NIH ABD&#39;den EB007279 ve HL081273 hibe desteği minnetle kabul edilmektedir.

1. Oksijen ölçüm protokolü genel tanımı (Bu bölümde herhangi bir eylem var, ama kağıt geri kalanı anlamak için çok önemlidir. Ses eşliğinde, birkaç Power Point slaytları bir dizi olarak, örneğin, filme olabilir.) 1.1) prob ilgi ortama teslim edilir, örneğin bir hayvanın kan veya interstisyel sıvı enjekte. 1.2) nesne (doku yüzey) prob heyecanlı üçlü haline teşvik etmek için uygun dalga boyu ışık ile aydınlatılır. Tipik olarak uyarım, tek-foton mekanizması ile oluşur. Ancak, iki-foton geliştirilmiş özel problar durumunda, uyarım, yüksek çözünürlüklü mikroskopi uygulamalar problar kullanılarak izin veren iki-foton mekanizması yoluyla olabilir . Bir foton uyarım genellikle daha az uzaysal çözünürlüğü sağlar, ancak basit enstrümantasyon gerektirir ve LED tabanlı fiber-optik phosphorometers ile tek noktadan ölçümlerde kullanılabilir. 1.3) sensörü tarafından yayılan Fosforesans uzun ömürlü üçlü devlet kaynaklanır. Prob molekül özel üçlü devlet yüksek kuantum verimi vermek ve yerine floresan fosforesans yayacak şekilde tasarlanmış olmalıdır. Prob üçlü devlet iken, üçlü devlet de aktif hale getirebilirsiniz oksijen molekülleri ile çarpışma karşılaşmalar yaşayabilirsiniz - &quot;su verme&quot; olarak adlandırılan bir süreç Fosforesans çürüme dolayısıyla oksijen, üçüz devletin ömrü ve yokluğunda, τ 0. Oksijen varlığında, fosforesans ömrü (τ), ısıl işlem sonucu olarak kısaltılır. Üçüz devletin ömrü ve ortamda oksijen miktarı arasında doğrudan bir ilişki vardır. Bu oksijen konsantrasyonu [O 2] (veya oksijen kısmi basıncı pO2) fosforesans ömrü (τ) bağlayan bilinen Stern-Volmer ilişki: <img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="denklem" /> Biyolojik sistemleri, oksijen kadar oksijen fosforesans su verme yöntemi çok seçici hale getirir fosforesans, en etkili söndürücü. 1.4) ömrü t ölçmek için, zaman içinde yayılan fosforlu fotonlar binned. Örneğin, fotonlar toplanana kadar ikaz darbe sonrasında, 200 fotonlar, bu nedenle, ilk 15 mikrosaniye önümüzdeki 15 mikrosaniye toplanan 150 fotonlar toplanan ve olabilir. Kutularına numaraları ömrü verim τ analiz fosforesans çürüme, zamana karşı çizilmiştir. Görüntülemede, bu yordamı fosforesans ömrü, haritalar, görüntünün her piksel uygulanır. Yaşamların ölçümleri, biyolojik örnekler için ortak nesne boyunca prob dağıtım heterojenite duyarsız. Böylece, ömürleri sadece oksijen rapor. Yaşamlarda τ Stern-Volmer ilişkiyi kullanarak oksijen konsantrasyonu dönüştürülür. 2. Fosforlu probları İnşaatı Biyolojik sistemlerde oksijen ölçümleri için Fosforlu probları dendrimers yapılmış kafesler içine kapsüllü fosforlu kromoforlar (çekirdek), son derece düzenli hyperbranched polimerler oluşur [3]. Dendrimers çevre ile etkileşim çekirdeği korumak ve mümkün probların hassasiyet ve dinamik aralık (Stern-Volmer ilişkisi sabit k q) optimize etmek için, çekirdek oksijen difüzyon hızını kontrol. Dendrimers Termini probları yüksek suda çözünür ve biyolojik makromoleküller ile etkileşimleri önlemek, kimyasal olarak inert hidrofilik polietilen glikol (PEG) grupları ile modifiye edilmiştir. Probların Fosforlu çekirdek porfirinler ve π genişletilmiş porfirin Pt veya Pd kompleksleri. π Genişletilmiş porfirinler pirol halkaları dış aromatik parçaları ile kaynaşmış olan porfirinler. π-Eklenti belirli bir görüntüleme uygulaması (örneğin mikroskopi vs tomografi) gereksinimlerini karşılamak için problar spektroskopik özellikleri ayarlama sağlar. Bir örnek olarak, Pd tetaaryltetrabenzoporphyrins sentezi (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 TBP spektrum ve güçlü fosforesans uzak-kırmızı parçası güçlü emme bantlar var, iyi biyolojik oksijen ölçümleri için uygundur. PdAr 4 TBP sentezi aşağıdaki adımlardan oluşur: Lindsey yoğuşma tetraaryltetracyclohexenoporphyrins 2.1) Hazırlama (Ar4TCHP) [5] yerine benzaldehydes ile tetrahydroisoindole. 0,01 M CH tetrahydroisoindole (1 eq) bir çözüm için &lt;alt&gt; 2 CL 2 aromatik aldehit (1 eq), argon gazı altında eklendi . Reaksiyon karışımı RT BF 3 xEt 2 O (0.2 eq) karanlıkta 10 dakika süreyle karıştırıldı eklendi ve reaksiyon karışımı ilave bir 2 saat için rt karıştırıldı DDQ (1 eq) eklendi, karışımı sürekli karıştırma altında bir gece kaldı. 3 çözüm% 10 aq Na 2 SO yıkandı,% 10 aq Na 2 CO 3,% 5 aq HCl ve nihayet tuzlu su ile. Organik faz, daha sonra vakum yoğunlaşmış, Na 2 SO 4 üzerinden kurutulur. Tert-bütil eter karışımı Ar yeşil toz olarak 4 TCHP vermek için kalıntı CH 2 Cl 2 kristallendirildi. Verim% 50 civarında. 2.2 PD) Ekleme PdAr 4 TCHPs elde etmek için. Serbest baz porfirinler (1 eq) Et 3 N (20 eq) aşan varlığı CH 3 CN kaçmasını PdCl 2 veya Pd (oac) 2 (1.2 eq) ile tedavi edildi. UV-vis spektroskopi dönüşüm izlenir (solvent CH 2 Cl 2-AcOH) ve 468-472 nm dikte Soret bant sonra tamamlanmış sayılır kayboldu. Karışım CH 2 Cl 2 ile seyreltilmiş ve Celite Pd (0) kaldırmak için ince bir tabaka süzgecinden soğuması. Çözücü uçurulur ve kalıntı çözücü olarak CH 2 Cl 2 silika jel kolon kromatografisi ile saflaştırılır. Koyu kırmızı fraksiyon toplandı, hedef neredeyse kantitatif verim PdAr 4 TCHPs vermek çözücü uçurulur. 2.3) PdAr 4 TBP PdAr 4 TCHPs oksidasyonu kaynatılır THF DDQ 2 kat daha fazla (16 eq) tarafından hazırlanmıştır. Reflüye yol boyunca, derin, koyu kırmızı-yeşil renk değiştirdi. Çözücü buharlaştırılır, kalıntı% 10 aq Na 2 SO 3, su ve tuzlu su ile yıkanır, CH 2 Cl 2 ile sulandırıldı. Organik faz Na 2 SO 4 üzerinden kurutulur ve vakum yoğunlaşmıştır. Kalıntı silika jel kromatografisi (Eluent CH 2 Cl 2) ile saflaştırılır oldu. PdAr4TBP Kullanıcı mavi-yeşil bir toz% 85-90 vermek vakum konsantre ilk koyu yeşil fraksiyonu toplanmıştır. 2.4) Pd, Periferik ester gruplarının Tetrakis-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl) tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP)% 1 (v / v) su / rt az THF KOH 10 kat daha fazla kullanarak hidrolize edildi. Solvent PdAr4TBP Kullanıcı karboksilik asit türevleri oluşan potasyum tuzları çökelti dekante oldu. Suda çözünmüş katı madde, kons ile asitlendirilmiş ek 2 saat, kıpırdandı. HCl pH: ~ 4-5. Elde edilen çökelti su ile yıkanır ve kurutulur vakum, santrifüj yoluyla izole edilmiştir. Dendrons korunması. Dendrimer Her bireysel şube dendron denir. Korunması dendrons aril-glisin (AG) yapı taşlarını inşa edilir. AG dendrons kolayca ucuz başlangıç ​​maddeleri sentezlenen ve kromatografisi-yöntemleri ile yüksek saflık ve verim izole edilebilir. Yeni nesil 2 (G2) AG-dendron sentezi aşağıdaki adımlardan oluşur: Fischer haloacyl halide yöntemi kullanarak yapı taşları 2.4) sentezi, Boc korumalı, 3,5 dicarboxyphenyl glycineamide ve 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide. 2.5) CDMT / NMM peptid kaplin kimya kullanarak yapı taşlarından Kaplin. 2.6), oda sıcaklığında 2 saat TFA G2 dendron çözümü karıştırma fokal amino grubu access 2.7) daha yüksek nesil dendrons montajı için, kaplin / deprotection adımları tekrarlanır. Dendrimer montaj HBTU / DIPEA kaplin kimya PdAr4TBP (ya da diğer porfirin) kullanarak deprotected dendrons kaplin ile elde edilir . 2.8) İlk olarak, Boc koruyucu gruplar dendron kaldırılır. Örneğin, Boc korumalı G3 dendron (0.58 g) TFA (15 ml) dağıldı ve karışım 2s RT tepki kaldı. Asit TFA tuzu olarak dendron verimli, döner buharlaşma tarafından kaldırıldı. Kalıntı kuru NMP (10 ml) içinde çözünmüş ve TFA izlerini gidermek için, DIPEA bir birkaç damla ilave edildi. 2.9) kaplin reaksiyon başlamadan önce, porfirin tamamen erimesi için kritik öneme sahiptir. Örneğin, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0.061 g), 140 kuru NMP (65 ml) ısıtma dağıldı ° C 10 dakika, azot akışı altında. 2.10) çözümü oda sıcaklığına kadar soğutulur, HBTU (0,211 g) eklendi ve karışım 5 dakika süreyle karıştırıldı. 2.11) DIPEA (0.35 ml), hemen soluti ek ardından, bir kısmı karışıma eklendiNMP dendron (2.8) TFA-tuz karışımı geceleme karıştırma altında kaldı. 2.12) karışımı% 3 aq dökülür. NaCl (350 ml), ve ortaya çıkan çökelti santrifüj tarafından toplanan ve tekrarlayan süspansiyon / santrifüj hedef porfirin-dendrimer verim için su, MeOH ve Et 2 O ile yıkandı. Periferik ester gruplarının hidroliz için 2.13) dendrimer, ilk olarak 20-60 dk süre içinde tam solvent kaldırma takip DMSO / MeOH NME 4 OH (~ 5 mM) ile tedavi edildi. Bu prosedür, sulu çözünürlük vermek karboksilat grupların yeterli sayıda dendrimers oluşturmak için izin verdi. Hidroliz tamamlamak için, dendrimer 0.1N sulu NaOH (gece) ile tedavi edildi. Sonuç olarak, saf porfirin-dendrimer karboksilik asitler,% 80-95 verim izole olabilir. Dendrimer çevre modifikasyonu Bu noktada, aynı porfirin-dendrimer başlayarak, ya bir ya da iki-foton probları sentezlenmiş olabilir. İlk durumda, tüm periferik karboksil grubu PEG birimleri ile değiştirilir - PEGylation olarak bilinen bir yöntem. İkinci durumda, birkaç karboksil grubu ilk iki foton anten kromoforlar (Kumarin-343) kalan carboxyls PEGylation takip etilendiamin (EDA) linkers ile modifiye edilmiş [6]. Birleştiğinde Dendrimers HBTU / DIPEA kaplin kimya kullanarak monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. MW 1000) kullanarak pegile. NMP dendron (veya DMF) (1-10 mM) HBTU 1.25 kat daha fazla bir çözüm için 2.14) eklendi ve reaksiyon karışımı oda sıcaklığında 10 dakika karıştırılır. M-PEG-NH2 1.25 kat daha fazla hemen ilave edilerek takip DIPEA 6.25-Fold fazla eklendi. Reaksiyon karışımı rt az 2 gün süreyle karıştırıldı. Dietil eter reaksiyon karışımına eklendi, oluşan çökelti THF dietil eter eklenerek santrifüj ve yeniden çöktürülmüş ayrıldı. 2.15) Final arıtma ilk ön faz toplama boyut dışlama kromatografisi ile elde edildi. Pegile porfirin-dendrimer THF (~ 15 ml) küçük bir miktar çözülür ve polistiren SEC faz (Biorad, Biobeads S-X1) ile dolu bir kromatografik sütun üstüne yüklenmişti. Sütun saf THF ile yıkandı ve ön hareket eden koyu renkli bant toplanmıştır. 2.16) THF döner buharlaştırıcı çıkarıldı ve geri kalan malzeme vakum kurutulur. 3. Probe karakterizasyonu Photophysical karakterizasyonu prob absorpsiyon ve emisyon spektrumları, fosforesans ömürleri τ 0 ve Stern-Volmer oksijen su verme sabitleri k q altında fizyolojik şartlar ölçümleri içerir. 3.1), standart enstrümantasyon (spektrofotometre ve kararlı flüorometre) kullanarak ortam koşulları altında absorpsiyon ve emisyon spektrumları elde edilir. ~ 1 mcM çözümler prob kullanılır. 3.2) yanında, Stern-Volmer kalibrasyon arsa elde edilir. Bu, en önemli ölçü, bize oksijen konsantrasyonu probun ömrü ilişki sağlar çünkü. 3.3), PBS (pH 7.2) probu bir çözüm portları ile uyarma ve emisyon optik fiberler ışık geçirmez bir kafes içinde bulunan ısı kontrollü odasının içine yerleştirilmiş özel bir silindirik küvet yerleştirilir. Lifler dik açılı geometri odası içinde küvet ile yakın temas haline getirilir. 3.4) küvet içine son derece hassas bir Clark-tipi oksijen elektrot (CK-oksijen elektrot) eklenir, bir stoper ile kapatılmıştır. Stoper de argon giriş ve çıkış için iki iğne portları içerir. Iğneler sadece çözüm yüzeyi üzerinde gaz akışını akışını sağlamak ise elektrot, çözüm içine batırılır. İlk başta, argon girişine bağlı değildir. 3.5), sıcaklık istenen değere (genellikle 36-37 ° C) ayarlanır ve çözüm dengeleme için karıştırma altında bırakılmıştır. 3.6) uyarma fiber bir PC tarafından işletilen bir dijital phosphorometer ikaz portu, bağlı. Phosphorometer çıkış 333 kHz D / A yönetim kurulu tarafından kontrol edilir bir yüksek güç LED ışık kaynağı. Emisyon fiber optik, son derece duyarlı kızılötesi APD (çığ fotodiyot) ile birleştiğinde phosphorometer, başka bir bağlantı noktasına bağlanır. Diyot çıkış amplifiye ve eksitasyon ve emisyon kanalları arasında senkronizasyon sağlayan aynı kumanda panosu, A / D kanal içine beslenir. 3.7) kontrolü yazılımı aluyarma bakliyat, rasgele seçilen bir süre (genellikle 2-3 ms) sırasında fosforesans çürüme koleksiyon tarafından istenen herhangi bir uzunluğu (örneğin 5 veya 10 ms), alçak nesil. Tek bir ömür boyu ölçümü için gerekli süre genellikle 0.5-1 s, ancak, ölçümler gibi hızla saniyede 10-20 olarak elde edilebilir. 3.8) aynı bilgisayarda başka bir A / D board içine oksijen elektrot çıkış amplifiye ve yönlendirilir. Bu, belirli zaman dilimlerinde geçerli olan elektrot kaydetmek için kullanılan düşük frekanslı kurulu (1 kHz max). Elektrot veri kayıt için program phosphorometer yazılımı ile aynı anda çalışır. 3.9), çözüm sıcaklığı dengelenmiş sonra phosphorometer ve elektrot programları ölçümleri her 10 sn gerçekleştirmek için, aynı anda başlatıldı. Onların çıkışları iki ayrı dosyalar halinde eş zamanlı olarak kaydedilir. Bundan sonra, argon, küvet stoper giriş bağlantı noktasına bağlanır. 3.10), argon gibi karıştırılır çözüm yüzey üzerinde akar, yavaş yavaş oksijen yerine geçer. Elektrot akımı bir azalma ve fosforesans ömrü, phosphorometer ile ölçülen bir artış ile sonuçlanır. Genellikle, oksijen verileri tamamen dosyaları otomatik olarak kaydedilir ve bu süre boyunca, yaklaşık 2 saat sonra tamamen formu çözüm yerinden edilir. 3.11) titrasyon çalışması sona erdikten sonra, elektrot veri ve fosforesans ömürleri standart bir analiz programı (örneğin Miocrocal Kökeni) alınır. Oksijen konsantrasyonu elektrot akımı doğrusal bağlıdır ve elektrot için sıfır oksijen neredeyse sıfırdır. Atmosferik basınç altında, pO 2 (150 mm Hg hakkında) bilinir. Böylece, elektrot veri doğrudan oksijen ölçeğine dönüştürülür, vs pO 2 ters fosforesans ömrü, arsa ve inşa edilebilir. Bu komplo, eğim gibi oksijen su verme sabit kq vermek için en küçük kareler yöntemi kullanarak düz bir çizgi ile donatılmıştır. Fosforesans ömrü t0 da aynı uyum (önünü ters gibi) ya da doğrudan sıfır oksijen ölçüm elde edilir. 3.12), yüksek konsantrasyonlarda kan plazma bulunan bir protein, - Gerekirse, albümin varlığında prob bir çözüm kullanarak titrasyon tekrarlanır koşulları taklit etmek amacıyla (bir hayvanın kan gerçek deneysel sistem bir araya geldi in vivo). Elde Stern-Volmer araziler dendrimer prob iyi koruyor ve PEG gruplar albümin ile temas probu izole eğer aynı olmalıdır. Aksi takdirde, prob ve kan proteinleri etkileşimde bulunacak ve oksijen ölçümleri belirsizlik neden değişmiş bir Stern-Volmer arsa yol açacaktır. Böylece elde edilen kalibrasyon sabitleri, oksijen konsantrasyonu, a priori bir bilinmeyen görüntüleme deneylerinde kullanılır.

<ol>
	<li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence.">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li><li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+phosphorescence:+A+novel+method+for+measuring+the+distribution+of+oxygen+in+perfused+tissue.">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li><li>Lebedev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+phosphorescent+probes+for+oxygen+Imaging+in+biological+systems.">Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems.</a> Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).</li><li>Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+versatile+synthesis+of+substituted+tetrabenzoporphyrins.">Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins.</a> Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).</li><li>Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rothemund+and+Adler-Longo+Reactions+revisited:+Synthesis+of+tetraphenylporphyrins+under+equilibrium+conditions.">Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions.</a> Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).</li><li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen.">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li></ol>

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt; Kısaltma</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt; Tam isim</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N-methylpyrrolidinone</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt; Trifloroasetik asit</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt; Diisopropylethylamine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt; Dimethylsülfoksit</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1-kloro-3 ,5-dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N-methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

synthesis and calibration of phosphorescent nanoprobes for oxygen imaging in biological systems

Oksijen ölçüm fosforesans su verme [1, 2] tarafından aşağıdaki adımlardan oluşur: 1) prob ilgi orta (örneğin, kan veya interstisyel sıvı) teslim edilir, 2) nesne için uygun dalga boyu ışık ile aydınlatılmış heyecanlandırmak için , üçlü haline prob; 3) yayılan fosforesans toplanan ve zaman ders oksijen konsantrasyonu (veya kısmi basıncı, pO dönüştürülür fosforesans ömrü, verim için analiz<sub&gt; 2</sub&gt;). Prob biyolojik çevre ile etkileşim ve bazı durumlarda ölçüm tamamlanmasının ardından orta atılır) 4. Bu adımların her biri, ölçüm protokolü sadece invaziv bileşeni oluşturan fosforlu probları, moleküler tasarım gereksinimleri dayatır. Burada, biyolojik sistemlerde oksijen ölçümleri için dendritik fosforlu nanosensors tasarım gözden geçirin. Probları Pt veya polietilen glikol (PEG) artıkları ile periferik değiştirilmiş Pd porfirin-tabanlı polyarylglycine (AG) dendrimers oluşur. Etkili iki foton uyarma için, dendrimers Termini (Förster Rezonans Enerji Transferi) FRET uyarma enerji yakalama ve intramoleküler üzerinden probları üçlü çekirdek kanal iki foton anten kromoforlar, değişiklik olabilir. Biz, problar ve mevcut Ayrıntılı kalibrasyon protokolü anahtar photophysical özellikleri açıklanmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems at JoVE.com

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Biz fosforesans giderici ve biyolojik sistemlerde oksijen görüntüleme için porfirin-tabanlı dendritik nanosensors gözden tasarım ilkeleri oksijen ölçümleri sunuyoruz.

Biyolojik Sistemleri Oksijen Görüntüleme Fosforlu Nanoprobes sentezi ve Kalibrasyon

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

synthesis-calibration-phosphorescent-nanoprobes-for-oxygen-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Görüntüleme.  University of Pennsylvania. Biz fosforesans giderici ve biyolojik sistemlerde oksijen görüntüleme için porfirin-tabanlı dendritik nanosensors gözden tasarım ilkeleri oksijen ölçümleri sunuyoruz.

Video: Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Teşhis Araçları Geliştirmek İçin Mikro-Elektro-Mekanik Sistemler (MEMS)

Biyoloji

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

Tüm Kalp Görüntüleme Floresan Optik Projeksiyon Tomografi tarihi Normalizasyon

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteinler

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

Biyolojik Sistemleri Oksijen Görüntüleme Fosforlu Nanoprobes sentezi ve Kalibrasyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler