Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse nicht unterstützt. 213/09 vom israelischen Science Foundation, Grant No. 2005258 vom BSF Stiftung Grant No. 201665 vom European Research Council (ERC) und der Russell Berrie Institut für Nanotechnologie am Technion. Wir erkennen die Hilfe von Prof. Noam Adir und Faris Salame aus der Schulich Fakultät für Chemie am Technion in Bezug auf die Versorgung und Behandlung der Cyanobakterien. Die Hilfe und die Unterstützung von Svetlana Yoffis vom Technion Micro-Nano Fabrication Unit ist sehr geschätzt.

1. Übersicht der ESR Micro-Imaging Erstens bieten wir eine kurze Erläuterung der ESR, ESR-Mikroskopie und die verschiedenen Komponenten unseres Systems, und dann werden wir die tatsächliche Imaging Experimente beschreiben. Elektronen-Spin-Resonanz ist eine spektroskopische Technik, bei der elektromagnetische Strahlung bei einer bestimmten Frequenz durch Moleküle mit ungepaarten Elektronenspins absorbiert wird, platziert im Rahmen eines externen statischen Magnetfeld (Abbildung 1). ESR ist in weiten Bereichen der Wissenschaft, wie Chemie, Biologie, Physik und Materialwissenschaften beschäftigt, für die Detektion und Identifizierung von freien Radikalen und paramagnetischen Zentren. Es ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der Umgebung von paramagnetischen Molekülen in lebenden Arten und gibt Auskunft über Säuregrad (pH), Viskosität, Sauerstoff und reaktiven Sauerstoff-Spezies-Konzentrationen 3. Für heterogene Proben, kann ESR spektralen Informationen in ortsaufgelöst (dh durch den Erwerb eines Bildes) gewonnen werden, durch den Einsatz von Magnetfeldgradienten 4. Dies ist sehr ähnlich zu den gängigen Verfahren der Magnetresonanztomographie (MRT), die vor allem beobachtet Protonenspins. Bis jetzt wurden solche ESR bildgebenden Verfahren für lebende Exemplare mit relativ großen Abmessungen von wenigen Zentimetern und in mm-Skala Auflösung. (Zum Beispiel siehe Abbildung 2 aus Lit. 5 entnommen.) Eine relativ neue Entwicklung in ESR-Bildgebung ist die Erweiterung seiner Fähigkeiten aus der Betrachtung Kleintiere im Millimeter-Skala Auflösung der Messungen von Millimeter-und Sub-Millimeter-Größe Proben mit Mikrometer-Skala Auflösung. Dieses Feld wird als ESR-Mikroskopie, die heute 3D-ESR Bilder mit einer Auflösung von fast 1 micron 2 (siehe repräsentative Beispiele in Abbildung 3) kann liefern bekannt. Ein ESR-Mikroskop ist im Wesentlichen ähnlich wie bei einem konventionellen ESR-Spektrometers. Es hat einen Magneten zur Erzeugung des statischen Feldes, ein Mikrowellen-System zum Spinanregung und Signalerkennung, eine Sonde zur Aufnahme der Probe, und ein EDV-Konsole auf den Erwerb Prozess-und Daten-Handling zu kontrollieren. Andere Komponenten einzigartige ESR Bildgebung im Allgemeinen und auch in bestehende ESR Mikrokopie sind Magnetfeldgradienten Quellen, die Teil des elektronischen Systems sind, und Gradientenspulen, die in der Imaging-Sonde entfernt. Weitere Details über unsere speziellen Systems sind in das Protokoll Film gezeigt und beschrieben in Referenz 2. 2. ESR Micro-Imaging Probenvorbereitung Diese Stufe beschreibt die Methode für die Probenvorbereitung für die ESR-Mikro-Imaging Experiment. Am Ende dieser Phase-Zellen sind an der Unterseite eines speziell präparierten Glas ESR-Mikroskopie Probenbehälter zusammen mit einem Trityl-Radikals 6 Pufferlösung gelegt. Dieses Protokoll beschreibt die Messung von Cyanobakterien-Zellen und somit für andere Arten von Zellen, angemessene Anpassungen können in der Probenvorbereitung der Bühne benötigt werden. <ol><li> Zuerst werden ein paar Plätze von saugfähigen Papier mit einer Größe von ~ 400 400 um entnommen und in ein Eppendorf-Röhrchen, die anschließend mit 1,2 ml der Cyanobakterien Suspension (bei einer Konzentration von 40 mg / mL) gefüllt ist. </li><li> Die Suspension wird für 2 Minuten bei 6000 RPM in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. </li><li> Anschließend wird der Überstand Puffer vollständig außer für ~ 50 ul, die von links nach Cyanobakterien Austrocknung zu vermeiden, werden entfernt. Als Ergebnis dieses Prozesses ist die saugfähigen Papier nun durch die Cyanobakterien-Zellen gesättigt. </li><li> Mit feinen Pinzette, sind ein paar Fasern aus dem Papier extrahiert und auf dem Boden eines topfartigen speziell präparierten Glasprobe Halter 7. Nach, dass eine 3 mM Trityl in BG-11-Lösung 8, 9 (siehe Schema 1), um den Probenhalter wird durch die Hilfe einer feinen Spritze zugegeben. Der Halter ist dann versiegelt mit UV-härtenden Klebstoff, so dass eine kleine Luftauslass zu öffnen. <table border="1"><tbody><tr><td> Lager 4 </td><td> Lager 3 </td><td> Lager 2 </td><td> Lager 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 Mg EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> Eisenammoniumcitrat 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7 H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> Zitronensäure: 1H2O 0.6g/liter </td&gt; </tr><tr><td> CuSO 4: 5 H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6 H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Schema 1. Vorbereitung der BG-11 Medium. </li></ol> 3. ESR Micro-Imaging-Experiments <ol><li> Zu Beginn der Imaging-Experiment auf der ESR-Mikro-Imaging-System ein und legen die Probe in den Resonator, die innerhalb der Imaging-Sonde geht. </li><li> Jetzt, mit dem Computer-Software, stellen Sie das System auf &quot;Tune&quot;-Modus und finden Sie die Resonanz Mikrowellenfrequenz der Sonde, die für die ESR-Messungen verwendet werden. </li><li> Im Anschluss daran setzte das statische Magnetfeld auf den Wert, dass die angewandten Mikrowellenfrequenz entspricht, setzen Sie die Timing-Parameter für die Impulsfolge und beobachten Sie die ESR-Signal, um sicherzustellen, dass das System gut funktioniert und die Probe wird gut vorbereitet. </li><li> Dann setzen Sie die Imaging-Parameter, wie zB die Anzahl der Pixel, die Stärke des Gradienten und die Länge der Gradientenpulsen ihre geforderten Werte. </li><li> Nach Setup sammeln drei 3D-ESR Bilder von einem Hahn-Echo-Bildgebung Pulssequenz (Abbildung 4) mit Puls-Trennung, Werte  500, 600 und 700 ns. </li><li> Licht auf die Probe projiziert wird ein-oder ausschalten abhängig von der erforderlichen experimentellen Bedingungen gedreht. </li><li> Bei der Aufnahme werden die Daten automatisch gespeichert. Thesen Rohdaten-Dateien werden dann via Matlab Software Skript verarbeitet werden, um Bilder der Tritylradikal Konzentration und die Relaxationszeit T 2 Karte, die in einer Sauerstoff-Konzentration image via vorbestehenden Kalibrierung übersetzt sind. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Die Ergebnisse des Experiments sind mehrere dreidimensionale ESR Mikro-Bilder mit unterschiedlichen τ-Werte aufgezeichnet. Typische Rohdaten Bilder sind in Abbildung 5 zur Verfügung gestellt. Die besten drei Bilder, unter dunklen Bedingungen gemessen, sind sehr ähnlich, außer für die Reduktion der Signalintensität. Auf der anderen Seite, das Bildmuster Veränderungen unter Bestrahlung mit Licht durch die unterschiedlichen Relaxationszeiten in verschiedenen Teilen der Probe. Diese Daten können 1 verarbeitet werden, um eine Amplitude Bild zu erhalten, wie in Abbildung 6 gezeigt, und auch Bilder von der Relaxationszeit T 2 (Abbildung 7). Die T 2 Bilder werden in Sauerstoffkonzentration Werte über eine bereits vorhandene Kalibrierkurve, dass die Sauerstoffkonzentration auf die Relaxationszeit über die Gleichung Links übersetzt: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="Gleichung 1" /> Hier ist T 2 0 der Spin-Spin-Relaxationszeit von der Sonde unter anoxischen Bedingungen (abhängig von der Sonde Konzentration, C, und die Diffusionskoeffizienten, D), und k eine Proportionalitätskonstante ist. In den meisten Fällen ist der Diffusionskoeffizient variiert nur wenig für die Live-Proben (obwohl, wenn nötig, es kann im Prinzip direkt ausgewertet auch durch ESR 6, 10), und die Spin-Konzentration während der bildgebenden Verfahren erhalten. Daher kann diese Beziehung zur direkten Messung der Sauerstoffkonzentration werden. Gehen wir zurück zu Abbildung 6 geht hervor, aus der Amplitude Bild, dass die Cyanobakterien-Zellen hauptsächlich auf der rechten Seite des Probenhalters befanden. Darüber hinaus, basierend auf Abbildung 7, ist es klar, dass das Licht die Produktion von O 2 initiiert und führt zu einem signifikanten Anstieg in der Lösung O 2-Konzentration, vor allem in der Voxel in der Nähe der Cyanobakterien. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Energie-Ebenen in Elektronen-Spin-Resonanz. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Typische Sauerstoffkonzentration Bild einer tumortragenden Maus. Das Bild links zeigt die anatomischen Informationen, auf einem MRT-Bild basiert. Ein stabiles freies organisches Radikal war es, die Maus injiziert und dessen ESR Eigenschaften bieten die Sauerstoffkonzentration an seine Umwelt (rechts). ESR-basierte Ergebnisse sind in der MRT anatomischen Bild überlagert. Sehfeld von 32 mm. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Zwei Beispiele für hochauflösende Mikro-Maßstab ESR Bilder von photolithographisch erzeugte Probe mit N @ C 60 Pulver (links) und LiPc paramagnetischen Kristallen (rechts) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4: Typische Hahn bildgebenden Pulssequenz zeigt der Mikrowelle (MW) und Steigung, G x, G y und G z Impulse. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5: Typische Rohdaten ESR Mikro-Bilder: a, b und c sind Rohdaten der Cyanobakterium Probe ohne Beleuchtung für τ gemessen = 500600700 ns bzw.. Items d, e, und sind die gleichen wie a, b und c, aber mit Beleuchtung. Die Intensität ist in willkürlichen Maßstab aufgetragen (ist aber in jedem Satz von drei dunkle oder helle Rohdaten Bilder konsistent) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6: Amplitude entsprechendes Bild der radikalen Konzentration in der Lösung (willkürliche Skala). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7: T 2 Bilder und die entsprechenden [O 2] Werte unter dunkel (links) und Licht (rechts) Bedingungen.

<ol>
	<li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance.">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li><li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution:+methodology+and+applications.">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li><li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR:+when,+how+and+why?.">In vivo EPR: when, how and why?.</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li><li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).</li><li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI.">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li><li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE.">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , (2010).</li><li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy.">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li><li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae.">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+Assignments,+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria.">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance.">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li></ol>

Dieses Protokoll zeigt, wie ESR Mikro-Imaging eingesetzt werden, um Sauerstoff-Konzentration in der Nähe leben, kleine Proben abzubilden. Eine räumliche Auflösung von ca. 30 x 30 x 100 pm nachgewiesen wird, mit nahezu mikromolaren Sauerstoffkonzentration Sensitivität und sub-Femtomol absolute Sauerstoffempfindlichkeit pro Voxel. Der Einsatz von ESR Mikro-Imaging für Sauerstoff-Mapping in der Nähe Zellen ergänzt die derzeit verfügbaren Techniken der Mikro-Elektroden oder Fluoreszenz / Phosphoreszenz basiert. Darüber hinaus mit der richtigen paramagnetischen Sonde, wird es leicht anwendbar für die intrazelluläre Sauerstoff-Mikro-Imaging, eine Fähigkeit, die andere Methoden finden, sehr schwer zu erreichen. In naher Zukunft planen wir auf eine weitere Verbesserung dieser Methodik zu leben Probe Bilder mit einer Auflösung von wenigen Mikrometern zu schaffen, bietet dagegen Parameter wie Superoxid-Konzentration, Säuregrad (pH), Sonde Diffusionskoeffizienten und, natürlich, Sauerstoffkonzentration. Diese Fähigkeiten sind komplementär zu den aktuellen optischen-basierten Methoden sowohl in Bezug auf Kontrast-Typ und auch von Proben Merkmale (z. B. nicht-transparenten dicken Proben und in einigen Fällen intrazellulären vs extrazelluläre Messungen).

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Heraus, 75003235</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Microliter 7000.5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet Curing</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA63, or NOA61.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electron spin resonance micro-imaging of live species for oxygen mapping

Dieses Protokoll beschreibt ein Elektron-Spin-Resonanz (ESR) Mikro-Imaging-Methode zur dreidimensionalen Abbildung von Sauerstoff in der unmittelbaren Umgebung lebende Zellen mit Mikrometer-Skala Auflösung 1. Sauerstoff ist eines der wichtigsten Moleküle in den Kreislauf des Lebens. Es dient als terminaler Elektronenakzeptor der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien und ist in der Produktion von reaktiven Sauerstoff-Spezies verwendet. Messungen der Sauerstoff für das Studium der Mitochondrien und Stoffwechselfunktionen, Signalwege, die Auswirkungen der verschiedenen Reize, Membranpermeabilität und Krankheit Differenzierung wichtig. Sauerstoffverbrauch ist daher eine informative Marker des zellulären Stoffwechsels, die weitgehend für die verschiedenen biologischen Systemen aus den Mitochondrien von Zellen bis zu ganzen Organismen ist. Aufgrund seiner Bedeutung ist, haben viele Methoden für die Messung von Sauerstoff in Live-Systemen entwickelt. Aktuelle Versuche, hochauflösenden Sauerstoff Bildgebung bieten sich vor allem auf optische Fluoreszenz und Phosphoreszenz Methoden, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen, wie sie Sonden mit hoher Bild-Toxizität und geringe Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff beschäftigen scheitern basiert. ESR, die das Signal vom exogenen paramagnetischen Sonden in der Probe misst, ist bekannt, dass sehr genaue Messungen der Sauerstoffkonzentration liefern. In einem typischen Fall map ESR-Messungen der Sonde Linienform Verbreiterung und / oder Entspannungs-Zeit verkürzen, die direkt an der lokalen Sauerstoffkonzentration verbunden. (Sauerstoff ist paramagnetisch; daher beim Zusammenstoß mit der exogenen paramagnetischen Sonde, Kurzatmigkeit sie ihren Relaxationszeiten.) Traditionell diese Art von Experimenten mit niedriger Auflösung, Millimeter-Skala ESR für Kleintiere Imaging durchgeführt. Hier zeigen wir, wie ESR Bildgebung kann auch in den Mikrometer-Maßstab durchgeführt werden für die Untersuchung von kleinen Live-Proben. ESR Mikro-Imaging ist eine relativ neue Methode, die den Erwerb von ortsaufgelösten ESR-Signale mit einer Auflösung von fast 1 Mikron bei Raumtemperatur 2 ermöglicht. Das Hauptziel dieses Protokoll-Papier ist zu zeigen, wie diese neue Methode, zusammen mit neu entwickelten Sauerstoff-sensitive Sonden kann die Zuordnung der Sauerstoffgehalt in kleine Live-Proben angewandt werden. Eine räumliche Auflösung von ca. 30 x 30 x 100 pm nachgewiesen wird, mit nahezu mikromolaren Sauerstoffkonzentration Sensitivität und sub-Femtomol absolute Sauerstoffempfindlichkeit pro Voxel. Der Einsatz von ESR Mikro-Imaging für Sauerstoff-Mapping in der Nähe Zellen ergänzt die derzeit verfügbaren Techniken der Mikro-Elektroden oder Fluoreszenz / Phosphoreszenz basiert. Darüber hinaus mit der richtigen paramagnetischen Sonde, wird es auch leicht anwendbar für die intrazelluläre Sauerstoff-Mikro-Imaging, eine Fähigkeit, die andere Methoden finden, sehr schwer zu erreichen.

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Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Mikrometer-Skala dreidimensionale Bildgebung der Sauerstoffkonzentration in der unmittelbaren Umgebung der lebenden Zellen durch Elektronen-Spin-Resonanz-Mikroskopie.

Elektronen-Spin-Resonanz-Micro-Imaging an lebenden Spezies, bei Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K Aufrufe.  The Technion, Israel Institute of Technology. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Mikrometer-Skala dreidimensionale Bildgebung der Sauerstoffkonzentration in der unmittelbaren Umgebung der lebenden Zellen durch Elektronen-Spin-Resonanz-Mikroskopie.

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A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Forschung

Biologie

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

Gleichzeitige Zuordnung und Quantifizierung der Purine im menschlichen mitochondrialen DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

Untersucht die nachteiligen Effekte der Low Druck Plasmasterilisation auf das Überleben von Bacillus Subtilis Sporen mittels Live Cell Mikroskopie

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Bewertung des agrochemischen Risikos für gepaarte Honigbienenköniginnen

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...