Gehälter und Forschungsförderung wurden von der United Soybean Board zur Verfügung gestellt und von Staats-und Bundesmittel angeeignet, um an der Ohio State University / Ohio Agricultural Research and Development Center. Diese Arbeit wurde teilweise auch durch ein Stipendium CONACYT, Mexiko, zu cmHg unterstützt. Die Erwähnung von Markenzeichen oder urheberrechtlich geschützten Produkten nicht um eine Garantie oder Gewährleistung des Produkts durch OSU / OARDC und auch keine Zustimmung zum Ausschluss von anderen Produkten, die auch geeignet sein können. Journal Article No HCS 09-17.

Die folgende Methode beschreibt ein Protokoll für die Bildanalyse der Genexpression mit Hilfe eines automatisierten Bild Sammelsystem. Zur Vereinfachung der Erläuterung wurde der gesamte Ansatz in vier Schritte unterteilt: 1) Samen Vorbereitung, 2)-Gen Einführung mit Partikelbeschuss 3) Roboter-Bild-Sammlung, und 4) Bildanalyse. Obwohl diese allgemeine Methode für eine breite Palette von anderen Anwendungen verwendet werden können, sind die vorliegenden Sätze von Protokollen über den Einsatz des grün fluoreszierenden Proteins (GFP)-Gen, das eine nützliche Reportergen für die Verfolgung von Genexpression in dem gleichen Stück basiert von lebendem Gewebe im Laufe der Zeit. I. Saataufbereitung <ol><li> Lima Bohne (. Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush) Samen können gekauft werden, oder idealerweise von Pflanzen in einer Klimakammer gewachsen (50% relative Luftfeuchtigkeit, 16 / 8 h Licht: Dunkel, 25/23 ° C Tag / Nacht) geerntet. Nach der Ernte Samenqualität kann durch Speicherung Samen bei -20 ° C gehalten werden </li><li> Bereiten Magenta GA7 Behälter für keimenden Samen. Falten Filterpapier oder Papiertüchern in der Unterseite des Magenta-Boxen fit. Add ~ 25 ml destilliertem Wasser auf jeden Container auf Küchenpapier anfeuchten und abgießen absorbierte Wasser. Autoclave angefeuchteten Papier-haltigen Boxen für 20 min. </li><li> Mit 50 ml Einweg-Röhrchen, sterilisieren Samen in eine 10% ige handelsübliche Bleiche-Lösung (20 Samen in 20-40 ml) für 20 min unter Schütteln auf einem Kreiselschüttler bei 60 Umdrehungen pro Minute. Hinweis: Alle nachfolgenden Schritte sollten in einer Sterilbank durchgeführt werden. </li><li> Spülen Samen 4-7 mal mit sterilem, deionisiertem Wasser unter leichtem Rühren für 30 sec bei jeder Spülung. </li><li> Legen Sie 5-6 sterile Samen zwischen den Schichten des gefalteten Papiers in jedem sterile Magenta-Box befindet. </li><li> Inkubieren Samen für 4 Tage unter den folgenden Bedingungen: 25 ° C, 16 / 8 h Licht: Dunkel und 40 μEm -2 s -1. </li></ol> II. Gene Einführung mit Partikelbeschuss <ol><li> Build-Gen-Konstrukte mit Ihrem Lieblings-Expressionsvektor mit einem Reporter-Gen, das in lebenden Geweben überwacht werden kann. Wir haben technisch hoher Kopienzahl Expressionsvektor nützlich für Veranstalter und Promoter-Elemente-Analysen. Dieser Vektor enthält das GFP-Gen, mit dem Promotor / Promotor-Element-Funktion in transformierten Gewebe sichtbar ist. </li><li> Rund 1-2 h vor dem Bombardement, Verbrauchsteuern Limabohne Keimblätter aus Keimlingen und entfernen Sie die Samenschalen. Keimblätter für Bombardements sollte gelb bis hellgrün, flach und frei von Schäden, die mit weiteren Bildanalyse stören könnten. </li><li> Legen Sie Keimblätter auf OMS Kulturmedium mit MS-Salze 1, B5 Vitaminen 2, 3% Saccharose und 0,2% Gelrite (pH 5,7) unmittelbar nach dem herausgeschnitten. </li><li> Fällung der DNA auf M10 Wolfram-Teilchen (Sylvania, Towanda, PA, USA) zu konstruieren. In einem 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 25 ul Wolfram-Teilchen (Partikel werden in sterilem Wasser, 100 mg ml -1 resuspendiert, direkt vor Gebrauch), 5 ul DNA (1 ug ul -1), 25 ul 2,5 M Calciumchlorid (Sigma -Aldrich Cat. C3881-500G) und 10 ul 100 mM Spermidin (Sigma Cat. S-2626). Vortex kurz mischen alle Komponenten. </li><li> Inkubieren Sie die DNA-Präparation auf Eis für 5 min. Dann entfernen und entsorgen 50 ul Überstand. </li><li> Die DNA-beschichteten Partikeln durch Vortexen und sofort entfernen 2 ul Aliquot. Wiederholen Sie diesen Schritt Vortexen jedes Mal ein Aliquot aus dem Rohr entfernt ist. Beschichtete Partikel sollten in Eis aufbewahrt werden und innerhalb von 15 min. </li><li> Durch die Spitze einer Spritze Filter, Platz 2 ul beschichteten Partikel in der Mitte des Filters Bildschirm. Setzen Sie die Filter-Einheit mit der beschichteten Partikel im Filter Aufnahmeeinheit in der particle gun Kammer. </li><li> Legen Sie eine Limabohne cotyledon oberseits bis auf eine Schallwand und Ort der Schallwand in der particle gun Kammer. Die Schallwand, die aus einem Bildschirm geschmolzen, um den Boden eines Bechers besteht, wird als Plattform für die Gewebe während der Bombardierung Unterstützung verwendet wird. </li><li> Bombard das Gewebe mit Hilfe eines Particle Gun (in dieser Methodik, verwenden wir eine einfache und kostengünstige Particle Gun Zulauf 3, PIG, in unserem Labor entwickelt) wie folgt: a) Öffnen des Ventils führen, um das Vakuum an die Kammer zu evakuieren, b) nach das Vakuum erreicht 760 mm (30 Zoll) Hg, aktivieren Sie das Magnetventil und Freigabe des Heliums, die Partikel treiben, c) nach Partikelbeschuss, schließen Sie die Saugleitungsventil und das Vakuum mit dem Auslassventil. Die Helium-Druck verwendet werden, um Teilchen zu beschleunigen ist 50 PSI. </li><li> Nachdem das Vakuum freigesetzt wird, öffnen die Tür der Kammer, die bombardiert Keimblätter abrufen und zurückgeben cotyledon, oberseits bis zu OMS Kulturmedium. Hinweis: Für die Quantifizierung und Expression Profiling, wir in der Regel bombardieren ein Minimum von drei Keimblätter für jede DNA-Konstrukt. Eine positive Kontrolle, die in der Regel ist ein DNA-Konstrukt, das gibt ein gut untersuchtes Genexpressionsprofil, wird als Referenz enthalten. </li></ol> III. Automated Image Collection <ol><li> Schalten Sie die Quecksilberlampe und warten Sie 30 min für die Lampe, um sich aufzuwärmen. </li><li> Schalten Sie die Stromquelle für den Spot-RT-CCD-Kamera (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, USA) und der Robotik-Plattform Motorsteuerung, die die Bewegung der Robotik-Plattform treibt. </li><li> Setzen Sie die Filter-Set für GFP-Detektion (GFP2 Filter gesetzt;.. Ex 480/40 nm, EM 510 LP) auf einem MZFLIII Präpariermikroskop (Leica, Heerbrugg, Schweiz). </li><li> Sterilisieren der verdickten Polycarbonat Petrischale Deckel durch Besprühen mit 70% Ethanol. Die spezielle Deckel, der zur Abdeckung der Petrischale Basis verhindern Kondensation während image Kollektion 4. </li><li> Legen Sie die Platten mit bombardiert Keimblätter auf der Robotik-Plattform (Arrick Robotics, Hurst, TX, USA) der automatisierten Bild Sammelsystem. Die Robotik-Plattform wird durch einen Schrittmotor angetrieben und setzen besteht aus einem Tisch zur Befestigung von 8 Petrischalen. Die Plattform besteht aus Polycarbonat, Polypropylen und Aluminium. Die Platten werden in Position durch Anziehen einer seitlichen Kunststoff-Madenschraube befestigt. </li><li> Öffnen Sie die benutzerdefinierte Software-Anwendung, die sowohl die Robotik-Plattform und die Bildaufnahme steuert. Auch, öffnen Sie die Software weißes Licht Controller wechseln. </li><li> In der &quot;Motor motion&quot; Registerkarte auf &quot;Motor&quot; und &quot;Wohnmobil&quot; klicken. Nachdem die Software richtet die Plattform, um die Home-Position, sind wir bereit, um den Anfang Positionen für jedes Keimblatt. </li><li> In der &quot;Motor motion&quot;, wählen Sie die erste Platte. Die Plattform wird die Mitte der Petrischale unter dem Objektiv des Mikroskops Position. Mit dem beweglichen Abstand Tasten, exakt zu positionieren das erste Keimblatt für Bild-Sammlung. Mit dem weißen Licht-Controller auf, kann die Zielregion durch den Computer-Monitor, indem Sie auf den &quot;Live-Modus&quot;-Funktion beobachtet werden. </li><li> Für das erste Keimblatt, den Fokus und Vergrößerung (1,6 fach Vergrößerung ist bevorzugt) mit der manuellen Regler auf der Präpariermikroskop. Fokus Anpassungen für die übrigen Keimblätter auf der gleichen Platte gemacht mit drei Stellschrauben unter jeder Platte, auf der Robotik-Plattform. </li><li> Nachdem die Region von Interesse eingestellt wurde, klicken Sie auf den &quot;add dieser Position&quot;-Knopf. Die Software wird die Koordinaten dieser Region um eine Position Zeitplan-Datei hinzufügen und die Plattform wird in die Mitte der Platte zurück. </li><li> Stellen Sie die Positionen und Schwerpunkte für alle übrigen Keimblätter auf Tellern mit den beweglichen Abstand Tasten und manuelle Stellschrauben. Nach all den Koordinaten aller Keimblätter eingegeben worden sind, speichern Sie die Position Zeitplan koordiniert. </li><li> Geben Sie die Bildsammlung Parameter. In der &quot;Bild-Einstellung&quot;, wählen Sie die Art des Lichts gewünscht, weiß oder blau. Für GFP-Erkennung, sollte nur das blaue Licht verwendet werden. Geben Sie außerdem die Einstellung der Belichtung. Obwohl wir die Zeit der Exposition für Rot, Blau und Grün Farbe ändern können, verwenden wir meist die gleichen Einstellungen für GFP Fotodokumentation (20, 14 und 14 Sek. für Rot, Grün und Blau-Kanäle bezeichnet) ermöglicht uns, um direkte und konsistente Vergleiche zwischen verschiedenen DNA-Konstrukte. </li><li> In die gleiche &quot;Bild-Einstellung&quot; Registerkarte, geben Sie einen leeren Ordner, in dem die Bilder gespeichert werden. Jede Serie von Bildern wird in diesem Master-Ordner in unabhängigen Ordnern gespeichert werden, fortlaufend nummeriert nach der Reihenfolge der Positionen für Keimblätter eingetragen. </li><li> Gehen Sie auf die &quot;capture time control&quot;-Registerkarte und stellen die Bildaufnahme Zeitintervall und Anzahl der Zyklen der Bildsammlung. Die Bilder werden in der Regel jede Stunde für 100 h gesammelt und erzeugt wohldefinierte Genexpressionsprofile. </li><li> Starten der Bildaufnahme, indem Sie auf den &quot;run Zeitplan!&quot; Schaltfläche in der &quot;Position Zeitplan&quot; Registerkarte befindet. </li><li> Am Ende der 100 h Bild Sammlung, Übertragung aller Bilder aus dem Computer die Steuerung der Roboter keine große Kapazität der Festplatte oder Computer zur weiteren Analyse der Bilder. Hochauflösende Bilder (1600 x 1200 Pixel) werden als TIF-Dateien Mess ~ 5 Mb jedes gesammelt. </li></ol> IV. Image Analysis <ol><li> Montieren Sie die 100 aufeinander folgenden Bildern aus den einzelnen Ordnern mit Adobe ImageReady. <ol><li> Öffnen Sie ImageReady und importieren alle aufeinander folgenden Bildern komponierte eine Reihe als Rahmen. </li><li> Resize Originalbilder zu 800 x 600 Pixel. Gesammelte Bilder mit hoher Auflösung, die große Dateien, die machen Bildverarbeitung verlangsamen können generiert. </li><li> Blättern Sie durch die Bilder und finden Sie einen Ort (e) sichtbar in den meisten Bildern. </li><li> Zoom bis zu 300% von der gewählten Stelle (n). Ausrichten von Bildern mit höherer Vergrößerung erlaubt eine präzise Erfassung. </li><li> Legen Sie eine Schicht auf alle Bilder und stellen Sie sicher, sichtbar in allen Frames. Markieren Sie die Stelle (n) Lage mit dem &quot;Pinsel&quot;-Werkzeug. </li><li> Beginn der Angleichung aller Bilder mit dem &quot;move&quot;-Tool und unter den Marken auf der Ebene als Referenz. </li><li> Wenn die Ausrichtung abgeschlossen ist, löschen Sie die Ebene als Referenz verwendet und Speichern von Bildern als ein einziges &quot;psd&quot;-Datei. Auch Export aller Bilder als ein einziges &quot;mov&quot;-Datei mit der höchsten Auflösung. Manuelle Ausrichtung der einzelnen Bildserien nimmt ~ 10 min. </li></ol></li><li> Führen Sie die Quantifizierung der Genexpression mittels ImageJ. <ol><li> Öffnen ImageJ-Software und öffnen Sie die &quot;mov&quot;-Datei gespeichert zuvor in ImageReady. </li><li> Mit dem Auswahl-Werkzeug, wählen Sie eine 400 x 300 Pixel großen Bereich und das Bild zuschneiden. Diese neue Datei sollte als &quot;avi&quot;-Datei gespeichert werden. </li><li> Trennen Sie die aufeinander folgenden Bildern, in der neuen &quot;avi&quot;-Datei in rot, blau und grün-Kanäle, indem Sie &quot;Bild&quot;, &quot;Farbe&quot; und &quot;RGB split&quot; in ImageJ entfernt. </li><li> Subtrahieren Sie die Hintergrund-Fluoreszenz von allen Bildern in der grünen und roten Kanälen. Mit den grünen Kanal Bildserien, wählen Sie eine 20 x 20 Pixel großen Bereich aus einer Region mit nicht-exprimierenden Zellen und notieren Sie seine Position in der &quot;ROI-Manager&quot;-Tool, so dass die gleiche Fläche in beide Kanäle ausgewählt werden. Mit der 20 x 20 Pixel-Quadrat aktiv in den grünen Kanal, den &quot;plugins&quot;-Befehl in der Task-Leiste von ImageJ befindet gehen und dann klicken Sie auf den &quot;subtrahieren gemessen ROI für jede Scheibe&quot; Plugin-Tool. </li><li> In ImageJ, auf &quot;Image&quot; klicken, &quot;Anpassen&quot; und dann &quot;Schwelle&quot; zu definieren, oder ein Segment der GFP-exprimierenden Pixel. Passen Sie die Schwellenwerte, indem Sie die Leiste in die Schwelle Fenster auf eine durchschnittliche Spot-Größe von 20-30 Pixel zu erhalten. </li><li> Bestimmen Sie die GFP-Expression mit einem Plugin, das wir messen die mittlere Grauwert pro Pixel und die Gesamtzahl der GFP-exprimierenden Pixel konzipiert. </li><li> Kopieren Sie die mittlere Leistung Grauwerte in ImageJ und Einfügen in Microsoft Office Excel. Berechnen Sie die GFP-Expression für jeden Kanal (rot und grün) durch Multiplikation der mittleren Grauwert pro Pixel durch die Gesamtzahl der GFP-exprimierenden Pixel für jeden Kanal. Die Summe des Ausdrucks Werte für beide Kanäle gibt die GFP-Expression. Die Werte können verwendet werden, um Genexpressionsprofile veranschaulichen und direkte Vergleiche werden. Zeitraffer-Animationen können auch generiert werden mittels &quot;mov&quot; oder &quot;avi&quot;-Dateien und bietet eine einzigartige und klare Darstellung der Genexpression Profil. </li></ol></li></ol> V. repräsentative Ergebnisse Die Roboter-Bild Sammlung und Analyse-Verfahren (Abb. 1) berichtet, hier kann der Erwerb einer großen Menge von quantitativen Daten auf die Genexpression in kurzer Zeit. Für pflanzlichen Promotor Charakterisierung mit dem GFP-Gen, ist diese Methode nicht nur nützlich, um transiente Expression Profile zu erstellen (Abb. 2), sondern auch in einer detaillierten Weise-GFP-Expression in transient-und stabil transformierten Pflanzengewebe 5,6 Spur. Kurze Zeitraffer-Animationen mit den gesammelten sequentielle Bilder erzeugt werden ein wertvolles Werkzeug für die eingehende Analyse der Genexpression im Laufe der Zeit in pflanzlichen Geweben. Diese Methode hat auch große Anwendung auf Faktoren, die direkten Einfluss auf die Genexpression zu evaluieren. Zum Beispiel hat transiente GFP-Expression unter der Anwesenheit verschiedener Suppressoren zum Schweigen zu viralen Ursprungs erfolgreich studiert mit unseren automatisierten Bild Sammlung und Analyse-System 7,8. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Bildanalyse Verfahren besteht aus vier wesentlichen Schritten. (A) Aufnahme von Bildserien mit der Roboter-Bild Sammelsystem, (B) Trennung der Bilder in Rot, Blau und Grün-Kanäle, (C) Segmentierung der Ausdruck Pixel durch Anpassung der Schwellenwerte, und (D) erhalten die Ausgabe Ergebnisse mit den Grauwerten und die GFP-exprimierenden Fokus Zählen. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Graph zeigt verschiedene transiente Expression Profile pflanzliche Promotoren fusioniert an GFP angetrieben. Die Daten wurden gesammelt, mit unserem Roboter-Bild-Sammlung und Analyse mit ImageReady und ImageJ Software.

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	<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).</li><li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells.">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).</li><li>Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+particle+inflow+gun+for+DNA+delivery+to+plant+cells.">Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells.</a> Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).</li><li>Finer, J. E., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+reducing+moisture+condensation+on+Petri+dish+lids.">A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids.</a> Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).</li><li>Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+35S+and+Lectin+promoters+in+transgenic+soybean+tissue+using+an+automated+image+acquisition+system+and+image+analysis.">Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis.</a> Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).</li><li>Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+two+highly+active+soybean+(Glycine+max+(L.)+Merr.)+promoters+and+their+characterization+using+a+new+automated+image+collection+and+analysis+system.">Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system.</a> Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).</li><li>Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+extension+of+transient+GFP+expression+by+the+co-introduction+of+a+suppressor+of+silencing.">Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing.</a> Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).</li><li>Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+six+different+viral+suppressors+of+silencing+using+image+analysis+of+transient+GFP+expression.">Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression.</a> Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).</li></ol>

Der Einsatz von Robotik hat enorme Anwendungen in verschiedenen Bereichen des menschlichen Lebens; speziell, Roboter wurden effektiv eingesetzt, um Aktivitäten in gefährlichen Umgebungen arbeiten, um langwierige und komplexe Tätigkeiten zu automatisieren und Aufgaben in einer präziseren Weise. In der Molekularbiologie und speziell Genexpressionsanalysen können Roboter helfen Track nicht nur Funktionen von Genen, sondern auch Gewebe Wachstum und Entwicklung über die Zeit. Viele biologische Phänomene dynamisch, was schwierig sein kann, folgen mit einzelnen Zeitpunkt Beobachtungen. Die Verwendung des GFP-Gens für die Expression Studien bringt zusätzliche Vorteile für die Beobachtung Reaktion des Gewebes und Wachstum. Für unsere experimentellen Verfahren, ermöglicht es uns, GFP Genexpression in dem gleichen Stück Gewebe im Laufe der Zeit als GFP-Erkennung eine nicht-destruktive wird folgen. Im Übrigen ist unsere Version des GFP-Protein stabil genug, um nachgewiesen werden zu können, sondern zeigt auch einige Umsätze zu einer Akkumulation in pflanzlichen Geweben zu minimieren, so dass wir beide den Aufstieg und Fall der Genexpression folgen. Wir haben bereits unsere Roboter-Bild Sammlung und Analyse-System für eine breite Palette von Anwendungen eingesetzt. Wir sehen großes Potenzial für viele biologische Anwendungen, bei denen ein dynamisches Verständnis eines Phänomens ist erwünscht. Zum Beispiel kann das Wachstum und die Entwicklung von pflanzlichen Geweben verfolgt mit unserem System geben wertvolle Einblicke / Angaben zu dieser Verfahren sein. Auch die Dynamik der Protein-Transport mit Reporter-Gene wie GFP, können leicht sichtbar mit Zeitraffer-Animationen. Die Methodik in diesem Bericht beschrieben ist technisch komplex, aber konzeptionell einfach. Unsere Ergebnisse sind robust und neue Anwendungen werden laufend entdeckt.

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		<th>Type</th>
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		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<td>ImageJ</td>
<td>Software</td>
<td>U. S. National Institutes of Health</td>
<td>&nbsp;</td>
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</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

robotics and dynamic image analysis for studies of gene expression in plant tissues

Die Genexpression in pflanzlichen Geweben ist in der Regel durch destruktive Extraktion von Verbindungen aus pflanzlichen Geweben für Studium<em&gt; In-vitro-</em&gt; Analysen. Die hier vorgestellten Methoden nutzen das grün fluoreszierende Protein (<em&gt; Gfp</em&gt;)-Gen für die kontinuierliche Überwachung der Genexpression in der gleichen Stücke von Geweben, im Laufe der Zeit. Die<em&gt; Gfp</em&gt; Gen wurde unter regulatorischen Kontrolle verschiedener Promotoren gestellt und führte in Limabohne Cotyledonen Gewebe über Partikelbeschuss. Keimblätter wurden dann auf einer Roboter-Bild-Sammlung, das aus einem Fluoreszenz-Binokular mit einer Digitalkamera und einem 2-dimensionalen Robotik-Plattform speziell entwickelt, um eine sichere Befestigung der Kulturschalen ermöglichen bestand gelegt. Die Bilder wurden von Cotyledonen Gewebe pro Stunde für 100 Stunden gesammelt, um die Expression Profile für jeden Veranstalter zu generieren. Jeder gesammelte Serie von 100 Bildern wurde zum ersten Mal auf manuelle Bildausrichtung unterzogen mit ImageReady, um sicherzustellen, dass GFP-exprimierenden Foci wurden konsequent in ausgewählten Bereichen der Analyse beibehalten. Spezifische Regionen der Serie messen 300 x 400 Pixel, wurden dann zur weiteren Analyse an GFP Intensity Messungen mit ImageJ-Software bieten ausgewählt. Batch Bilder wurden in den roten, grünen und blauen Kanäle und GFP-exprimierenden Bereiche wurden mit Hilfe der Schwelle Merkmal ImageJ. Getrennt Nach Abzug der Hintergrundfluoreszenz (Subtraktion der Grauwerte der nicht exprimierenden Pixel von jedem Pixel) in den jeweiligen roten und grünen Kanäle, wurde GFP-Intensität durch Multiplikation der Mittelwert berechnet Grauwert pro Pixel durch die Gesamtzahl der GFP-exprimierenden Pixel in jeder Kanal, und fügt dann die Werte für die roten und grünen Kanäle. GFP Intensity-Werte wurden für alle 100 Zeitpunkte zum Ausdruck Profile Ertrag erfasst. Variationen in GFP-Expression Profilen ergab sich aus Unterschiede bei Faktoren wie Promotor Stärke, Vorhandensein eines silencing suppressor, oder die Art des Promotors. Neben Quantifizierung der GFP-Intensität wurden die Bildserien auch verwendet, um Zeitraffer-Animationen mit ImageReady erzeugen. Zeitraffer-Animationen gezeigt, dass die deutliche Mehrheit der Zellen eine relativ schnelle Anstieg der GFP-Expression, die von einem langsamen Rückgang folgte angezeigt. Einige Zellen gelegentlich ein plötzlicher Verlust der Fluoreszenz, die mit raschen Zelltod verbunden sein können, angezeigt. Scheinbare Transport von GFP durch die Membran und Zellwand zu benachbarten Zellen wurde ebenfalls beobachtet. Zeitraffer-Animationen zusätzliche Informationen, die sonst nicht kann durch Verwendung von GFP Intensity Profile oder einzelnen Zeitpunkt Bildsammlungen werden.

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Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Wir berichten über eine Methode für die Einführung, Überwachung und quantitative Analyse der GFP-Expression in Pflanzenzellen. Diese Methode verwendet einen speziell entworfenen Robotik-System für semi-kontinuierlichen Bildsammlung aus einer großen Anzahl von Proben, über die Zeit. Wir zeigen auch die Verwendung von ImageJ und ImageReady für die Analyse von Bildserien.

Robotik und Dynamic Image Analysis für Studies of Gene Expression in pflanzlichen Geweben

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Aufrufe.  The Ohio State University. Wir berichten über eine Methode für die Einführung, Überwachung und quantitative Analyse der GFP-Expression in Pflanzenzellen. Diese Methode verwendet einen speziell entworfenen Robotik-System für semi-kontinuierlichen Bildsammlung aus einer großen Anzahl von Proben, über die Zeit. Wir zeigen auch die Verwendung von ImageJ und ImageReady für die Analyse von Bildserien.

Serie: Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana Und Tomaten

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elektrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Tücher für Genexpressionsanalyse

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Bildsequenzen

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...