, A. I., Mateus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+polysulfone+hollow+fibre+vascular+bio-artificial+pancreas+device+for+in+vitro+studies.">Development of a polysulfone hollow fibre vascular bio-artificial pancreas device for in vitro studies.</a> J Biotechnol. 139 (3), 236-249 (2009).</li><li>De Bartolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+functions+in+a+crossed+hollow+fiber+membrane+bioreactor.">Human hepatocyte functions in a crossed hollow fiber membrane bioreactor.</a> Biomaterials. 30 (13), 2531-2543 (2009).</li><li>Schmelzer, E., Finoli, A., Nettleship, I., Gerlach, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+three-dimensional+perfusion+culture+of+human+adult+bone+marrow+mononuclear+cells+in+bioreactors.">Long-term three-dimensional perfusion culture of human adult bone marrow mononuclear cells in bioreactors.</a> Biotechnol Bioeng. 112 (4), 801-810 (2015).</li><li>Tapia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+human+influenza+A+virus+with+adherent+and+suspension+MDKC+cells+cultured+in+a+single-use+hollow+fiber+bioreactor.">Production of high-titer human influenza A virus with adherent and suspension MDKC cells cultured in a single-use hollow fiber bioreactor.</a> Vaccine. 32 (8), 1003-1011 (2014).</li><li>Deng, X., Zhang, G., Shen, C., Yin, J., Meng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+fiber+culture+accelerates+differentiation+of+Caco-2+cells.">Hollow fiber culture accelerates differentiation of Caco-2 cells.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 97 (15), 6943-6955 (2013).</li><li>Schutte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+primary+hepatocytes+show+enhanced+performance+and+sensitivity+to+acetaminophen+during+three-dimensional+culture+on+a+polystyrene+scaffold+designed+for+routine+use.">Rat primary hepatocytes show enhanced performance and sensitivity to acetaminophen during three-dimensional culture on a polystyrene scaffold designed for routine use.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 475-486 (2011).</li><li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+device+enabling+three-dimensional+cell+growth+and+improved+cell+function.">Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function.</a> Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).</li><li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+HepG2+liver+cells+on+three+dimensional+polystyrene+scaffolds+enhances+cell+structure+and+function+during+toxicological+challenge.">Culture of HepG2 liver cells on three dimensional polystyrene scaffolds enhances cell structure and function during toxicological challenge.</a> J Anat. 211 (4), 567-576 (2007).</li><li>Vivares, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+behaviour+and+metabolic+capacity+of+cryopreserved+human+primary+hepatocytes+cultivated+in+a+perfused+multiwell+device.">Morphological behaviour and metabolic capacity of cryopreserved human primary hepatocytes cultivated in a perfused multiwell device.</a> Xenobiotica. 45 (1), 29-44 (2015).</li><li>Smith, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+stem+cell-derived+cultures+in+three-dimensional+substrates+form+spontaneously+functional+neuronal+networks.">Human neural stem cell-derived cultures in three-dimensional substrates form spontaneously functional neuronal networks.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2015).</li><li>Davidson, A. J., Ellis, M. J., Chaudhuri, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+theoretical+approach+to+Zonation+in+a+bioartificial+liver.">A theoretical approach to Zonation in a bioartificial liver.</a> Biotechnol Bioeng. 109 (1), 234-243 (2012).</li><li>Mulder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The basic principles of membrane technology. 2nd ed. , (1996).</li><li>Ellis, M. J., Chaudhuri, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(lactic-co-glycolic+acid)+hollow+fibre+membranes+for+use+as+a+tissue+engineering+scaffold.">Poly(lactic-co-glycolic acid) hollow fibre membranes for use as a tissue engineering scaffold.</a> Biotechnol Bioeng. 96 (1), 177-187 (2007).</li><li>Shearer, H., Ellis, M. J., Perera, S. P., Chaudhuri, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+common+sterilization+methods+on+the+structure+and+properties+of+poly(D,L+lactic-co-glycolic+acid)+scaffolds.">Effects of common sterilization methods on the structure and properties of poly(D,L lactic-co-glycolic acid) scaffolds.</a> Tissue Eng. 12 (10), 2717-2727 (2006).</li><li>Forsey, R. W., Chaudhuri, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validity+of+DNA+analysis+to+determine+cell+numbers+in+tissue+engineering+scaffolds.">Validity of DNA analysis to determine cell numbers in tissue engineering scaffolds.</a> Biotechnol Lett. 31 (6), 819-823 (2009).</li><li>Williamson, M. R., Coombes, A. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+spinning+of+polycaprolactone+fibres+for+applications+in+tissue+engineering.">Gravity spinning of polycaprolactone fibres for applications in tissue engineering.</a> Biomaterials. 25 (3), 459-465 (2004).</li><li>El-Salmawy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+properties+of+pronectin+F-coated+biodegradable+hollow+fibres.">Preparation and properties of pronectin F-coated biodegradable hollow fibres.</a> J Artif Organs. 8 (4), 245-251 (2005).</li><li>Meneghello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+characterization+of+poly(lactic-co-glycolic+acid)/polyvinyl+alcohol+blended+hollow+fibre+membranes+for+tissue+engineering+applications.">Fabrication and characterization of poly(lactic-co-glycolic acid)/polyvinyl alcohol blended hollow fibre membranes for tissue engineering applications.</a> J Memb Sci. 344 (1-2), 55-61 (2009).</li></ol>

MJE is a founder and director of Cellesce Ltd which aims to provide bioprocessing solutions for tissue engineering-based research and industry.

Dieses Manuskript beschreibt den Aufbau und den Betrieb eines Hohlfaser-Bioreaktor (HFB) System für Säugetierzellkultur und ihre Nützlichkeit in wuchernden die Hepatozyten-Zelllinie HepG2 / C3A demonstriert. Das System ist auf dem Regal eines Standard-Inkubator und seine Set-up zu passen ist einfach genug, um von einer zuständigen Zellbiologe vertraut mit aseptischer Technik durchgeführt werden. Die Fasern in der Forschungssystem verwendet hier beschriebenen in Haus durch Phaseninversions Schleuderguß (Spinnen) hergestellt, das eine nicht-bioabbaubare proprietären Polymer verwendet. Es ist möglich, Fasern zu bilden, indem aus einer Vielzahl von geeigneten Materialien für die Zellkultur Spinn sowohl biologisch abbaubare und nicht biologisch abbaubar, beispielsweise; Polycaprolacton (PCL) 27, Poly-L-lactid Säure (PLLA) 28, Poly (milch-co-glykolsäure) (PLGA) 29, Polysulfon (PSU) 12 und Polyetheretherketon (PEEK) 13. Jeder hat unterschiedliche Eigenschaften einnd sollte basierend auf den Bedürfnissen des Systems gewählt werden. Überprüfen Sie die Kompatibilität der verwendeten Faser mit dem Ethanol in der Sterilisationsschritt verwendet wird. PLGA ist bekannt , mit Ethanol erfordert eine alternative Behandlung , wie Antibiotika / Antimykotika - Lösung 25 bis plastifizieren. Die Abmessungen der Glasmodule hier verwendet wurden, basierend auf den Anforderungen der aktuellen Forschung ausgewählt. Verschiedene Größen können von jedem seriösen Glasbläserei hergestellt werden. Eine Betrachtung in Modulgröße ist die Anzahl der Zellen, die auf die Anzahl der Fasern in dem Modul und wahrscheinlich Strömungsraten verbunden ist. Je mehr Zellen gibt es in dem Modul je höher die Strömungsraten, um sein müssen am Ausströmende des Bioreaktors günstige Kulturbedingungen zu halten. Dies wird eine Grenze, wie irgendwann erreichen und einige Versuch und Irrtum kann mit der Überwachung von Medienbedingungen im Modul Permeat erforderlich. Mathematische Modellierung kann einige Einblicke in die gewünschte Modul Dimen bietensionen und Strömungsgeschwindigkeiten 22. Die Abmessungen der Vorrichtung hier verwendet wird, ausgelegt auf einen Inkubator Regal zu passen. Die Länge des Rohres wird durch die Länge diktiert, während auch ermöglicht genügend Bewegung von Komponenten für die Einrichtung und den Betrieb zwischen den Anschlüssen zu ermöglichen, benötigt zu erreichen. Wenn Zeitverlauf Abtastung erforderlich ist, beispielsweise bei der Überwachung von Medienbedingungen in dem Modul durchdringen kann Einblasöffnungen zum Retentat zugegeben werden und Permeatleitungen dies zu erleichtern. Eine Voraussetzung für jede Zellkultursystem ist wachsende Zellen am Leben und in den meisten Fällen zu halten. Im Lichte der Studien eine in vivo -ähnlichen Phänotyp in Zellen gewachsen in 3D - Kultursystemen demonstrieren scheint es auch wichtig , eine Umgebung zu schaffen , die eng an die in vivo - Umgebung durch die Zellen angetroffen nachahmt. Dieser letzte Punkt wird häufig in 2D-Zellkultur zugunsten der Einfachheit halber wird dieser Kultursystem bietet vernachlässigt. Ter HFB - Mimetika in vivo Kapillarnetzwerke von Nährstoffen zu den Zellen durch das Lumen der Fasern liefert. Die Abfallprodukte werden ebenfalls von dem System durch den dynamischen Strom entfernt. Dadurch entsteht ein in vivo -ähnlichen System für die Zellkultur und einer, die in vivo - Umgebung eng nachahmt von Hepatozyten zu sehen ist , dieses System eine bessere Wahl zu machen im Vergleich zu Kulturkunststoff 2D - Gewebe für diese Zellen kultiviert werden . Dies wird durch die Tatsache untermauert, die Zellen sezer 15-fachen der Menge an Albumin, eine wichtige Leberfunktion, in der HFB Kultursystem im Vergleich zu denen auf Kulturkunststoff 2D-Gewebe gezüchtet. Während das HFB - System die meisten , wenn nicht alle Verankerung abhängige Zelltypen geeignet ist, ist das Beispiel hier für Hepatozyten , weil es einen echten Bedarf an Kultur zu können ist funktionell, mehr in vivo -ähnlichen Hepatozyten für die Verwendung in der Arzneimittelentwicklung von der Pharmaindustrie und in bioartifiziellen Leber Geräte für die extrakorporale Unterstützungvon Leberversagen Patienten. Der Bedarf an funktioneller Zellen erstreckt sich über diese Beispiele, insbesondere auf dem Gebiet der regenerativen Medizin in eine Phase der translationalen Arbeit eintritt. Die Vorteile einer in - vivo - -ähnlichen Kulturumgebung sollte nicht übersehen werden.

Gewebekultur ist eine etablierte Technik für das Wachstum und / oder die Wartung von Zellen , die 1,2 seit über 100 Jahren verwendet worden. Die Bequemlichkeit des Studierens Zellen und Antworten ex vivo Experimenten hat weitreichende Vorteile , so dass die sonst sehr schwierig sein würde , wenn nicht unmöglich, beispielsweise die Erzeugung gentechnisch veränderter Zellinien und die Verwendung von Reporterzellen in Hochdurchsatzscreening - Assays 3. In jüngerer Zeit Gewebekultur hat zu dem Gebiet des Tissue Engineering gegeben, für die Erzeugung von in vitro - Modellen und regenerative Medizin. Mit diesen Anwendungen Interesse an dynamischen 3-dimensionale (3D) Kultursysteme ist deutlich gewachsen. 3D - Kulturmethoden (hier definiert als 3D - Kultursubstrat und / oder die Einführung von dynamischen Richtungsfluss) besser rekapitulieren die Architektur der in vivo zellulären Umgebung, wichtig für eine Erreichungphysiologischere artige Funktion. Die Fähigkeit, zu extrahieren, zu wachsen, zu differenzieren und Transplantation Zellen mit dem Ziel, kranken und beschädigtes Gewebe zu reparieren ist ein Bereich der Studie, die ein großes Potenzial für Patienten Nutzen und kommerziellen Chancen hat. Beispielsweise die Verwendung von autologer Keratinozyten zur Behandlung von Verbrennungen (siehe 4) und die Verwendung von zellbasierten Therapien zur Behandlung von Schlaganfall (siehe 5). Ebenso erstreckt sich der Markt für in - vitro - Modellen der Wirkstoffforschung zu geschichtete medizinische Anwendungen. Die Konvention in der Gewebekultur ist das Wachstum von adhärenten oder Verankerung abhängige Zelltypen auf dem 2-dimensionalen (2D) Oberfläche einer Gewebekulturflasche. Während derzeit als Goldstandard in einem Forschungs Einstellung akzeptiert, hat kürzlich Interesse an der Tissue - Engineering - Anwendungen die Tatsache hervorgehoben , dass die aktuellen 2D - Gewebekulturumgebung für die erforderliche Scale-up in der Zellproduktion 6 unzureichend ist. Für adhärenten Zelltypen eine scaffold ist erforderlich, die auf Endanwendung variieren je, sowohl in Bezug auf die chemische Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften. Einige Systeme verwenden Gerüste sowie Platteneinsätzen aus hochporösen Matrix , die aus hohen inneren Phasenemulsion Templat gebildet (siehe 7) oder elektrogesponnenen Fasern (siehe 8) mit minimaler Anpassung von herkömmlichen 2D - Kulturtechniken. Die Zellen können auf Mikroträgern unterschiedlicher Zusammensetzung ausgesät werden und in Rührkessel gezüchtet , das 9 Nährstoffen und Signalmoleküle und wegtragen Abfallprodukte (Massentransport) durch eine dynamische und gemischte Umgebung liefern. Jedoch sind diese Systeme in ihrer in vivo -ähnlichen Umgebung beschränkt und weitere Verbesserungen hinsichtlich Kosten hergestellt werden maßstäblich-up. Hohlfaser - Bioreaktoren (HFBS) sind eine 3D - Kultursystem , das mit Zellen von Fasern in ein Modul befestigt bestehen typischerweise an der Außenseite der porösen Fasern ausgesät und Medien durch die Faserlumen abgegeben (Übersicht in 10) (Abbildung 1). HFBS bieten eine in vivo -ähnlichen Umgebung mit den Fasern Blutkapillaren und Abschirmen der Zellen von den Scherspannungen , die mit dynamischen Medienzuführungs nachahmt, während gleichzeitig definierten Scher an Zellen die über eine Fluidströmung durch die Seitenanschlüsse angelegt werden , falls gewünscht. Dies schafft eine vielseitige Kultursystem mit überlegenen Massentransport in dem hohe Zelldichten 11 erreicht werden kann. Das HFB - System ist gut geeignet für die Pflege von verankerungsabhängigen Zelltypen und wurde zur Kultur eine Vielzahl von Zellen , einschließlich Rattenpankreas Langerhans&#39;schen Inseln 12, Maus β-TC-3 - Insulinom - Zelllinie 12, primäre humane Hepatozyten 13, menschlichen Knochen verwendet worden , marrow mononukleären Zellen 14, Madin Darby Hundenierenzellen (MDCK) 15 und Caco-2 - Zellen 16 ein paar zu nennen. Zusätzlich zu den Systemvorteile der Massentransfer und Scale-up, gezüchteten Zellen in 3D tissue Kultursysteme sind in der Regel in vivo -like in Morphologie und stärker auf experimentelle Hinweise zu sein. Beispielsweise Ratten primären Hepatozyten zeigen eine quaderförmige Morphologie, erhöhte Lebensfähigkeit, größere Induktion von Cytochrom-P450 - Enzymaktivität und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Paracetamol Toxizität , wenn sie in einem handelsüblichen Polystyrolgerüst Vergleich zu Zellen in Kultur 2D 17 angebaut. Mit dem gleichen Gerüst der hepatocarcinoma Zelllinie auch eine zu erhöhen Albuminproduktion 18 und zeigen in vivo -ähnlichen Reaktion auf Methotrexat im Vergleich zu 2D - kultivierten Zellen 19 gezeigt HepG2 wurde. Primäre humane Hepatozyten zeigten verzögerte Entdifferenzierung, höhere Cytochrom-P450 - Aktivität und erhöhte Clearance für 4/5 Verbindungen in einem Perfusionskultursystem getestet 20. Menschliche neurale Stammzellen abgeleiteten Neuronen und Glia kultiviert in einem handelsüblichen Polystyrolgerüst zeigten beide hoch (Aktionspotential) und Nieder frequency (lokale Feldpotential) spontane Aktivität während keine wurde die neuronale Aktivität in den 21 kultivierten Zellen 2D nachgewiesen. Caco-2 - Zellen zeigten eine verbesserte Differenzierung in einer HFB Vergleich zu 2D - Kultur durch erhöhte alkalische Phosphatase gemessen, γ-Glutamyltransferase und P-Glycoprotein - Aktivität und eine höhere Expression von F-Actin und zona occludens-1 - Protein 16. Trotz der Vorteile, andere die Routine Kultivierung von Zellen in Systemen als eine 2D-Gewebekulturflasche Oberfläche ist immer noch nicht in vielen Labors praktiziert wird, obwohl die Anzahl von Veröffentlichungen zitiert 3D-Zellkultur wächst (8-fachen Anstieg in den letzten 10 Jahren. Quelle : PubMed Werkzeug &quot;Ergebnisse von Year &#39;sondiert mit&quot; 3D-Kultur &quot;). Dieses Manuskript beschreibt den Aufbau und Betriebsbedingungen eines HFB System für Säugerzellkultur und zeigt ihre Nützlichkeit der hepatocarcinoma HepG2 / C3A in die Kultivierung. Das Ziel dieser Methode ist es, die Zellen in Kultureine in vivo -ähnlichen Kultursystem , das genügend Einfachheit behält , um sie zugänglich neue für diejenigen, die auf 3D - Kultursystemen. Das Grundprinzip hinter HFBS in der Anwendung beschreiben hier, was die Vorhersagbarkeit der Leber Modelle zu verbessern , ist , dass es theoretisch möglich ist , eine hepatische sinusoid innerhalb der HFB - Umgebung 22 zu imitieren. Dies ist derzeit nicht möglich, mit anderen Kultursystemen.

<table><tbody><tr><td>Glass HFB Module</td><td>Soham Scientific</td><td>&amp;nbsp;---&amp;nbsp;</td><td>Custom Item. (Section 2)</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>(Section 2.1)</td></tr><tr><td>Silicoset 151</td><td>Intertronics</td><td>ACCSS151</td><td>Silicone Glue. (Section 2.3)</td></tr><tr><td>PTFE tape</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z104388</td><td>(Section 2.5)</td></tr><tr><td>Reservoir bottle</td><td>Fisher</td><td>11972619</td><td>PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5&amp;nbsp;cm section of the supplied PTFE tubing under the 1&amp;nbsp;mm adapter and a 4&amp;nbsp;cm section under the 3&amp;nbsp;mm adapter. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>Q-series cap</td><td>Kinesis</td><td>00932Q-3V</td><td>PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5&amp;nbsp;cm section of the supplied PTFE tubing under the 1&amp;nbsp;mm adapter and a 4&amp;nbsp;cm section under the 3&amp;nbsp;mm adapter. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>Adapter, Male, 1.0&amp;nbsp;mm ID</td><td>Kinesis</td><td>008NB10-KD5L</td><td>PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5&amp;nbsp;cm section of the supplied PTFE tubing under the 1&amp;nbsp;mm adapter and a 4&amp;nbsp;cm section under the 3&amp;nbsp;mm adapter. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>Adapter, Male, 3.0&amp;nbsp;mm ID</td><td>Kinesis</td><td>008NB30-KD5L</td><td>PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5&amp;nbsp;cm section of the supplied PTFE tubing under the 1&amp;nbsp;mm adapter and a 4&amp;nbsp;cm section under the 3&amp;nbsp;mm adapter. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>Fitting Nut</td><td>Kinesis</td><td>U-350</td><td>PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5&amp;nbsp;cm section of the supplied PTFE tubing under the 1&amp;nbsp;mm adapter and a 4&amp;nbsp;cm section under the 3&amp;nbsp;mm adapter. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>Neoprene tubing</td><td>Fisher</td><td>10366344</td><td>Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the &#039;fitting nut&#039;. Attach a 2x 30&amp;nbsp;mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3&amp;nbsp;cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3&amp;nbsp;mm ID adapter. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>HEPA-vent</td><td>Fisher</td><td>11374634</td><td>Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the &#039;fitting nut&#039;. Attach a 2x 30&amp;nbsp;mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3&amp;nbsp;cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3&amp;nbsp;mm ID adapter. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>Y-connector, barbed</td><td>Cole Parmer</td><td>OU-06295-10</td><td>Attach the Hepa filter to 6&amp;nbsp;cm of neoprene tubing and attach this to the &#039;fitting nut&#039;. Attach a 2x 30&amp;nbsp;mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3&amp;nbsp;cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3&amp;nbsp;mm ID adapter. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>L/S16 Silicone tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>OU-96410-16</td><td>Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the &#039;fitting nut&#039;. Attach a 2x 30&amp;nbsp;mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3&amp;nbsp;cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3&amp;nbsp;mm ID adapter. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>L/S14 Silicone tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>WZ-96410-14</td><td>Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the &#039;fitting nut&#039;. Attach a 2x 30&amp;nbsp;mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3&amp;nbsp;cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3&amp;nbsp;mm ID adapter. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>L/S13 Silicone tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>OU-96410-13</td><td>80&amp;nbsp;cm to connect the 1.0&amp;nbsp;mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>WM 205U/CA pump</td><td>Fisher</td><td>1248-6300</td><td>(Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25&amp;nbsp;mm bore</td><td>Fisher</td><td>12416310</td><td>PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>Adapter, Male, 1.0&amp;nbsp;mm ID</td><td>Kinesis</td><td>008NB10-KD5L</td><td>PTFE the screw thread of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>Adapter, Female, 1.0&amp;nbsp;mm ID</td><td>Kinesis</td><td>008NB10-KD2L</td><td>PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1)</td></tr><tr><td>Female Luer cap</td><td>Cole Parmer</td><td>WZ-45508-64</td><td>Side port end caps. (Section 3.2.2)</td></tr><tr><td>L/S13 Silicone tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>OU-96410-13</td><td>40&amp;nbsp;mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2)</td></tr><tr><td>L/S16 Silicone tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>OU-96410-16</td><td>3x 30&amp;nbsp;mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2)</td></tr><tr><td>Barbed reducer 1/8&quot;x1/16&quot;</td><td>Cole Parmer</td><td>30616-43</td><td>3x 30&amp;nbsp;mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2)</td></tr><tr><td>L/S13 Silicone tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>OU-96410-13</td><td>55&amp;nbsp;cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4)</td></tr><tr><td>L/S13 Silicone tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>OU-96410-13</td><td>45&amp;nbsp;cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4)</td></tr><tr><td>Straight barbed union</td><td>Cole Parmer</td><td>WZ-30612-43</td><td>Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4)</td></tr><tr><td>Clamp</td><td>VWR</td><td>229-0609</td><td>(Section 3.4.2)</td></tr><tr><td>4&amp;nbsp;mm Silicone tubing</td><td>Fisher</td><td>FB68858</td><td>Fold over a 40&amp;nbsp;mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3)</td></tr><tr><td>Cable tie</td><td>Fisher</td><td>12326377</td><td>Fold over a 40&amp;nbsp;mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3)</td></tr><tr><td>MACSmix tube rotator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-753</td><td>An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4)</td></tr><tr><td>Leur Injection port</td><td>Thistle Scientific</td><td>IB-10820</td><td>Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5)</td></tr><tr><td>Female Luer cap</td><td>Cole Parmer</td><td>WZ-45508-64</td><td>Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5)</td></tr><tr><td>L-lactic acid kit</td><td>Megazyme</td><td>K-LATE</td><td>(Section 5)</td></tr><tr><td>D-glucose kit</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td>(Section 5)</td></tr><tr><td>Scalpel / micro knife</td><td>InterFocus</td><td>10315-12</td><td>(Section 6.2)</td></tr><tr><td>Albumin ELISA</td><td>Bethyl Labs</td><td>E80-129</td><td>(Section 7.4.3)</td></tr></tbody></table>

hollow fiber bioreactors for in vivo-like mammalian tissue culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.

Zellaussaat ist ein kritischer Schritt. Die Fähigkeit von Zellen an der Faser in einem 3D-Set-up anhaften ist erheblich geringer als die für die 2D-Gewebekulturkunststoff gesehen. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der reduzierten Kontaktzeit zwischen Zelle und Substrat. In der HFB fallen die Zellen durch das Modul während der statischen Phasen der Aussaat. Diese sind wesentlich kürzer in der Zeit im Vergleich zu der kontinuierlichen statischen Phase verwendet in 2D. Zellen haben Verbindungen mit dem Substrat in dieser Zeit zu machen. Zusätzlich aufgrund der gekrümmten Natur der Fasern gibt es keine flache Oberfläche für die Zellen zur Ruhe und Verbindungen herzustellen, wie es in 2D Kultur. Während dies durch die Chemie der Faser vermischt werden können eingesetzt wissen wir dies nicht der Fall für das Polymer in dieser Studie verwendet werden (Daten nicht gezeigt). Erhöhen der Aussaat Zeit und Zellansiedlungsdichte führt zur Bildung von Zellaggregaten, die während der statischen Phasen mit einer schnelleren r durch das Modul fallenaß als einzelne Zellen und verringert die Kontaktzeit zwischen den Zellen und dem Substrat. Führt eine Erhöhung der Zeit auch zu einer Vergilbung der Medien, da es eine hohe Dichte von Zellen und keine Medienaustausch während dieses Schrittes ist. Unter Verwendung der in Abschnitt 4 Zellsaat Raten beschriebenen Bedingungen von ~ 15% sind konsistent mit den HepG2 / C3A - Zellen (5A) erreicht. Während dies ein geringer Bruchteil angesehen werden kann gibt es genügend Zellen gut besiedelte Fasern in wenigen Tagen zu erzeugen (Figuren 5B und 6); im Anschluss an eine Sieben-Tage - Proliferationsperiode die Zelldichte in der HFB erreicht nähert 3x10 5 / cm 2. Dies ist eine geeignete Dichte für viele Assays Hepatozyten verwendet und können berücksichtigt werden Konfluenz zu erreichen. Die Proliferationsraten in der HFB erreicht sind langsamer , wenn der in 2D - Zellkultur (5C) erreicht verglichen. Dies ist unwahrscheinlich durch den Verlust von Zellen in der dynamischen Strömung des Systems sein, wie Zellzahlen in den Medien gering sind (mittlere ± SEM: 20.343 Zellen ± 3.674 Zellen pro 24 Stunden bei Konfluenz, die 4% der gesamten Zellen ist), und dies nicht erhöht, wenn die Durchtrittsrate von bis zu 400 &amp; mgr; l / h eingeschaltet wird (Daten nicht gezeigt). Es ist auch unwahrscheinlich , aufgrund einer Abnahme der Lebensfähigkeit und nachfolgenden Verlust von Zellen zu sein (siehe Figur 5D und unten). Es kann erklärt werden, zumindest teilweise durch die Tatsache diese Zellinie HepG2 klonal aus und ausgewählt auf seine Fähigkeit, abgeleitet Kontakt Hemmung der Zellproliferation zu zeigen. Die Zellen in der HFB werden bei 6x die Dichte der 2D-Zellen beimpft, die zu einer langsameren Proliferationsraten führen kann. Viability bleibt während der HFB mit Zellen zeigen,&gt; 90% hoch. Zwar gibt es eine leichte Abnahme der Lebensfähigkeit am Austrittsende gegenüber dem Einlass wurde dies nicht signifikant (t-Test p gefunden<html> = 0,22). Überwachung der Glucoseverbrauch und die Milchsäureproduktion hat die Medienvorschubgeschwindigkeit und Medienvolumen in dem System zum Abstimmen verwendet. Mit 800 &amp; mgr; l / h und einem Gesamtmediavolumen von 50 ml der Glucose und Milchsäurespiegel oben gehalten werden, und unten (jeweils) die in Standard-Gewebekultur-Plastik Kultur. Albumin-Sekretion ist ein Schlüsselleberfunktion durch Hepatozyten durchgeführt. Es wird in das Serum sezerniert, wo sie mehrere Rollen in den Bereichen Verkehr und Homöostase spielt. Das Albumin - Sekretion durch in der HFB gewachsenen Zellen ist 15-fach höher als die in Zellen , die auf 2D (Abbildung 7) angebaut. Dies zeigt, die Zellen sind funktionell in der HFB und zumindest im Fall von Albumin-Sekretion, wird diese Funktion in der HFB erhöht. jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Die in vivo -ähnlichen Umgebung eines HFB. Die Zellen werden auf die Außenseite der porösen Fasern beimpft. Das Medium wird durch das Faserlumen abgegeben, eine Blutkapillare nachahmt. (A) Längsschnitt einer Faser (nicht maßstäblich). (B) Querschnitt eines 3 Faserreaktor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53431/53431fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die HFB - Modul. (A) Die Abmessungen des Moduls in dieser Studie verwendet. Die Abmessungen wurden so gewählt, 3 Fasern zu passen und auf die Bedürfnisse des aktuellen Forschungsprojekt zu erfüllen. Verschiedene Größen können für einzelne Systeme und Fasern hergestellt und angepasst werden. (B) Eine Fotografie des mODUL mit angeschlossenem Endkappe und Modulanschlüsse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53431/53431fig3.jpg" /> Abbildung 3. Modulfertigung. (A) Die Fasern werden auf Größe geschnitten und in das Modul eingefügt. (B) Die Fasern werden in das Modul verklebt, trocknen gelassen. (C) Die Enden sind geschnitten bündig mit dem Glas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53431/53431fig4.jpg" /> Abbildung 4. HFB System Set-up. Die Pfeile zeigen die Richtung der Medienfluss. Rot = Zuführungsrohr. Gelb = Pumpe tuSein. Weiß = HFB-Modul. Grün = Retentat Rohr mit Klemme. Blau = Permeatrohr. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53431/53431fig5.jpg" /> Abbildung 5. Seeding, Proliferation, Lebensfähigkeit und biochemische Analyse. (A) Prozent der Zellen ausgesät. Schwarze Diamanten repräsentieren einzelne HFBS. Der rote Balken ist der Mittelwert. (B) Zellen Dichten bei Aussaat und nach einer 7 - tägigen Proliferationsperiode. 2D-Zellzahlen wurden durch Trypsinierung bestimmt und das Zählen unter Verwendung eines Hämozytometers. HFB Zellzahlen wurden unter Verwendung des PicoGreen bestimmt Assay und eine Standardkurve erzeugt aus C3A - Zellen 26. n = 5-6. Balken = SEM. (C) Bevölkerung Verdopplungszeiten. n = 5-7. Balken = SEM. (D) Viability von tryp bestimmtein Blau-Ausschluss am Ende einer 7-tägigen Proliferation. Inlet, zentrale und Auslass repräsentieren Regionen innerhalb der HFB. n = 3-5. Balken = SEM. (E &amp; F) Glukoseverbrauch und Milchsäureproduktion. Niveaus wurden an der Vorratsflasche (Einlass) überwacht sowie das Retentat und Permeat-Auslässe und Routinekultur auf Gewebekulturkunststoff compered (media geändert am Tag 3 und 5). n = 3-5. Balken = SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53431/53431fig6.jpg" /> Abbildung 6 Bilder von auf Fasern in einer HFB gezüchteten Zellen. Die Zellen wurden ausgesät und für 48 Stunden gezüchtet , bevor Fasern herausgeschnitten wurden, in PBS gewaschen, fixiert in 4% Paraformaldehyd in PBS gewaschen und Kerne mit DAPI gefärbt. Jedes Bild ist ein Verbund aus 12 &#39;gestapelt Focus&#39; images, um die Tiefenschärfe des resultierenden Bildes zu erhöhen. Bereiche mit höherer und niedrigerer Zelldichte entlang der Faser zu diesem Zeitpunkt und gezeigt gefunden. Wo vorhanden Faser Grenzen sind mit einem roten Strichlinie bezeichnet. Bilder wurden auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop entnommen. Bild = 10X-Objektiv. Bar = 200 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/53431/53431fig7.jpg" /> Abbildung 7. Albumin - Sekretion. Die Zellen wurden auf Gewebekulturkunststoff ausgesät bei 10.667 / cm 2 und in der HFB , wie in Kapitel 4. Zellen für 6 Tage stark vermehrt wurden. Im Anschluss an diese Proliferation Zeit wurde die Gewebekultur Kunststoff und HFB Kulturmedien für einen Serum-freiem Williams E Medium mit Glutamin und Penicillin / streptomyci ergänzt geändertn für 24 Stunden. Medienproben wurden entnommen und ein Albumin durch ELISA quantifiziert gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle 1). n = 5-6. Balken = SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53431/53431fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Abschnitt </td><td> Name der Ausrüstung </td><td> Unternehmen </td><td> Katze. Nein. </td><td> Notizen </td><td> Bilder </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Glass HFB-Modul </td><td> Soham Scientific </td><td> --- </td><td> Benutzerdefinierte Artikel. </td><td rowspan="4"></td></tr><tr><td> 2.1 </td><td> Sigmacote® </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> SL2 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> Silicoset 151 </td><td> Intertronics </td><td> ACCSS151 </td><td> Silicein Kleber. </td></tr><tr><td> 2.5 </td><td> PTFE-Band </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z104388 </td><td></td></tr><tr><td rowspan="15"> 3.2.1 </td><td> Vorratsflasche </td><td> Fischer </td><td> 11972619 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Q-Serie Kappe </td><td> Kinesis </td><td> 00932Q-3V </td><td rowspan="4"> PTFE die Schraubgewinde der Adapter und Überwurfmutter. Montage an der Q-Serie Kappe. Schließen Sie einen 8,5 cm langen Abschnitt des mitgelieferten PTFE-Schlauch unter dem 1-mm-Adapter und ein 4 cm Abschnitt unter der 3-mm-Adapter. </td><td rowspan="4"><img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/53431/53431tablefig1.jpg" /></td></tr><tr><td> Adapter, männlich, 1,0 mm ID </td><td> Kinesis </td><td> 008NB10-KD5L </td></tr><tr><td> Adapter, männlich, 3,0 mm ID </td><td> Kinesis </td><td> 008NB30-KD5L </td></tr><tr><td> Fitting Nuss </td><td> Kinesis </td><td> U-350 </td></tr><tr><td> Neopren-Schlauch </td><td>Fischer </td><td> 10366344 </td><td rowspan="5"> Bringen Sie den Hepa-Filter bis 6 cm aus Neopren Schlauch und befestigen Sie diese auf die &quot;Überwurfmutter&quot;. Bringen Sie ein 2x 30 mm Abschnitte L / S14 Schlauch in den oberen zwei Widerhaken des Y-Stecker und einem 3 cm langen Abschnitt von L / S16 Schlauch auf den Boden. Bringen Sie diese an die Spitze des 3 mm ID-Adapter. (Abschnitt 3.2.1) </td><td rowspan="5"><img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/53431/53431tablefig2.jpg" /></td></tr><tr><td> HEPA-vent </td><td> Fischer </td><td> 11374634 </td></tr><tr><td> Y-Verbinder, Stacheldraht </td><td> Cole Parmer </td><td> OU-06295-10 </td></tr><tr><td> L / S16 Silikonschlauch </td><td> Cole Parmer </td><td> OU-96410-16 </td></tr><tr><td> L / S14 Silikonschlauch </td><td> Cole Parmer </td><td> WZ-96410-14 </td></tr><tr><td> L / S13 Silikonschlauch </td><td> Cole Parmer </td><td> OU-96410-13 </td><td> 80 cm, die 1,0 mm Stachel-Adapter auf der Q-Serie Kappe an der Pumpe Wanne zu verbinden<html> ing = Innenrohr. </td><td></td></tr><tr><td> WM 205U / CA Pumpe </td><td> Fischer </td><td> 1248-6300 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> WM Pumpenschlauch, PVC, blau-orange, 0,25 mm Bohrung </td><td> Fischer </td><td> 12416310 </td><td rowspan="3"> PTFE das Schraubengewinde des männlichen Adapter und den weiblichen Adapter anschließen. Die Arbeit der Pumpenschlauch über einen der Widerhaken. Wiederholen Sie diesen Set-up am anderen Ende des Schlauchs. (Abschnitt 3.2.1) </td><td rowspan="3"><img alt="Tabelle 3" src="/files/ftp_upload/53431/53431tablefig3.jpg" /></td></tr><tr><td> Adapter, männlich, 1,0 mm ID </td><td> Kinesis </td><td> 008NB10-KD5L </td></tr><tr><td> Adapter, weiblich, 1,0 mm ID </td><td> Kinesis </td><td> 008NB10-KD2L </td></tr><tr><td rowspan="4"> 3.2.2 </td><td> Female Luer Kappe </td><td> Cole Parmer </td><td> WZ-45508-64 </td><td> Side-Port-Endkappen. </td><td rowspan="4">blefig4.jpg &quot;/&gt; <img alt="Tabelle 5" src="/files/ftp_upload/53431/53431tablefig5.jpg" /></td></tr><tr><td> L / S13 Silikonschlauch </td><td> Cole Parmer </td><td> OU-96410-13 </td><td> 40 mm Abschnitt der Pumpenschlauch an einen Modulanschluss zu verbinden. </td></tr><tr><td> L / S16 Silikonschlauch </td><td> Cole Parmer </td><td> OU-96410-16 </td><td rowspan="2"> 3x 30 mm L / S16 ausgestattet Reduzierungen = Modulverbinder zu 3x. (Abschnitt 3.2.2) </td></tr><tr><td> Barbed Minderer 1/8 &quot;x 1/16&quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> 30616-43 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 3.2.4 </td><td> L / S13 Silikonschlauch </td><td> Cole Parmer </td><td> OU-96410-13 </td><td> 55 cm Abschnitt des Retentats mit dem L / S14 des Y-Anschluss an der Q-Serie Kappe zu verbinden. </td><td rowspan="3"><img alt="Tabelle 6" src="/files/ftp_upload/53431/53431tablefig6.jpg" /></td></tr><tr><td> L / S13 Silikonschlauch </td><td> Cole Parmer </td><td> OU-96410-13 </td><td> 45 cm Abschnitt des Permeats zu dem L / S14 des Y-Anschluss auf der Q-Serie Kappe zu verbinden. </td></tr><tr><td> Gerade Stachel-Vereinigung </td><td> Cole Parmer </td><td> WZ-30612-43 </td><td> Befestigen Sie an das Ende des L / S13, die mit dem L / S14 des Y-Anschluss verbinden. </td></tr><tr><td> 3.4.2 </td><td> Klemme </td><td> VWR </td><td> 229-0609 </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> 4.3 </td><td> 4 mm Silikonschlauch </td><td> Fischer </td><td> FB68858 </td><td rowspan="2"> Falten Sie über einen 40 mm Rohrabschnitt und befestigen Sie sie mit einem Kabelbinder = Modul Endkappe. (Abschnitt 4.3) </td><td rowspan="2"><img alt="Tabelle 7" src="/files/ftp_upload/53431/53431tablefig7.jpg" /></td></tr><tr><td> Kabelbinder </td><td> Fischer </td><td> 12326377 </td></tr><tr><td> 4.4 </td><td> MACSmix Rohr Rotator </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-090-753 </td><td> Eine Anpassung kann attac erforderlichh die Module. </td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> 4.5 </td><td> Leur Injection Port </td><td> Thistle Scientific </td><td> IB-10820 </td><td rowspan="2"> Bringen Sie die Endkappe mit dem Injektionsanschluss. (Abschnitt 4.5) </td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> Female Luer Kappe </td><td> Cole Parmer </td><td> WZ-45508-64 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> L-Milchsäure-kit </td><td> Megazyme </td><td> K-LATE </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td> D-glucose kit </td><td> Megazyme </td><td> K-GLUC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6.2 </td><td> Skalpell / micro Messer </td><td> InterFocus </td><td> 10315-12 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7.4.3 </td><td> Albumin ELISA </td><td> Bethyl Labs </td><td> E80-129 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Bestandteile des HFB Set-up. </strong&gt; Der Textabschnitt relevant für die jeweilige Komponente in der Spalte 1 gegeben.

Watch this Scientific Journal Video about Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture at JoVE.com

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Das funktionale Verhalten der Zellen in Kultur können -ähnlichen 3-dimensional Kulturumgebungen 16-21 in mehr in vivo durch Züchten verbessert werden. Dieses Manuskript beschreibt den Aufbau und den Betrieb eines Hohlfaser - Bioreaktor - System für In - vivo - -ähnlichen Säugetiergewebekultur.

Hohlfaser-Bioreaktoren für<em&gt; In Vivo</em&gt; -ähnlichen Mammalian Gewebekultur

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

hollow-fiber-bioreactors-for-in-vivo-like-mammalian-tissue-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

16.2K Aufrufe.  University of Bath.  Das funktionale Verhalten der Zellen in Kultur können -ähnlichen 3-dimensional Kulturumgebungen 16-21 in mehr in vivo durch Züchten verbessert werden. Dieses Manuskript beschreibt den Aufbau und den Betrieb eines Hohlfaser - Bioreaktor - System für In - vivo - -ähnlichen Säugetiergewebekultur. 

Serie: Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Forschung

Biotechnik

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Biologie

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Tissue Engineering eines Menschen 3D<em&gt; In-vitro-</em&gt; Tumor-Testsystem

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Interview: Bioreactors and Surfaced-Modified 3D-Scaffolds for Stem Cell Research

A Nature Editorial in 2003 asked the question "Good-bye, flat biology?" What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems, mainly monolayer cultures, often suffered from the disadvantage that differentiated primary cells had a relatively short life-span and de-differentiated during culture. As a consequence, most of their organ-specific functions were lost rapidly. Thus, in order to reproduce better conditions for these cells in vitro, modifications and adaptations have been made to conventional monolayer cultures.
The last generation of CellChips -- micro-thermoformed containers -- a specific technology was developed, which offers the additional possibility to modify the whole surface of the 3D formed containers. This allows a surface-patterning on a submicron scale with distinct signalling molecules. Sensors and signal electrodes may be incorporated. Applications range from basic research in cell biology to toxicology and pharmacology. Using biodegradable polymers, clinical applications become a possibility. Furthermore, the last generation of micro-thermoformed chips has been optimized to allow for cheap mass production.

In the past many in vitro culture systems -- mainly monolayer cultures -- often suffered from the disadvantage that differentiated primary cells had a relatively short life-span and de-differentiated during culture. As a consequence, most of their organ-specific functions were lost rapidly. Thus, in order to reproduce better conditions for these cells in vitro, modifications and adaptations have been made to conventional monolayer cultures.

Interview: Bioreaktoren und Aufgetaucht-Modified 3D-Gerüste für Stammzellforschung

A Nature Editorial in 2003 asked the question  "Good-bye, flat biology?"  What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems,  ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Perfusable vaskuläre Netzwerk mit einem Gewebe-Modell in einem mikrofluidischen Gerät

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models

Cells and tissues in the body experience environmental conditions that influence their architecture, intercellular communications, and overall functions. For in vitro cell culture models to accurately mimic the tissue of interest, the growth environment of the culture is a critical aspect to consider. Commonly used conventional cell culture systems propagate epithelial cells on flat two-dimensional (2-D) impermeable surfaces. Although much has been learned from conventional cell culture systems, many findings are not reproducible in human clinical trials or tissue explants, potentially as a result of the lack of a physiologically relevant microenvironment.
Here, we describe a culture system that overcomes many of the culture condition boundaries of 2-D cell cultures, by using the innovative rotating wall vessel (RWV) bioreactor technology. We and others have shown that organotypic RWV-derived models can recapitulate structure, function, and authentic human responses to external stimuli similarly to human explant tissues 1-6. The RWV bioreactor is a suspension culture system that allows for the growth of epithelial cells under low physiological fluid shear conditions. The bioreactors come in two different formats, a high-aspect rotating vessel (HARV) or a slow-turning lateral vessel (STLV), in which they differ by their aeration source. Epithelial cells are added to the bioreactor of choice in combination with porous, collagen-coated microcarrier beads (Figure 1A). The cells utilize the beads as a growth scaffold during the constant free fall in the bioreactor (Figure 1B). The microenvironment provided by the bioreactor allows the cells to form three-dimensional (3-D) aggregates displaying in vivo-like characteristics often not observed under standard 2-D culture conditions (Figure 1D). These characteristics include tight junctions, mucus production, apical/basal orientation, in vivo protein localization, and additional epithelial cell-type specific properties.
The progression from a monolayer of epithelial cells to a fully differentiated 3-D aggregate varies based on cell type1, 7-13. Periodic sampling from the bioreactor allows for monitoring of epithelial aggregate formation, cellular differentiation markers and viability (Figure 1D). Once cellular differentiation and aggregate formation is established, the cells are harvested from the bioreactor, and similar assays performed on 2-D cells can be applied to the 3-D aggregates with a few considerations (Figure 1E-G). In this work, we describe detailed steps of how to culture 3-D epithelial cell aggregates in the RWV bioreactor system and a variety of potential assays and analyses that can be executed with the 3-D aggregates. These analyses include, but are not limited to, structural/morphological analysis (confocal, scanning and transmission electron microscopy), cytokine/chemokine secretion and cell signaling (cytometric bead array and Western blot analysis), gene expression analysis (real-time PCR), toxicological/drug analysis and host-pathogen interactions. The utilization of these assays set the foundation for more in-depth and expansive studies such as metabolomics, transcriptomics, proteomics and other array-based applications. Our goal is to present a non-conventional means of culturing human epithelial cells to produce organotypic 3-D models that recapitulate the human in vivo tissue, in a facile and robust system to be used by researchers with diverse scientific interests.

A rotating cell culture system that allows epithelial cells to grow under physiological conditions resulting in 3-D cellular aggregate formation is described. The aggregates generated display in vivo-like characteristics not observed in conventional culture models and serve as a more accurate organotypic model system for a multitude of scientific investigations.

Die Züchtung und Anwendungen von Rotating Wand Schiff Bioreaktor Abgeleitet 3D Epithelzellen Models

Cells and tissues in the body experience environmental conditions that influence their architecture, intercellular communications, and overall functions. ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in regenerative medicine and bioreactor technologies offer opportunities to produce lab-grown functional tissue and organ constructs that can be used to screen drugs, model disease, and engineer tissue replacements. Here, a miniaturized bioreactor coupled with an imaging modality that allows in situ visualization of the inner lumen of explanted rat trachea during in vitro tissue manipulation and&#160;culture is described. Using this bioreactor, the protocol demonstrates imaging-guided selective removal of endogenous cellular components while preserving the intrinsic biochemical features and ultrastructure of the airway tissue matrix. Furthermore, the delivery, uniform distribution, and subsequent prolonged culture of exogenous cells on the decellularized airway lumen with optical monitoring in situ are shown. The results highlight that the imaging-guided bioreactor can potentially be used to facilitate the generation of functional in vitro airway tissues.

The protocol describes an imaging-enabled bioreactor that allows the selective removal of the endogenous epithelium from the rat trachea and homogenous distribution of exogenous cells on the lumen surface, followed by long-term in vitro culture of the cell-tissue construct.

Imaging-geführter Bioreaktor zur Erzeugung von biotechnologisch hergestelltem Atemwegsgewebe

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering is crucial for basic science cardiac research; in vitro human cell culture eliminates the interspecies differences of animal models, while a more tissue-like 3D environment (e.g., with extracellular matrix and heterocellular coupling) simulates in vivo conditions to a greater extent than traditional two-dimensional culture on plastic Petri dishes. However, each model system requires specialized equipment, for example, custom-designed bioreactors and functional assessment devices. Additionally, these protocols are often complicated, labor-intensive, and plagued by the failure of the small, delicate tissues.
This paper describes a process for generating a robust human engineered cardiac tissue (hECT) model system using induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes for the longitudinal measurement of tissue function. Six hECTs with linear strip geometry are cultured in parallel, with each hECT&#160;suspended from a pair of force-sensing polydimethylsiloxane (PDMS) posts attached to PDMS racks. Each post is capped with a black PDMS stable post tracker (SPoT), a new feature that improves the ease of use, throughput, tissue retention, and data quality. The shape allows for the reliable optical tracking of post deflections, yielding improved twitch force tracings with absolute active and passive tension. The cap geometry eliminates tissue failure due to hECTs slipping off the posts, and as they involve a second step after PDMS rack fabrication, the SPoTs can be added to existing PDMS post-based designs without major changes to the bioreactor fabrication process.
The system is used to demonstrate the importance of measuring hECT function at physiological temperatures and shows stable tissue function during data acquisition. In summary, we describe a state-of-the-art model system that reproduces key physiological conditions to advance the biofidelity, efficiency, and rigor of engineered cardiac tissues for in vitro applications.

Three-dimensional cardiac tissues bioengineered using stem-cell-derived cardiomyocytes have emerged as promising models for studying healthy and diseased human myocardium in vitro while recapitulating key aspects of the native cardiac niche. This manuscript describes a protocol for fabricating and analyzing high-content engineered cardiac tissues generated from human induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes.

Entwicklung eines Bioreaktors zur Verbesserung der Datenerfassung und des Modelldurchsatzes von künstlich hergestelltem Herzgewebe

Heart failure remains the leading cause of death worldwide, creating a pressing need for better preclinical models of the human heart. Tissue engineering ...

Hohlfaser-Bioreaktoren für

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken