Die HCC4017 und HBEC30KT Zelllinien wurden freundlicherweise von Dr. John Minna Labor zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von der Cecil und Ida H. Grün Mittel Dr. Li Zhang unterstützt.

ACHTUNG: Während der Arbeit mit Radioaktivität, geeignete Vorkehrungen treffen, um eine Kontamination des Experimentators und die Umgebung zu vermeiden. Entsorgen Sie alle Abfälle folgenden lokalen Strahlenschutz-Richtlinien. 1. Herstellung der Zellen <ol><li> Saatgutzellen in 3,5 cm-Platten, so dass die Konfluenz erreicht 80% -90% am Tag des Tests. <ol><li> Man beachte, dass der Aussaat Konfluenz für Zellen hängt vom Zelltyp und ihre Wachstumsrate. Bei der Behandlung von Zellen mit einem Reagenz für eine bestimmte Anzahl von Tagen, Samenzellen, so dass die Konfluenz von 80% -90% am Tag des Häm-Messung. Wenn die Anzahl der Zellen, die aus 3,5 cm Platten erhalten nicht ausreicht, ist 6 cm-Platten mit derselben Menge an radioaktivem ALA, wie im nächsten Schritt. Anmerkung: Die Verwendung von einzelnen Platten wird empfohlen, da es leichter ist, einzelne Platten zu handhaben. </li></ol></li><li> Einen Tag vor Häm-Messung, fügen Sie 0,1 bis 0,3 &amp; mgr; Ci [14 C] 5-ALA und kalten ALA, um eine endgültige c erreichenONZENTRATION von 20 &amp; mgr; M der gesamten ALA zu jeder Kulturschale in einem Arbeitsbereich fit für die Arbeit mit radioaktiven Stoffen und stellte die Teller wieder in den Inkubator. Im Idealfall inkubieren mit radioaktiven ALA 16 Stunden. Anmerkung: Radioaktiv markierte 5-ALA erforderlich kann zwischen Zelllinien variieren. Eine radioaktive Zählung pro Minute (cpm) von mindestens 100 erforderlich ist, um den Fehler mit der Zählung zu minimieren. Empfiehlt es sich, eine minimale Menge an [14 C] 5-ALA für die Zelllinien untersucht erforderlich zu bestimmen. Für die meisten Experimente 0,1-0,3 uCi ist ausreichend, um eine gute Messung zu erhalten. Zugabe von kaltem ALA ist optional. </li></ol> 2. Heme Extraction <ol><li> Legen Sie die Zellkulturschalen auf Eis und nehmen sie in den Bereich fit für Radioaktivität Arbeit. <ol><li> Führen Sie die gesamte Extraktion und Verdampfungsprozess in einem explosionssicheren Motorhaube. Da die gespeicherte Äther explodieren kann, verwenden Sie den Äther in kleinen Flaschen und verdampfen alle verbleibenden Flüssigkeiten, speichern keine Äther ineine offene Flasche für mehr als einen Monat. Verwenden Sie kein Aceton in der Nähe von offenen Flammen und Öfen, wie sie ist leicht entzündlich. Shop Aceton enthält Reagenzien, die in Glasflaschen, wie sie löst Gewebekultur Kunststoffen. </li></ol></li><li> Absaugen des Mediums mit einer Pipette. Mit 1 ml kaltem PBS 1x waschen Sie die Zellen einmal. Absaugen PBS. </li><li> 1 ml kaltem PBS 1x zu den Platten und sammelt die Zellen am Boden der Platte mit einem Gummischaber. Übertragen Sie die gesammelten Zellen von jeder Platte mit einer markierten vorgekühlte 2-ml-Tube. Sammeln Sie alle Zellen in 2 ml-Röhrchen. Hinweis: Verwenden Sie eine frische Gummiwischer für jede Platte zum Abstreifen Zellen von jeder Platte. Für jede Platte würden Sie vier 2-ml-Röhrchen, ein 1,5-ml-Röhrchen und ein Szintillationsfläschchen erfordern. </li><li> Schleudern bei 15.000 × g für 1 min bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Sie PBS mit einer Pipette, eine kurze Spritztour und nehmen Sie das restliche PBS. Die Zellen in 100 ul 1x PBS. Vortex, um Zellen zu resuspendieren und auf Eis halten. </li><li> Nehmen Sie sich 10 &amp;# 956; l von Schritt 5 und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und store auf Eis, um die Proteinkonzentration zu messen. Anmerkung: Zelllysepuffer sollte zu den Zellen gegeben und auf Eis gehalten, um die Proteinkonzentration höher messen. </li><li> Dreh die restlichen 90 &amp; mgr; l aus Schritt 5 bei 5.000 xg für 30 sec bei 4 ° C; Entfernen PBS komplett mit einem 200 ul Pipettenspitze. </li><li> Fügen Sie 300 ul Häm-Extraktionspuffer (siehe Materialliste) in jedes Röhrchen. Dann Vortex für 15 Sekunden zu mischen und setzen auf Eis für 1 min, wiederholen Sie diese 3-mal. <ol><li> In Häm-Extraktionspuffer (HEB) und das Röhrchen vortexen schnell, um das Pellet zu resuspendieren, tun nur ein oder zwei Röhren in einer Zeit, da das Pellet sollte schnell, ohne in der HEB zu lange suspendiert werden. Sobald HEB wird auf alle Röhrchen gegeben und Pellet wird dann resuspendiert folgen Sie der 15 sec Vortex und 1 min auf Eis-Zyklus, wie in Schritt 8. Hinweis, dass Pellets nicht vollständig in die HEB zu gehen, wenn das Pellet wird in der HEB-Puffer für einen linken längerZeit und nicht schnell resuspendiert. </li></ol></li><li> Wird mit 1,2 ml Diethylether zugefügt und Vortex für 30 Sekunden. Schleudern bei 15.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Anmerkung: Diethylether abläuft von Pipettenspitzen schnell. Um dies zu, Pipetten Diethylether auf und ab oder zweimal zu kontrollieren, dabei hilft, halten Sie die Diethylether in der Pipette. Wiederholen Sie diesen jedes Mal eine frische Pipettenspitze verwendet wird. </li><li> Übertragen Sie oben (ether) Phase mit 1 ml Pipette in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Wie in Schritt 9 Fügen Sie 0,5 ml 2 N HCl, Wirbel zu mischen und Spin. Anmerkung: Es ist schwierig, die Trennung zwischen Ether und HCl Phasen anzusehen. Daher fügen Sie kleine Mengen von Trypanblau in 2 N HCl-Lösung auf während des Experiments verwendet werden, reicht es eine hellblaue Farbe zu geben. Dies wird Ihnen helfen zu unterscheiden die beiden Phasen. Die untere Phase wird blau und die obere Etherphase wird farblos sein. Übertragen Sie die obere farblos Etherphase in ein neues Röhrchen und entsorgen Sie die untere HCl (blau) Phase. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 10 zweimehrere Male, um die Ether-Phase mit 2 N HCl waschen. Übertragen Sie nur die obere Etherphase in ein neues Röhrchen bei jeder Wiederholung und entsorgen Sie die untere HCl-Phase. </li><li> Nach dem dritten Waschen mit HCl, übertragen Sie die obere Phase mit 1 ml Pipette in ein Szintillationsfläschchen. Trockne die Proben durch Verdampfen des Diethylether, indem die Proben in der chemischen Haube O / N. </li></ol> 3. Messung der Radioaktivität <ol><li> Am nächsten Tag, 5 ml Szintillationsflüssigkeit zu den getrockneten Proben aus Schritt 2.12. </li><li> Gut schütteln um zu mischen. Messung der Radioaktivität unter Verwendung eines Szintillationszählers. </li></ol> 4. Berechnungen <ol><li> Lyse der Zellen aus Schritt 2.6 mit gleichen Mengen CelLytic M-Puffer (siehe Materialien List) und Schleudern bei 14.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Sie ein Aliquot des Überstandes und Messung der Proteinkonzentration mit BCA-Protein-Assay-Kits. Gesamtproteinmenge in mg (TP) = (90 &amp; mgr; l * Konz. Von Protein in81; g / &amp; mgr; l) / 1.000 Hämsynthese Ebene (Radioaktivität / TP) = pmol / mg Protein. </li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Häm spielt eine Schlüsselrolle bei der Erzeugung von Zellenergie über die Atmung 26. Verändert Hämstoffwechsel bekanntermaßen mit verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs 28,41 zugeordnet sein. Die Inhibition der Häm-Synthese ist bekannt, Zellzyklusarrest und Apoptose in HeLa-Zellen 26,41 führen. Es hat sich gezeigt, dass hohe Hämsynthese Pegel wird mit dem Fortschreiten der Lungenkrebszellen 28 verbunden. Daher wäre es von großer Bedeutung sein, um die Nivea...

Häm, ein Komplex von Eisen und Protoporphyrin IX ist ein Zentralmolekül für den Transport und die Verwendung von Sauerstoff in praktisch allen lebenden Organismen 1-3. Die einzigartige Struktur der Häm ermöglicht es, als Träger von zweiatomigen Gase und Elektronen funktioniert, sowie auf verschiedene andere Funktionen 1-5 auszuführen. Bindet beispielsweise Häm zu Sauerstoff im Hämoglobin und Myoglobin für die Übertragung und Speicherung von Sauerstoff 6,7. Es funktioniert auch als Elektronenüberträger in der Cytochrome während der Atmung und wirkt als Elektronendonor für Redox-Reaktionen, die durch Cytochrom P450 Enzyme 8,9 katalysiert. Eines der signifikanten Merkmale des Häm ist, dass sie regulatorische Rolle bei der zellulären und molekularen Prozesse, wie Gen-Transkription, Proteinsynthese und Mikro RNA Biogenese 4 spielt. Beispielsweise wirkt sich die Transkription vieler Gene durch Steuerung der Aktivität von Säuger Transkriptionsrepressor BACH1 und Säugetiernuklear receptor Rev-erbα 10-15. Häm regelt die Aktivierung von Häm-Aktivatorprotein (HAP) 1, die eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Genen, die bei der Atmung und Steuerung oxidative Schädigung beteiligt spielt, in Reaktion auf Häm oder Sauerstoff 16. Häm regelt auch Gentranskription in neuronalen Zellen über den Nervenwachstumsfaktor (NGF) Signalisierungs 3,17-20. Ferner regelt die Proteinsynthese in Säugern erythroiden Zellen durch Modulierung der Aktivität des Häm-regulierten Kinase eIF2a (HRI) 21-24. Darüber hinaus beeinflussen die Aktivität des Häm Schlüsselsignalproteine ​​wie Tyrosinkinase Src Jak2 und, was für die korrekte Zellfunktion und das Zellwachstum 4,20,25 sind. Es wurde festgestellt, dass in HeLa-Zellen Häm-Hemmung bewirkt Zellzyklusarrest und die Aktivierung der Marker mit Seneszenz und Apoptose 26 verbunden. Sowohl Häm-Mangel oder ein höheres Maß an Häm sind mit schweren Auswirkungen auf die Gesundheit des Menschen 27 verbunden. Neueste Molekular einnd epidemiologische Studien haben eine positive Assoziation mit hoher Häm Aufnahme und erhöhten Risiko von Krankheiten wie Typ-2-Diabetes, koronare Herzkrankheit und einige Krebsarten wie Lungenkrebs, Darmkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs 27,28 gezeigt. Mit Hilfe eines passendes Paar von normalen und Krebslungenzellen Autoren Labor haben gezeigt, dass Krebszellen Ebenen der Sauerstoffverbrauch, Häm-Synthese und Proteine ​​in Häm Aufnahme und Sauerstoffnutzung 28 beteiligten erhöht. Interessanterweise Hemmung der Häm-Synthese verringert den Sauerstoffverbrauch, Proliferation, Migration und Koloniebildung von Krebszellen 28. Somit spielt die Schwankungen der Konzentrationen von endogenem Häm eine wichtige Rolle bei der Regulation der molekularen und zellulären Prozessen 3,4,28,29. Bei Säugetieren erfolgt die Biosynthese von Häm in acht Stufen unter Einschluss von Enzymen in den Mitochondrien und im Cytosol 4 (Figur 1) befindet. Häm biosynArbeit beginnt in der Matrix der Mitochondrien mit der Kondensation von Glycin und Succinyl-CoA in der 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) zu bilden, durch ALA-Synthase (Ach) 4,31 katalysiert. Dies ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in Ham-Biosynthese in nonerythroid Zellen. 5-ALA wird dann in das Cytosol, wo die nächsten vier Schritte werden ausgeführt, um Coproporphyrinogen III (CPgenIII), die dann zurück in den Mitochondrien, wo sie in Protoporphyrin IX (PPIX) umgewandelt importiert bilden exportiert. Schließlich wird ein Molekül Eisen an den Protoporphyrin IX (PPIX) integriert, um Häm, eine Reaktion durch Ferrochelatase (FECH) 2,4 katalysiert zu produzieren. Die Höhe der Häm-Biosynthese hängt in erster Linie von der Höhe der ALAS-Enzym, die fest durch intrazelluläre Eisen und Häm 4 gesteuert wird. Die Biosynthese von Häm durch genetische Defekte, die Verfügbarkeit von bestimmten Mineralstoffen und Vitaminen (zB Riboflavin, Zink), Exposition gegenüber Toxinen (zB Aluminium, Blei betroffen), Anoxie, Fieber und Konzentration bestimmter Steroide (zB Östrogen) 32-35. Die Höhe der Häm-Synthese ist in verschiedenen krankhaften Zuständen verändert. Verringert Hämbiosynthese kann Anämie sowie neurologischen Erkrankungen 3,36 verursachen. Alternativ spielt erhöht Hämbiosynthese eine wichtige Rolle bei der Progression von bestimmten Krebs 28,37. Häm wurde gezeigt, entscheidend für das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben von Säuger Fettgewebe, erythroiden und neuronalen Zellen 4,38-41 sein. Zum Beispiel führt Häm Mangel an Neuriten Schaden in primären kortikalen Neuronen der Maus über die Hemmung der Glutamat-NMDA (N-Methyl-D-Aspartat) -Rezeptor-17. Zusätzlich Hemmung der Häm-Synthese verursacht programmierten Zelltod im menschlichen epithelialen Zervixkarzinom HeLa-Zellen 26,41. Daher ist es wichtig für die Untersuchung Ätiologie und progressi Messung der Häm-Biosynthese Ebenen in verschiedenen Zellen unter verschiedenen Bedingungenauf vieler Krankheiten. Hier beschreiben wir eine schnelle und empfindliche Methode, um das Niveau der intrazellulären Häm-Synthese unter Verwendung von [4- 14 C] 5-aminolevulic Säure zu messen. Dies ist ein alternatives Verfahren zu anderen Verfahren unter Verwendung von 55 Fe oder 59 Fe. Wir ziehen mit 14 C, da ihre Strahlung ist sehr schwach. Im Gegensatz dazu ist starken Schutz für die Arbeit mit Fe Isotope erforderlich. Weiterhin soll dieses Verfahren zur Messung und zum Vergleich Häm-Synthese in verschiedenen Zellen, die parallel in einer schnellen Weise. Um absolute Häm zu messen, kann man die zuvor festgelegte Verfahren, das die Verwendung von HPLC 42,43 zu verwenden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>650501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethy ether</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (Hydrochloric acid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A481-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Scintillation cocktail&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>882470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid</td>
			<td>Perkin-Elmer life sciences</td>
			<td></td>
			<td>Store @&#160; -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CelLytic M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2978</td>
			<td>Mammalian cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Specific reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Component</td>
			<td>Dispense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)</td>
			<td>Acetone</td>
			<td>25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated HCl</td>
			<td>1.3ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>5ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of heme synthesis levels in mammalian cells

Häm dient als prosthetische Gruppe für eine große Vielfalt von Proteinen als Hämoproteine, wie Hämoglobin, Myoglobin und Cytochrom bekannt. Es wird in verschiedenen molekularen und zellulären Prozessen wie Gentranskription, Translation, Zelldifferenzierung und Zellproliferation beteiligt. Die Biosynthese von Häm Stufen variieren in verschiedenen Geweben und Zelltypen und in Krankheitszuständen wie Anämie, Neuropathie und Krebs verändert. Diese Technik verwendet [4- 14 C] 5-Aminolävulinsäure ([14 C] 5-ALA), einer der ersten Vorstufen bei der Häm-Biosyntheseweg, das Niveau der Häm-Synthese in Säugetierzellen zu messen. Dieser Assay beinhaltet die Inkubation von Zellen, die mit [14 C] 5-ALA, gefolgt von Extraktion von Häm und die Messung der Radioaktivität in Häm inkorporiert. Diese Vorgehensweise ist präzise und schnell. Bei dieser Methode wird die relative Bedeutung der Häm-Biosynthese und nicht die Gesamt Häm-Gehalt. Um die Verwendung dieser techn demonstriereniQue das Niveau der Häm-Biosynthese wurden in mehreren Säugetierzelllinien gemessen.

Dieses Verfahren wurde verwendet, um das Niveau der Häm-Synthese in normal (HBEC30KT) gegen Krebs (HCC4017) Lungenzellen zu vergleichen. 2 zeigt ein höheres Niveau der Häm-Synthese in Krebszellen (HCC4017) als normale Lungenzellen (HBEC30KT). Das Niveau der Häm-Synthese wurde auch in normalen Zellen und Krebszellen in Gegenwart von mitochondrialen Entkoppler Carbonylcyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP) gemessen. Zellen wurden mit 10 uM CCCP 24 h vor der Messung Hämsynthese Ebenen behandelt. Wie erwa...

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Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Aufrufe.  University of Texas at Dallas. Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Serie: Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing und Subkultivierung Säugerzellen

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Forschung

Biologie

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

Biolumineszenz-Bildgebung von HO-1 Hochregulation in der Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.