Unterstützung der Zuschüsse EB007279 und HL081273 von der NIH USA gedankt.

1. Allgemeine Beschreibung der Sauerstoff Messprotokoll (Dieser Abschnitt hat keine Wirkung, ist aber von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Rest des Papiers. Es gefilmt kann zum Beispiel sein, als eine Folge von ein paar Power Point Folien, begleitet von der Stimme.) 1,1) Die Sonde in das Medium von Interesse geliefert wird, zum Beispiel im Blut oder interstitielle Flüssigkeit eines Tieres injiziert. 1,2) Das Objekt (Oberfläche des Gewebes) ist mit dem Licht einer geeigneten Wellenlänge beleuchtet, um die Sonde in den angeregten Triplett-Zustand zu fördern. Typischerweise Anregung erfolgt über die Ein-Photonen-Mechanismus. Doch im Fall von speziellen Zwei-Photonen-enhanced-Sonden kann die Anregung über die Zwei-Photonen-Mechanismus, der mit den Sonden in der hochauflösenden Mikroskopie-Anwendungen ermöglicht erfolgen. Ein-Photonen-Anregung generell weniger räumliche Auflösung, erfordert aber einfacher Instrumentierung und können in Ein-Punkt-Messungen mit LED-basierten Glasfaser-phosphorometers verwendet werden. 1,3) Phosphoreszenz von der Sonde emittierten stammt aus dem langlebigen Triplett-Zustand. Die Sondenmolekül müssen speziell ausgelegt werden, um hohe Quantenausbeute der Triplett-Zustand geben und emittieren Phosphoreszenz statt Fluoreszenz. Während in den Triplett-Zustand, kann die Sonde collisional Begegnungen mit Sauerstoffmoleküle, die de-aktivieren Sie die Triplett-Zustand erleben können - &quot;. Abschrecken&quot; einen Prozess namens In Abwesenheit von Sauerstoff, die Lebensdauer des Triplett-Zustand, und damit der Phosphoreszenz Verfall, ist τ 0. In Anwesenheit von Sauerstoff wird die Phosphoreszenz Lebensdauer (τ) als Folge der Löschung verkürzt. Es gibt eine direkte Beziehung zwischen der Lebensdauer des Triplett-Zustand und die Menge an Sauerstoff in die Umwelt. Dies ist der bekannte Stern-Volmer-Beziehung, die die Lebensdauer (τ) der Phosphoreszenz verbindet Sauerstoffkonzentration [O 2] (oder Sauerstoff-Partialdruck pO 2): <img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="Gleichung" /> In biologischen Systemen ist Sauerstoff bei weitem die effektivste Quencher der Phosphoreszenz, die die Phosphoreszenz Abschreckverfahren sehr selektiv zu Sauerstoff macht. 1,4) Um die Lebensdauer t zu messen, werden die emittierten Photonen in phosphoreszierenden Zeit binned. Zum Beispiel, nach dem Anregungspuls, vielleicht 200 Photonen in den ersten 15 Mikrosekunden erfasst werden, 150 Photonen in den nächsten 15 Mikrosekunden gesammelt, und so weiter, bis keine Photonen gesammelt werden. Die Zahlen in den Behälter gegen die Zeit aufgetragen geben die Phosphoreszenz Fäulnis, die analysiert werden, um die Lebensdauer τ Ausbeute ist. In Bildgebung, ist dieses Verfahren in jedem Pixel des Bildes angewendet, was zu Phosphoreszenz Lebensdauer Karten. Messungen der Lebensdauer sind unempfindlich gegen die Heterogenitäten der Sonde Verteilung über das Objekt, das gemeinsam für biologische Proben ist. So berichten Lebenszeiten nur auf Sauerstoff. Lifetimes τ sind in Sauerstoff-Konzentrationen mit der Stern-Volmer-Beziehung umgewandelt. 2. Bau von phosphoreszierenden Sonden Phosphorescent Sonden für Sauerstoff-Messungen in biologischen Systemen bestehen aus phosphoreszierenden Chromophore (Kerne), in Käfige von Dendrimeren aufgebaut gekapselt - sehr regelmäßigen hyperverzweigten Polymeren [3]. Dendrimere schützen die Kerne von Wechselwirkungen mit der Umwelt und die Kontrolle der Geschwindigkeit der Sauerstoff-Diffusion an die Kerne, die es ermöglicht, die Empfindlichkeit und Dynamik der Sonden (k q in der Stern-Volmer-Beziehung) zu optimieren. Die Termini der Dendrimere sind mit chemisch inerten hydrophilen Polyethylenglykol (PEG) modifiziert, so dass die Sonden hoch wasserlöslich und verhindert deren Wechselwirkungen mit biologischen Makromolekülen. Phosphorescent Kerne der Sonden sind Pt-oder Pd-Komplexe von Porphyrinen und π-erweiterten Porphyrine. π-Extended Porphyrine Porphyrine in die Pyrrolringe mit externen aromatischen Fragmenten fusioniert sind. π-Extension ermöglicht Abstimmung der Sonden spektroskopischen Eigenschaften an die Anforderungen eines bestimmten Imaging-Anwendung (z. B. Mikroskopie vs Tomographie) zu befriedigen. Als Beispiel beschreiben wir Synthese von Pd tetaaryltetrabenzoporphyrins (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 TBP ist über leistungsfähige Absorptionsbanden im fernen roten Teil des Spektrums und starke Phosphoreszenz, auch für die biologische Sauerstoff-Messungen geeignet. Die Synthese von PdAr 4 TBP ist besteht aus folgenden Schritten: 2,1) Vorbereitung der tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) von Lindsey Kondensation [5] tetrahydroisoindole mit substituierten Benzaldehyden. Um eine 0,01 M Lösung von tetrahydroisoindole (1 eq) in CH &lt;sub&gt; 2 Cl 2 der aromatischen Aldehyd (1 eq) wurde unter Argon zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 10 min im Dunkeln bei RT BF 3 XET 2 O (0,2 eq) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für weitere 2 h gerührt DDQ (1 eq) zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht unter ständigem Rühren gelassen. Die Lösung wurde mit 10% aq Na 2 SO 3 gewaschen, 10% aq Na 2 CO 3, 5% aq. HCl und schließlich mit Sole. Die organische Phase wurde über Na 2 SO 4 getrocknet, dann im Vakuum konzentriert. Tert-Butyl-Ether-Mischung zu geben, Ar 4 TChP als grünes Pulver - Der Rückstand wurde aus CH 2 Cl 2 umkristallisiert. Die Erträge sind etwa 50%. 2,2) Insertion von Pd zu erhalten PdAr 4 TCHPs. Free-Basis Porphyrine (1 eq) wurden mit PdCl 2 oder Pd (OAc) 2 (1.2 eq) in siedendem CH 3 CN in Gegenwart eines Überschusses von Et 3 N (20 eq) behandelt. Der Umsatz wurde durch UV-Vis-Spektroskopie überwacht (Lösungsmittel CH 2 Cl 2-AcOH) und als abgeschlossen, nachdem die Soret-Bande von Diktaten auf 468-472 nm verschwunden. Die Mischung ließ man abkühlen, verdünnt mit CH 2 Cl 2 und durch eine dünne Schicht von Celite auf Pd (0) zu entfernen. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel mit CH 2 Cl 2 als Lösungsmittel gereinigt. Dunkelrot Fraktion gesammelt wurde, wurde das Lösungsmittel verdampft, um Ziel-PdAr 4 TCHPs in nahezu quantitativer Ausbeute. 2,3) PdAr 4 TBP Jahre waren durch Oxidation von PdAr 4 TCHPs mit dem 2-fachen Überschuss von DDQ (16 eq) in THF unter Rückfluss erhitzt vorbereitet. Während siedendem, änderte sich die Farbe von dunkel-rot bis tief-grün. Das Lösungsmittel wurde eingedampft, der Rückstand mit CH 2 Cl 2 verdünnt, mit 10% aq Na 2 SO 3, Wasser und Sole. Die organische Phase wurde über Na 2 SO 4 getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel (Laufmittel CH 2 Cl 2) gereinigt. Die erste dunkelgrüne Fraktion wurde gesammelt, konzentriert im Vakuum auf 85-90% der als blau-grünes Pulver PdAr4TBP ist zu geben. 2,4) Peripheral Estergruppen Pd Tetrakis-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-Tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) wurden hydrolysiert mit 10-facher Überschuss an KOH in 1% (v / v) Wasser / THF bei RT. Das Lösungsmittel wurde aus dem Niederschlag des gebildeten Kaliumsalze von Carbonsäurederivaten PdAr4TBP ist dekantiert. Die Feststoffe wurden in Wasser gelöst, gerührt für weitere 2 h, mit konz. HCl auf pH ~ 4-5. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Schützen Dendronen. Jeder einzelne Zweig der Dendrimer heißt dendron. Schützen Dendrone sind aus Aryl-Glycin (AG) Bausteinen aufgebaut. AG Dendrone kann leicht aus billigen Ausgangsstoffen synthetisiert und isoliert werden in hoher Reinheit und Ausbeute durch Chromatographie-free-Methoden. Synthese von Generation 2 (G2) AG-dendron besteht aus folgenden Schritten: 2,4) Synthese der Bausteine, Boc-geschützte 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide und 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, mit der Fischer Haloacyl Halogen-Methode. 2,5)-Kupplung der Bausteine ​​mit CDMT / NMM Peptidkopplung Chemie. 2,6) Entschützen der Schwerpunkt Aminogruppe durch Rühren der Lösung der G2 dendron in TFA 2 h bei RT 2,7) Für die Montage der höheren Generation Dendrone sind Kupplung / Entschützung Schritte wiederholt. Dendrimer Montage ist durch die Kopplung des entschützten Dendronen PdAr4TBP (oder andere Porphyrin) mit dem HBTU / DIPEA Kopplungschemie erreicht. 2,8) werden zunächst die Boc-Schutzgruppen aus den dendron entfernt. Zum Beispiel wurde Boc-geschützten G3 dendron (0,58 g) in TFA (15 ml) gelöst und die Mischung wurde bei RT 2h reagieren. Die Säure wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, was die dendron als TFA-Salz. Der Rückstand wurde in trockenem NMP (10 ml) gelöst und ein paar Tropfen DIPEA wurden hinzugefügt, um die Spuren von TFA zu stillen. 2,9) Vor Beginn der Kupplungsreaktion ist es entscheidend, um sich vollständig aufzulösen Porphyrin. So wurde zum Beispiel Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) in trockenem NMP (65 ml) unter Erhitzen auf 140 ° C gelöst für 10 min unter Stickstoff strömen. 2,10) Die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt wurde HBTU (0,211 g) zugegeben und das Gemisch wurde für 5 min gerührt. 2,11) DIPEA (0,35 ml) wurde zu dem Gemisch in einer Portion zugegeben, unmittelbar gefolgt von der Zugabe des Lö gefolgtauf der TFA-Salz der dendron in NMP (siehe 2,8), und die Mischung wurde über Nacht unter Rühren. 2,12) Das Gemisch wurde in 3% aq gegossen. NaCl (350 ml), und der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und mit Wasser gewaschen, MeOH und Et 2 O durch wiederholte Aussetzung / Zentrifugation, um das Ziel Porphyrin-Dendrimer erhalten. 2,13) ​​zu den peripheren Estergruppen hydrolysieren, wurde das Dendrimer zuerst mit NMe 4 OH (~ 5 mM) in DMSO / MeOH über 20-60 min Dauer, durch die vollständige Entfernung des Lösungsmittels behandelt, gefolgt. Dieses Verfahren erlaubt es uns, Dendrimere mit ausreichenden Zahl von Carboxylatgruppen zu Wasserlöslichkeit geben zu generieren. Zur Vervollständigung der Hydrolyse wurde das Dendrimer mit 0,1 N wässriger NaOH (overnight) behandelt. Als Ergebnis konnte rein Porphyrin-Dendrimer-Carbonsäuren in 80-95% Ausbeute isoliert werden. Änderung der Dendrimer-Peripherie. An dieser Stelle, ausgehend von der gleichen Porphyrin-Dendrimer, entweder ein-oder Zwei-Photonen-Sonden synthetisiert werden können. Im ersten Fall werden alle peripheren Carboxylgruppen mit PEG-Einheiten verändert - eine Methode, wie PEGylierung bekannt. Im letzteren Fall sind mehrere Carboxylgruppen zunächst mit Zwei-Photonen-Antenne Chromophore (Cumarin-343) modifiziert mit Ethylendiamin (EDA)-Linker, gefolgt von PEGylierung der verbleibenden Carboxylgruppen [6]. Gekoppelt Dendrimere wurden PEGylierte mit monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. MW 1000) mit HBTU / DIPEA Kopplungschemie. 2,14) Zu einer Lösung des dendron in NMP (oder DMF) (1-10 mM) 1,25-fachen Überschuss von HBTU zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei RT für 10 min gerührt. 6,25-fachen Überschuss von DIPEA zugegeben, gefolgt von der sofortigen Zugabe von 1,25-fachen Überschuss von m-PEG-NH2. Die Reaktionsmischung wurde 2 Tage bei RT gerührt. Diethylether zur Reaktionsmischung zugegeben wurde, wurde der gebildete Niederschlag durch Zentrifugation und wieder ausgefällt aus THF durch Zugabe von Diethylether getrennt. 2,15) Endreinigung wurde mit Größenausschlusschromatographie durch das Sammeln der ersten Front Phase erreicht. PEGylierte Porphyrin-Dendrimer wurde in einer kleinen Menge THF (~ 15 ml) gelöst und auf der Oberseite eine Chromatographiesäule mit Polystyrol SEC Phase (Biorad, Biobeads S-X1) gefüllt. Die Säule wurde mit reinem THF eluiert und die dunkle Band bewegt sich mit der Front gesammelt wurde. 2,16) THF wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das verbleibende Material wurde im Vakuum getrocknet. 3. Probe Charakterisierung Photophysikalische Charakterisierung umfasst Messungen der Sonde Absorptions-und Emissionsspektren, Phosphoreszenz Lebensdauer τ 0 und Stern-Volmer-Sauerstoff-Konstanten k q unter physiologischen Bedingungen. 3,1) Die Absorptions-und Emissionsspektren sind unter Umgebungsbedingungen mit Standard-Instrumentierung (Spektralphotometer und stetige Fluorometer) erhalten. ~ 1 uM Lösungen der Sonde verwendet wird. 3,2) Als nächstes wird der Stern-Volmer Eichkurve erhalten. Dies ist die wichtigste Messung, weil es uns um die Lebensdauer der Sonde auf die Sauerstoffkonzentration beziehen können. 3,3) eine Lösung der Sonde in PBS-Puffer (pH 7,2) wird in einem speziellen zylindrischen Küvette, die innerhalb der temperierten Kammer positioniert ist, in einem lichtundurchlässigen Käfig mit Anschlüssen für Anregung und Emission optischer Fasern platziert. Die Fasern werden in engen Kontakt mit der Küvette im Inneren der Kammer in den rechten Winkel Geometrie gebracht. 3,4) Die Küvette wird mit einem Stopfen verschlossen, in die ein hochempfindliches Clark-Typ Sauerstoffelektrode (CK-Sauerstoff-Elektrode) eingefügt wird. Der Stopfen enthält auch zwei Nadel-Anschlüsse für Ein-und Austritt von Argon. Die Elektrode wird in die Lösung eingetaucht, während die Nadeln nur für die Strömung des Gases fließen über der Lösung Oberfläche zu versehen. Zunächst wird Argon nicht mit dem Einlass verbunden. 3,5) wird die Temperatur auf den gewünschten Wert (in der Regel 36-37 ° C) eingestellt und die Lösung wird unter Rühren zur Äquilibrierung links. 3,6) Die Anregung Faser ist die Anregung Anschluss eines digitalen phosphorometer, von einem PC betrieben wird. Die Lichtquelle in der phosphorometer ist ein High-Power-LED, deren Ausgang wird durch einen 333 kHz D / A-Board gesteuert. Die Emission Faser ist eine andere optische Schnittstelle des phosphorometer, was zu einer stark IR-empfindliche APD (Avalanche-Fotodiode) gekoppelt ist. Der Ausgang der Diode wird verstärkt und in die A / D-Kanal der gleichen Steuerkarte, die Synchronisation zwischen dem Anregungs-und Emissions-Kanälen ermöglicht. 3,7) Die Steuerungssoftware alTiefs Generation von Anregungspulsen beliebiger Länge (zB 5 oder 10 ms), durch Sammlung von Phosphoreszenz Zerfall während einer willkürlich gewählten Zeitraum (typischerweise 2-3 ms) gefolgt. Zeit für ein einziges Leben Messung erforderlich ist typischerweise 0.5-1 s, jedoch können die Messungen so schnell wie 10-20 pro Sekunde erreicht werden. 3,8) Die Ausgabe der Sauerstoff-Elektrode wird verstärkt und in ein anderes A / D Board gerichtet auf dem gleichen PC. Dies ist eine niedrige Frequenz Bord (1 kHz max), die verwendet werden, um die Elektrode Strom bei ausgewählten Zeiträumen Datensatz. Das Programm für die Aufnahme der Elektrode Daten läuft gleichzeitig mit dem phosphorometer Software. 3,9) Sobald die Temperatur der Lösung ist äquilibriert werden sowohl die phosphorometer und die Elektrode Programme gleichzeitig initialisiert führen Messungen alle 10 s. Deren Ausgänge werden synchron in zwei separaten Dateien protokolliert. Danach wird Argon zu der Einlassöffnung auf der Küvette Stopfen verbunden. 3,10) Wie Argon strömt über die Oberfläche des gerührten Lösung, es ersetzt allmählich Sauerstoff. Dies führt zu einer Abnahme der Elektrode Strom und eine Erhöhung der Phosphoreszenz Lebensdauer, die durch die phosphorometer gemessen wird. Normalerweise wird der Sauerstoff verdrängt bilden die Lösung ganz nach ca. 2 h, während welcher Zeit die Daten vollständig automatisch in Dateien protokolliert. 3,11) Nach dem Ende der Titration ausführen, werden die Elektroden-Daten und die Phosphoreszenz Lebzeiten in eine Standard-Analyse-Programm (zB Miocrocal Origin) importiert. Die Elektrode aktuellen hängt linear von der Sauerstoffkonzentration, und für die Elektrode verwendet, ist es praktisch Null auf Null Sauerstoff. Bei Atmosphärendruck ist pO 2 bekannt (etwa 150 mm Hg). So kann die Elektrode direkt an den Sauerstoff Skala umgewandelt werden, und die Handlung der inversen Phosphoreszenz Lebensdauer vs pO 2 konstruiert werden kann. Dieses Grundstück ist mit einer geraden Linie mit der Methode der kleinsten Quadrate, um den Sauerstoff Abschrecken konstant kq wie seine Neigung zu geben ausgestattet. Phosphoreszenz Lebensdauer t0 wird entweder aus dem gleichen Ausrichtung (wie die Umkehrung der Intercept) oder direkt aus der Messung bei Null-Sauerstoff erhalten. 3,12) Falls erforderlich, die Titration wiederholt wird, indem eine Lösung der Sonde in Gegenwart von Albumin - ein Protein, das in das Blutplasma in hohen Konzentrationen - in, um die Bedingungen zu emulieren trafen sich in der realen experimentellen System (Blut eines Tieres in vivo). Die erhalten Stern-Volmer Plots sollten identisch sein, wenn das Dendrimer ist der Schutz der Sonde gut und PEG-Gruppen zu isolieren die Sonde von Kontakten mit Albumin. Andernfalls wird die Sonde und der Proteine ​​im Blut interagieren, und das wird zu einer veränderten Stern-Volmer Plot führen, daß eine Doppeldeutigkeit in Sauerstoff-Messungen. So erhalten Kalibrierkonstanten sind in bildgebenden Experimenten, bei denen der Sauerstoff-Konzentrationen sind a priori unbekannt verwendet.

<ol>
	<li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence.">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+A+novel+method+for+measuring+the+distribution+of+oxygen+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li><li>Lebedev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+phosphorescent+probes+for+oxygen+Imaging+in+biological+systems.">Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems.</a> Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).</li><li>Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+versatile+synthesis+of+substituted+tetrabenzoporphyrins.">Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins.</a> Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).</li><li>Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rothemund+and+Adler-Longo+Reactions+revisited:+Synthesis+of+tetraphenylporphyrins+under+equilibrium+conditions.">Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions.</a> Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).</li><li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen.">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li></ol>

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt; Abkürzung</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt; Vollständiger Name</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N-Methylpyrrolidinon</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt; Trifluoressigsäure</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt; Diisopropylethylamin</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - (1H-Benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt; Dimethylsulfoxid</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1-Chlor-3 ,5-dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N-methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

synthesis and calibration of phosphorescent nanoprobes for oxygen imaging in biological systems

Sauerstoff-Messung durch Phosphoreszenz Abschrecken [1, 2] besteht aus folgenden Schritten: 1) wird die Sonde in das Medium von Interesse (zB Blut oder interstitielle Flüssigkeit) geliefert, 2) das Objekt wird mit Licht einer geeigneten Wellenlänge beleuchtet, um zu begeistern die Sonde in die Triplett-Zustand, 3) die emittierte Phosphoreszenz gesammelt, und ihr zeitlicher Verlauf wird analysiert, um die Phosphoreszenz Lebensdauer, die in die Sauerstoff-Konzentration (oder Partialdruck pO umgewandelt wird Ertrag<sub&gt; 2</sub&gt;). Die Sonde muss nicht mit der biologischen Umgebung interagiert und in einigen Fällen bis 4 sein) ausgeschieden aus dem Medium auf der Messung der Fertigstellung. Jeder dieser Schritte stellt Anforderungen an das molekulare Design von den phosphoreszierenden Sonden, die die einzige invasive Komponente des Messprotokolls darstellen. Hier beschreiben wir das Design von dendritischen phosphoreszierende Nanosensoren für Sauerstoff-Messungen in biologischen Systemen. Die Sonden bestehen aus Pt oder Pd-Porphyrin-basierte polyarylglycine (AG)-Dendrimere, peripher mit Polyethylenglykol (PEG)-Reste modifiziert. Für eine effektive Zwei-Photonen-Anregung kann Termini der Dendrimere mit Zwei-Photonen-Antenne Chromophore, die die Anregungsenergie einzufangen und leiten es in den Triplett-Kerne der Sonden über intramolekulare FRET (Förster Resonance Energy Transfer) geändert werden. Wir beschreiben die wichtigsten photophysikalischen Eigenschaften der Sonden und präsentieren detaillierte Kalibrierprotokolle.

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems at JoVE.com

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Wir präsentieren Prinzipien der Sauerstoff-Messungen durch Phosphoreszenz Abschrecken und Überprüfung Gestaltung der Porphyrin-basierte dendritische Nanosensoren für Sauerstoff Bildgebung in biologischen Systemen.

Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

synthesis-calibration-phosphorescent-nanoprobes-for-oxygen-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Wir präsentieren Prinzipien der Sauerstoff-Messungen durch Phosphoreszenz Abschrecken und Überprüfung Gestaltung der Porphyrin-basierte dendritische Nanosensoren für Sauerstoff Bildgebung in biologischen Systemen.

Serie: Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Mit Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) zu Diagnose-Tools entwickeln

Forschung

Biologie

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Geboren Normalisierung für Fluoreszenz-Optical Projection Tomographie für ganzem Herzen Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Elektronen-Spin-Resonanz-Micro-Imaging an lebenden Spezies, bei Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Imaging Cell Membrane Verletzung und subzellulärer Prozesse in der Reparatur beteiligt

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Basierend HeLa Zellfreie Expressionssysteme zur Expression von<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteine

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.