Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der National Science Foundation (Verleihungsnummer IOS-1031416) gefördert und wurde in Zusammenarbeit mit Nathan Miller, Logan Johnson und Edgar Spalding von der Universität von Wisconsin und Brian Bockelman, Carl Lundstedt und David Swanson von der durchgeführt worden University of Nebraska Holland Computing Center.

1. Image Acquisition-Protokoll Überlegungen: Dieses Protokoll wird am effektivsten mit zwei Personen durchgeführt, obwohl es möglich ist, eine allein arbeiten. Die Anordnung arbeitet am besten in diesem Labor war für eine Person, um Platten für das Scannen vorzubereiten, während andere Werke auf Scanner-Setup, dann beide zusammen arbeiten, um Platten in Scanner platzieren und den Scanvorgang. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Scanner in diesem Projekt sind vertikal die Scanner-Deckel auf der Rückseite des Scanners ruhen ausgerichtet. Eine benutzerdefinierte Unterstützung wurde gemacht, um Gerichte in dieser vertikalen Position zu halten und wurde auf dem Flachbettfläche mit 3M Befehlsleisten (Abbildung 2) befestigt. Der abnehmbare Dokumentenabdeckung, die mit dem Scanner in diesem Protokoll (ein Epson V700) verwendet wird, stammt wurde auf einer Seite mit schwarzem Filz ausgekleidet. Die Vorlagenabdeckung wurde gegen den Flachbett mit einem Bungee-Seil positionierthalten die Platten an Ort und um den Bildkontrast (Abbildung 3) zu liefern. Alle Scanner von ausreichender Auflösung könnte für die Bilderfassung verwendet werden. Der Epson Perfection V700 wurde wegen seiner Vierkantprofil (macht es einfach, vertikal positionieren), seine hohe Auflösung, und die zusätzlichen Möglichkeiten, aus der sowohl das Bett und Deckel zu scannen und die Infrarot-Kanal verwenden gewählt. Diese zusätzlichen Optionen wurden nicht in diesem Protokoll verwendet. Sobald die Platten aus der Wachstumskammer entfernt worden ist, ist es unerlässlich, dass das Protokoll bis zum Ende. Plattenvorbereitung Standard-Petrischalen, die 10 ml Medium transparent und 9 Samen in der Mitte jeder Platte gepflanzt wurden verwendet. : Verfahren zur Kennzeichnung Platte, Medien-und Pflanzvorbereitung finden Sie unter <a href="http://www.doane.edu/doane-phytomorph">http://www.doane.edu/doane-phytomorph</a> <ol><li&gt; Rufen Sie die erste Agar-Platte und zu absorbieren gesammelte Kondenswasser am Deckel und Deckelrand von der Agar-Platte mit einem Kimwipe. </li><li> Nehmen Triton X-100 (ein Reinigungsmittel), um den Deckel mit einem Kimwipe - großzügig sein. (Beachten Sie, dass Triton X-100 verhindert die Ansammlung von Kondenswasser am Deckel, wenn die Platte gescannt. Eine großzügige Anwendung (genug, um einen Film auf der Deckeloberfläche erstellen) wird dazu beitragen, sicherzustellen, dass der Deckel bleibt während der gesamten Lauf Scanner transparent .) </li><li> Wickeln Sie die Platte mit Mikroporen-Band, um den Deckel zu sichern und für die Belüftung. </li></ol> Scanner-Setup-und Bildsammlung Dieses Protokoll geht davon aus, dass mehr als ein Scanner verwendet wird, und gibt Anweisungen an mehrere Scanner von einem einzigen Computer zu starten. <ol start="4"><li> Erstellen Sie Ordner zum Speichern von Bildern von jedem Scanner. Jeder Scanner wird zwei Platten zu halten, so bedenken Sie dies bei der Erstellung von Ordnern. Einkönnen wählen, um die Metadaten als Bestandteil der Dateinamen wie eindeutige IDs für jede Platte, Sämling Alter, Größe der Samen, und IDs der Bestände gepflanzt verwenden. Ein Beispiel für einen Ordnernamen in der Datenerhebung verwendet diese Metadaten enthält, ist &quot;1652-2-sm-9-92-17-1653-2-lg-88-79 bis 161&quot;. </li><li> Stellen Steckdose Timer für bestimmte Sammelzeit (9 Stunden wurde in diesem Labor verwendet wird). Achten Sie darauf, mehr Zeit (eine Stunde oder so) für die Vorbereitung gesetzt. (Beachten Sie, dass Scanner sollte in die Steckdose Timer, um die Aufnahmezeit eingestellt gesteckt werden. Während die VueScan Software ermöglicht einem Benutzer, Bilder immer wieder zu sammeln, ist es nicht erlauben dem Benutzer, um anzuzeigen, wie viele Bilder zu sammeln oder wie lange die Bilder für sammeln .) </li><li> Schalten Sie die ersten Scanner und warten Sie etwa 10 Sekunden für den Scanner, um durch seine Anfangs warm-ups zu gehen. </li><li> Öffnen Sie das Programm VueScan einmal. VueScan 9.0.20-Version wurde in diesem Protokoll verwendet (siehe Materialien Tabelle), können aber neueren Versionen mit wenig modific verwendet werdenation. Stellen Sie sicher, dass das &quot;Mehr&quot;-Taste ist auf der Unterseite der Benutzerschnittstelle, um die Menüoptionen unten beschrieben angezeigt gedrückt. </li><li> Stellen Sie die automatische Wiederholung: Dropdown-Feld zu keiner unter der Registerkarte Eingabe und unter der Registerkarte Crop gesetzt Vorschaubereich: bis Maximale (Abbildung 4). Drücken Sie &#39;Vorschau&#39;. </li><li> Erstellen Sie ein Erntefeld, das die Region von Interesse mit der Maus klicken und ziehen Sie in der gesamten Region von Interesse auf der Vorschau-Bild zu erfassen wäre. Die Einstellungen können für die Region von Interesse in der Registerkarte Crop verändert werden. Die typischen Einstellungen für die Crop-Box verwendet wurden, waren: x-Offset 0,675; y-Offset in 1.924, obwohl dies wurde angepasst, um den Keimling Bereich für jeden Scanner zu erfassen. Die Ernte Kastengröße verwendet wurde, war 7,246 in der Breite und 1,1 cm (Abbildung 5). </li><li> Um die Erntefeld zu verschieben, halten Sie die Shift-Taste gedrückt, während Sie mit der Maus. Stellen Sie sicher, dass der Crop-Box enthält alle Sämlinge gescannt werden und beliebige Metadaten, die auf einem Etikett (Abbildung 5) enthalten sein können. </li><li> Unter der Registerkarte Crop, stellen Sie die Vorschau-Bereich: In den Crop-Box und drücken Sie &#39;Vorschau&#39;. </li><li> Gehen Sie auf die Registerkarte Ausgabe, und wählen Sie die richtige Datei für den Scanner (Abbildung 5). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,7-1,12 auf allen Scannern für einen Computer. Wählen Sie die &quot;Ja&quot;-Option, wenn Sie gefragt, ob mehr als eine Instanz von VueScan zu öffnen. </li><li> Gehen Sie durch jede Registerkarte und überprüfen, ob die Einstellungen korrekt sind. (Beachten Sie, dass alle Spezifikationen können geändert werden, um die Bedürfnisse eines einzelnen Labor einschließlich Bild-Farbe, Auflösung, etc. angepasst werden. Allerdings können die Einstellungen in diesem Protokoll direkt an den pa angewendet werdenrticular Scannen Hardware eines bestimmten Labor aufgrund der gemeinsamen Schnittstelle der Software VueScan. Finden Sie in der Liste im Anhang Spezifikationen, die in diesem Projekt verwendeten Parameter mit VueScan 9.0.20 Version) anzuzeigen. </li><li> Unter der Registerkarte Eingabe wählen Dauer im Auto-repeat: Feld, oder wählen Sie ein längeres Zeitintervall zwischen den Bildern, wenn gewünscht. Das Zeitintervall ist die Zeit der Scanner Pausen nach dem Speichern das letzte Bild und beginnt Sammlung des nächsten Bildes. Im Dauerbetrieb kann 3-4 min bei 4.800 dpi Auflösung erhalten werden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 1,14 bis 1,15 für den Rest der an einen Computer angeschlossen Scanner. </li><li> Zeigen vorbereitet Platten in den richtigen Scanner mit Sämlinge horizontal ausgerichtet (nicht gravistimulate). </li><li> Vorübergehend legen schwarz, fühlte Hintergrund gegen die Platten, damit sie nicht aus Plexiglas Vorlage fallen. Wiederholen Sie für alle Scan-Partner. (Anmerkung: In diesem Projekt wurden schwarze Stücke aus Filz, um das Dokument deckt mit der Ausrüstung zur Verfügung gestellt, um die Blendung zu verhindern und Kontrast gegen Wurzelgewebe liefern befestigt Die spezifische Hintergrundfarbe verwendet wird auf die Farbe des Gewebes, das abgebildet abhängen.). </li><li> Lassen Sie eine Person drehen die Platten 90 ° (gegen den Uhrzeigersinn Platten wurden in diesem Protokoll eingeschaltet ist) und sofort zu ersetzen, den Filz Hintergrund. </li><li> Die andere Person sollte auf dem Computer zu stehen, so dass sie sofort drücken Sie die &quot;Scan&quot;-Taste. </li><li> Sichern Sie den Hintergrund der Scanner mit einem Bungee-Seil (Abbildung 3). Lassen Sie eine Person halten, die Hintergrund an Ort und Stelle, während ein anderer Positionen der Bungee-Seil. (Anmerkung: Unmittelbar nach Gravistimulation (Rotation der Platten von 90 °) und die Platzierung des Filzes Hintergrund, &quot;Scan&quot; gedrückt werden sollte). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 1,17 bis 1,21 für den Rest der Scanner auf einem einzelnen Computernäh. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,6-1,22 für den nächsten Satz von Scannern falls zutreffend. </li><li> Lassen Sie die Scanner erst mehrere Bilder wurden gesammelt, um sicherzustellen, dass sie richtig sparen. </li><li> Es ist ideal, um die Scanner in einem Bereich, der frei von Störungen für die Scan-Zeit bezeichnet sein wird halten. Es ist auch ratsam, die Umweltbedingungen in der Scan-Bereich betrachten, um ideal phänotypische Reaktionen zu gewährleisten. </li><li> Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, drücken Sie die grüne Taste abbrechen VueScan auf jedem Fenster, die mit jedem Scanner zusammenfällt. </li><li> Schließen aller Programme auf dem Computer. </li><li> Starten Sie den Computer und schaltete alle Scanner, bevor eine weitere Runde der Bildsammlung. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Genaue phänotypische Beobachtung ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Erscheinungsformen der Gen-Funktion in einem Organismus. Ein Weg, um phänotypische Informationen zu erwerben, ist die Erfassung von hochauflösenden Bilddaten. Der Scanner-basierte Plattform entwickelt hat, Sammlung von vielen Bildern (200 Bilder / Scan-Zeit) mit hoher Auflösung (4800 dpi) über mehrere Stunden aktiviert. Darüber hinaus bietet diese Plattform ist leicht zu einer Vielzahl von Labor und Klassenzimmer Umgebungen aufgrund der Flexibilität der Software VueScan, Tausende von verschiedenen Scannern über eine gemeinsame Schnittstelle laufen 18 angepasst. Die hier vorgestellte Methode füllt eine Lücke im Hochdurchsatz-Bilderfassung, die von Großanlagen Phänotypisierung und automatisierte Systeme implementierbar in einem einzigen Labor erstreckt. Die Hochdurchsatz-Plattformen verfügbar sind in der Regel spezialisierte Imaging-Hardware, einschließlich Kameras an Roboter Stützen montiert zu verwenden, um hochauflösende Bilder von p zu erfassenrimarily oberirdischen Pflanzenteile (zB Zentrum für Integrative Anlagentechnik und der Scanalyzer HTS durch LemnaTec) 20,21. Spezialisierte Bildsysteme mit Röntgen-und MRT-Technologien haben auch Bild unter der Erde Gewebe mit bemerkenswerter Auflösung entwickelt, wie sie in der Bodenumgebung (zB Zentrum für Integrative Pflanzen Technology) 11,22,23 wachsen. Diese Entwicklung von spezialisierten Technologie ist im Allgemeinen auf Kosten des Durchsatzes, so dass dynamische phänotypische Untersuchungen erschwert. Wichtig ist, dass die Kosten-und Infrastrukturbedarf für diese High-End-Plattformen machen sie meist nicht machbar für den Einsatz in kleineren Labors. Plattformen sind ebenfalls entwickelt worden, die mehrere Standard-Bildaufnahme-Technologie und sind für die Messung der dynamischen Reaktionen wie die Wurzel Reaktion auf eine Schwerkraftreiz geeignet. Zum Beispiel wurden CCD-Kameras verwendet, um einzelne Sämling Reaktionen auf Licht und Schwerkraft bei hohen erfassenräumliche und zeitliche Auflösung 1,8,12. Andere Systeme wurden entwickelt, ermöglicht daher die Messung Wurzelspitze Ausrichtung von mehreren Wurzeln aus einem einzigen Bild (z. B. durch die RootTipMulti iPlant Collaborative) 17,24. Im ersteren Fall wird der Durchsatz relativ gering da nur ein Sämling von jeder Kamera zu einem Zeitpunkt abgebildet wird, während in dem letzteren Fall Durchsatz ist höher, aber im allgemeinen auf Kosten der Auflösung. Die in diesem Dokument beschriebene Verfahren stellt eine Plattform für die Erfassung von hochauflösenden Bildern in hoher Durchsatz bei Ausrüstung und Software, die leicht verfügbar und relativ erschwinglich sind. Mit diesem Setup können 1.080 einzelnen Wurzel Antworten jede Woche in einem Labor mit einer Bank von sechs Scannern ausgestattet gesammelt werden. In 15 Monaten sammeln durchschnittlich 864 Einzelantworten pro Woche, wurden insgesamt 41.625 Setzlinge für eine Genomik Studie gescannt. Über 15% der einzelnen Sammlungen durch Setup-Fehler, Netzw gescheitertrk Ausfall oder Fehlfunktionen. Weitere Antworten 22% konnte aufgrund fehlender oder unzureichender Keimwurzelwachstum, eine Wachstumsreaktion hervorzurufen. Der letzte Datensatz besteht aus 27.475 einzelnen Sämling Antworten auf einen Reiz der Schwerkraft von 163 rekombinanten Inzuchtlinien sowie 99 in der Nähe von isogenen Linien. Die Daten wurden in einem Labor gesammelt, so dass dies ein sehr hoher Durchsatz-Ansatz. Auch da der für den Erwerb verwendeten Geräte ist relativ kostengünstig, zuverlässig seit über zwei Jahren auch bei intensiver Nutzung funktioniert hat. Während dieses Protokoll ist sehr nützlich für die Forschungsziele dieser Gruppe waren, existieren einige Einschränkungen. Aufgrund der Durchsatz von 50 GB unkomprimierter Bilddaten pro Tag, war es offensichtlich, dass eine große Menge an Speicherplatz auf Haus Bilder benötigt, wenn wirksame Kompressionsverfahren entwickelt werden. Das Speicherproblem wurde vorübergehend durch den Kauf von externen Festplatten für jeden Computer gelöst. Darüber hinaus wurden zwei 10 TB Netzwerk verbundenen Speichergeräte angeschafft. Später wurden Kompressionsalgorithmen entwickelt, wie oben beschrieben, die zur Verringerung der Datenmenge um bis zu 60% (Fig. 8). Es ist wichtig zu beachten, dass die Geschwindigkeit, mit der Daten zu einem Netzwerk verbundenen Speichervorrichtung gespeichert werden kann, hängt von der Geschwindigkeit der Netzwerkverbindung. Kompressionsschemata auch auf den Wunsch, um den Verlust von Bilddaten zu verhindern eingeschränkt. Weitere spezifische zu einem Scanner-basierten Imaging-System Einschränkungen werden auch berücksichtigt. Beispielsweise in einem Scanner-basierte Ansatz Keimlinge Licht hoher Intensität in den weißen und möglicherweise Infrarotbereich während jeder Abtastung belichtet. Dies betrifft wahrscheinlich Sämlingswachstum allerdings Keimlinge noch beobachtet robusten Reaktionen auf eine Schwerkraftreiz unterzogen (Fig. 7) werden. Eine zukünftige Verbesserung könnte beinhalten Programmierung Scanner, so dass nur Infrarot-LEDs aktiv sind. Ein Bereich, in aktiven development ist die Schaffung von Analyse-Algorithmen auch auf die Auflösung und Durchsatz dieser Bilddaten abgeglichen. Die erzeugte mit diesem Scanner-basierte Methode großen Datenmenge ist ideal für die Entwicklung von robusten Werkzeuge für die Hochdurchsatz-Phänotypisierung von Sämling Bilder. Die auf diese in Fig. 7 gezeigten Bilder verwendet Komprimierungsalgorithmus unterstützt die Behauptung, dass sie zugänglich Bildanalyseanwendungen. Zusätzlich können die erzeugten Bilder von der bisher veröffentlichten Algorithmus, RootTrace 17,24 analysiert werden, wenn sie bei geringerer Auflösung (weniger als 1.200 dpi) erhoben werden, und einzelne Setzlinge aus dem Bild unter Verwendung der oben beschriebenen Analyse vor Kompressionsalgorithmus segmentiert. Das Wurzelwachstum Daten könnten von den Bildern zu 1.200 dpi reduziert, während Spitzenwinkel Daten könnten von den Bildern zu 900 dpi (unveröffentlichte Beobachtung) reduziert extrahiert werden extrahiert werden. Die in diesem Dokument beschriebenen Vorgehensweise passt in seine eigene Nische in der Welt der root-Bildgebung, dass es einen hohen Durchsatz und hohe Auflösung, während immer noch relativ erschwinglich. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es leicht angepasst werden, um die Imaging-Anforderungen eines bestimmten Forschungsgruppe unterzubringen.

Sammlung von hochauflösenden phänotypischen Daten sind nützlich in Studien, die das Zusammenspiel von Genetik und Umwelt in der Vermittlung organismal Funktion 1,2 verstehen wollen. Studien dieser Art sind auch von Natur aus in großen Maßstab, so dass es zusätzlich erforderlich, dass für die Messung Phänotypen in diesem Zusammenhang angewandten Methoden in Hochdurchsatz 3,4 sein. In die Methoden zur Phenomics angelegte Forschung, Kompromisse zwischen Durchsatz und Auflösung ins Spiel kommen. Methoden, die in höheren Durchsatz sind, neigen auch zu niedrigeren Auflösung sein, so dass es schwierig ist, geringe Auswirkungen der Genetik oder der Umgebung 5 zu erfassen. Alternativ Methoden, die genauer messen einen gewünschten Phänotyp neigen auch zu niedrigeren Durchsatz, so dass es schwierig ist, genetische und Umwelteinflüsse weitgehend überblicken. Zusätzlich können manuelle Methoden zur Quantifizierung von Phänotypen, einschließlich visueller Inspektion, Veränderungen unterliegen aufgrund der Unterschiede in der menschlichen Pro6 Wahrnehmung. Imaging-Technologien können eine nützliche Brücke zwischen Durchsatz und Auflösung bei der Beschaffung von phänotypischen Beobachtungen 9.7 bieten. Im allgemeinen ist ein Bild relativ leicht zu erfassen, zu erleichtern Durchsatz, und wenn bei ausreichender Auflösung eingenommen wird, kann feine Phänotypen erkannt werden 1,2,7. Imaging-Technologien neigen modifizierbar, um ein System oder Verfahren von Interesse fit zu sein und sind in der Regel 10-12 skalierbar. Aus diesem Grund sind ideal Imaging-Technologien für die Entwicklung von großen Studien der organismischen Funktion. Die Reaktion der primären Wurzel zu einem Schwerkraft Stimulus ist ein kompliziertes physiologischer Prozess, der innerhalb eines morphologisch einfaches Organ auftritt. Die Antwort beinhaltet die Aktivierung der Signalwege, die durch die Wurzel Organ ausbreiten und ihr Fortschreiten durch Umwelt-und genetischen Faktoren, wie genetische Faktoren, die durch die Umwelt beeinflusst wird 12-14 </sup&gt;. Die Reaktion der primären Wurzel zu einem Schwerpunkt Reiz hat mindestens seit Darwin studiert, aber es gibt viel zu lernen, wie es funktioniert, vor allem in den frühen Signalereignisse und in den Faktoren der Vermittlung Antwort Plastizität 12,14,15. Der Erwerb von einem detaillierten Verständnis der Dynamik dieser Antwort ist bei der Suche nach Möglichkeiten, um die Fähigkeit der Keimlinge, um erfolgreich in einer bestimmten Umgebung 16 etabliert verbessern wichtig. Darüber hinaus ist die Form des Wurzel macht es zugänglich für Bildverarbeitungsanwendungen 8,12,17. Zusammengenommen ist die Wurzel gravitropen Antwort ein ideales System für die Entwicklung von Hochdurchsatz-Imaging-Technologie für die Zwecke der Durchführung der Genomik-Level-Studien der organismischen Funktion. In diesem Bericht wird ein Hochdurchsatz-und hochauflösende Methode zur Bildaufnahme des Wurzel gravitropen Reaktion unter Verwendung kostengünstiger, handelsüblichen Flachbettscanner vorgestellt. Die Übersicht über dieProtokoll ist in Fig. 1 gezeigt. Sämlinge gepflanzt auf Agar-Platten wurden auf vertikal ausgerichteten Flachbettscanner mit benutzerdefinierten Plexiglasplatte angebracht Halter positioniert. Die Bilder wurden alle paar Minuten bei 4.800 dpi gesammelt und auf einem lokalen Laufwerk oder Daten-Server gespeichert. Metadaten, die mit jeder Bildreihe zugeordnet ist, in einer Datenbank gespeichert, und die gespeicherten Bilder verarbeitet werden. Der Ansatz nutzt die Software VueScan für die Bilderfassung. VueScan kann verwendet werden, um mehr als 2.100 verschiedene Scanner auf Windows-, Mac-oder Linux-Betriebssystemen laufen (siehe Materialien Table) werden. Ein Scanner-Auflösung von 4.800 dpi wurde in dieser Anwendung verwendet, um die in früheren Studien mit festen CCD-Kameras 1,8,12 erreichte Auflösung entsprechen. Die Flexibilität der VueScan-Software zusammen mit der gemeinsamen Schnittstelle verwendet es für jeden Scanner läuft es ermöglicht Benutzern, ohne weiteres auf die in diesem Papier Protokoll verabschieden praktisch jede Scanner-Hardware mit ausreichender Auflösung. Stromdurchsatz ermöglicht die Sammlung von216 Einzelantworten pro Tag. Die Technologie ist anpassungsfähig und skalierbar für den Einsatz in Einrichtungen, die von Hochschulen zu Universitäten erforschen. Darüber hinaus sind die gesammelten Bilder von ausreichender Qualität für die Bildanalyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V700 Photo Scanners</td>
			<td>Epson</td>
			<td>B11B178011</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas Scanner Template</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made. See Figure 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart Strap Bungee Cords</td>
			<td>SmartStraps</td>
			<td>Wal-Mart 1079478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brinks Digital Outdoor Timers</td>
			<td>Brinks</td>
			<td>Wal-Mart 42-1014-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VueScan Software</td>
			<td>Hamrick Software</td>
			<td><a href="http://www.hamrick.com/">http://www.hamrick.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Segmentation Software</td>
			<td>Chris Wentworth, Doane College</td>
			<td></td>
			<td>https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Micropore Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-061-655</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made by gluing two cookie racks together.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flatbed scanners to collect high-resolution time-lapsed images of the arabidopsis root gravitropic response

Die Forschungsanstrengungen in der Biologie erfordern zunehmend den Einsatz von Methoden, die High-Volume-Sammlung von hochauflösenden Daten zu ermöglichen. Eine Herausforderung Labors stehen, ist die Entwicklung und Verwirklichung dieser Methoden. Beobachtung von Phänotypen in einem Prozess von Interesse ist eine typische Ziel der Forschungslabors Studium Gen-Funktion, und dies wird oft durch Bildaufnahme erreicht. Ein besonderer Prozess, der für die Beobachtung mit bildgebenden Verfahren ist die Korrektur Wachstum von einem Sämling Wurzel, die aus der Ausrichtung mit der Schwerkraftvektor verschoben wurde. Imaging-Plattformen verwendet, um die Wurzel gravitropen Reaktion messen kann teuer, im Durchsatz relativ gering ist, und / oder arbeitsintensiv sein. Diese Fragen wurden durch die Entwicklung eines Hochdurchsatz-Bildaufnahmeverfahren mit preiswerten, aber hochauflösende, Flachbett-Scanner angesprochen. Mit dieser Methode können Bilder alle paar Minuten bei 4.800 dpi aufgezeichnet werden. Das aktuelle Setup ermöglicht Sammlung von 216 einzelnen responses pro Tag. Die gesammelten Bilddaten von reichlich Qualität für Bildanalyse.

Repräsentative Bilder Dieser Ansatz ermöglicht eine schnelle Produktion von hochauflösenden Zeitreihen von Arabidopsis Sämling Wachstum. Erste und letzte Bilder von einem Scanner Laufs sind in den 7A und 7B gezeigt. Figuren 7C und 7D optimale Ergebnisse von der Hälfte einer Vollbildscanner. Einige Fragen, die die Bildqualität beeinflussen können, sind in den Figuren 7A und 7B gezeigt. Diese Fragen gehören Variation in Keimung, Variation in Sämling Wachstumskurs zu Beginn der Flucht, und Aufbau von Kondensation beim Scannen. Kondensation kann weitgehend durch eine Erhöhung der Menge an Triton X-100 auf der Innenseite der Deckelplatte aufgebracht gelöst werden. Andere Faktoren, die genaue Bildsammlung hemmen könnten, sind falsche Konfiguration des Erntefeld in Bezug auf die Plattenposition und Positionierungsplatten, so dass sie in Bezug auf das Erntefeld verzerrt. Bildanalyse-Anwendung: Bildkomprimierung Sobald eine Zeitsequenz von Scannerbildern erhalten worden ist, muss es sicher in einem Netzwerk zugänglichen Weise gespeichert ist, um die Bildanalyse zu erleichtern. Die Bilddateien mit einer individuellen Lauf Scanner verbunden belegen eine erhebliche Menge an Festplattenspeicher. Eine bei 4.800 dpi gesammelt einzelne TIFF-Datei ist ca. 220 MB und eine typische Scanner Lauf erzeugt 200 Bilddateien. Daher ist etwa 44 GB Festplattenspeicher pro Lauf erforderlich. Den Speicher-und Netzwerkübertragungskosten mit Bildanalyse zu verringern, ist es wünschenswert, die Menge an Platz benötigt wird, um Bilddaten zu speichern, während gleichzeitig die Minimierung der Datenverlust zu reduzieren. Downstream-Analyse Identifizierung jeder Sämling beinhalten in nachfolgenden Bilddateien mit einer experimentellen Lauf verbunden. Daher Segmentierung aus einzelnen Sämlinge aus dem Scanner Bild kann nachgelagerten Analyse erleichtern. Da die Segmentierung des Keimlings weg vom Rest der thBild E kann auch erheblich reduzieren Lagerung von unnötigen Hintergrundpixel führt dieser Ansatz auch deutliche Reduzierung der Datengröße. Außerdem, wenn stromabwärts Analyse auf Wurzelgewebe fokussiert es nicht notwendig sein, um die Farbinformation zu halten, da die Wurzel Pixel sind relativ schmal in ihrer Farbraum. Ein Computer-Bildverarbeitungsprotokoll und Code, um Daten Größe durch die Segmentierung sowohl einzelne Sämlinge und Umwandlung von Bildern in Graustufen zu reduzieren, entwickelt. Der Ansatz führt zu einer Reduktion von 60% in der Speicherplatzbedarf. Die zur Durchführung dieses Datenkompression zu erreichen Workflow wird in den folgenden Schritten beschrieben: <ol><li> Beginnen Sie mit einer Zeitreihe von Scanner-Bild-Dateien in einem einzigen Ordner. </li><li> Für jedes Bild, konvertieren von einem RGB in Graustufen (Abbildung 8, oben). </li><li> Teilen Sie das Bild in linken und rechten Seite. </li><li> Extrahieren Sie jede Keimling aus dem Bild in eine eigene Datei (Abbildung 8).Dies wird durch Anlegen einer Schwelle, um Pixel, die schwarz oder weiß, und dann Berechnen der Gesamtpixelintensität jeder Bildzeile umzuwandeln geführt. Die Zeile mit der höchsten Intensität identifiziert wird und jedes Pixel wird als &quot;Pflanzen&quot; oder &quot;nicht-pflanzlichen &#39;basierend auf der Intensität der Nachbar klassifiziert. Das Zentrum jeder &#39;Pflanze&#39; innerhalb dieser Zeile gefunden und von diesem Punkt eine Ernte Feld von einer bestimmten Größe gezeichnet wird (Abbildung 8, unten). </li><li> Erstellen Sie einen separaten Ordner für jede Seite des Bildes (links und rechts) mit separaten Unterordner für die einzelnen Keimling für die Lagerung der einzelnen Zeitbildserie-Dateien. </li><li> Archivieren Sie die resultierende Ordner in eine komprimierte ZIP-Datei. </li></ol> Ein Code, der diese Schritte vollendet wurde mit der Programmiersprache Python 20 entwickelt. Der Algorithmus ermöglicht eine Reduktion etwa 60% der Datenmenge und ist erfolgreich bei der Identifizierung aller einzelnen Sämlinge in 90% der Scanner imagE-Dateien analysiert, so weit. Die Codes stehen zum Download unter der GNU General Public License Version 3 frei verfügbar (siehe Materialien Tabelle). <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1.jpg" width="500px" /> Fig. 1 ist. Der Scanvorgang beginnt mit der Aussaat (bis zu neun Arabidopsis Samen pro Platte) und endet mit Datenspeicherung und Bildverarbeitung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2.jpg" width="500px" /> Abbildung 2. Emplate T für den Bau der Petrischale Unterstützung. Ple<html> xiglas wurde geschnitten, so dass die Breite des Flachbett passen (in diesem Fall 227 mm) und die Länge betrug 128 mm. Zwei Kreise mit einem Durchmesser von 88 mm wurden aus dem verbleibenden Teil, so daß sie gleichmäßig über die Breite und Länge des Trägers verteilt geschnitten. Der Träger wurde auf dem Flachbett mit 3M Befehlsleisten befestigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3.jpg" width="500px" /> Abbildung 3. Scanner-Konfiguration nach der Sämlinge wurden gravistimulated und das Dokument Abdeckung positioniert. Dies ist die Konfiguration des Scanners bei Schritt 1.21 von Scanner-Setup-und Bildsammlung.&quot;_blank&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4.jpg" width="500px" /> Abbildung 4. Screenshot der Einstellungen für Schritt 1.8 des Scanner-Setup-und Bildsammlung ausgewählt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5.jpg" width="500px" /> Abbildung 5. Screenshot der Software VueScan während der Schritte 1.9 und 1.10 der Scanner-Setup-und Bildsammlung. Die rote Box unterstreicht die Pflanzengröße, während der blaue Kasten werden spezifische Einstellungen fo<html> r x-und y-Offset um Sämlinge und Label-Informationen zu erfassen eingesetzt. Der Bereich der Flachbett gescannt werden als gepunktete Linie im Vorschaubereich angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 6" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6.jpg" width="400px" /> Abbildung 6. Auswahl der Zielordner für Schritt 1.12 des Scanner-Setup-und Bildsammlung. @ Drücken der Taste neben dem Dialogfeld Default Folder (roter Pfeil) kann der Benutzer den entsprechenden Zielordner auswählen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . Wieder 7 &quot;fo: content-width =&quot; 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7.jpg &quot;width =&quot; 600px &quot;/&gt; Abbildung 7 (AD). Die obigen Bilder sind Beispiele für die gesammelt unter Verwendung der in diesem Dokument beschriebenen Verfahren. Panels A, B und C, D sind die ersten und letzten Bilder jeweils von einem einzigen Scan Zeitraum. A, B zeigen die Voll gescannten Bereich, während C, D eine beschnittene Bereich des gescannten Bereichs, zeigt eine einzige Platte. Mehrere Inkonsistenzen beobachtet werden. Panel A zeigt die Variation in Keimung und Wachstum Weise. Feld B (die gleichen Sämlinge als Bild A; 9 Stunden später) zeigt, dass die Platten kann sich Kondenswasser ansammeln. Platten C und D gelten als gute Ergebnisse durch robuste Wachstum o seinf Sämlinge und Bildqualität über die gesamte Auflage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8.jpg" width="600px" /> Abbildung 8. Das entwickelte Bild-Kompressions-Algorithmus wandelt ein Bild, um Scanner-Skala (oben) grau. Das Bild wird in rechte und linke Hälften geteilt und Bildgrenzen werden entfernt (nicht gezeigt). Die Positionen der einzelnen Sämlinge auf jeder Hälfte werden von der Suche nach der Zeile mit dem größten Gesamtpixelintensität identifiziert. Diese Positionen werden verwendet, um eine neue Anbaufläche, auf alle Sämlinge auf der Platte (unten) angewendet definieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur raschen Sammlung von Bildern von Arabidopsis Keimlingen Reaktion auf einen Reiz der Schwerkraft unter Verwendung von handelsüblichen Flachbettscanner. Die Methode ermöglicht kostengünstige, High-Volume-Erfassung von hochauflösenden Bildern zugänglich für Downstream-Analyse-Algorithmen.

Mit Flachbett-Scanner mit hoher Auflösung zeitversetzt Bilder von der Arabidopsis-Wurzel gravitropen Antwort sammeln

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.3K Aufrufe.  Doane College.  Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur raschen Sammlung von Bildern von Arabidopsis Keimlingen Reaktion auf einen Reiz der Schwerkraft unter Verwendung von handelsüblichen Flachbettscanner. Die Methode ermöglicht kostengünstige, High-Volume-Erfassung von hochauflösenden Bildern zugänglich für Downstream-Analyse-Algorithmen. 

Serie: Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Mit der optokinetischen Reaktion auf visuelle Funktion des Zebrafisch-Studie

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Forschung

Biologie

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Mit hochauflösenden Computertomographie, die dreidimensionale Struktur und Funktion pflanzlicher Gefäßsystem Visualisieren

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Seitenwurzel induzierbaren Systems in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Und Mais

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.

Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Standardisierte Methode für Hochdurchsatz-Sterilisation von Arabidopsis Samen

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) as biofertilizers or biocontrol agents has become an effective alternative to the use of conventional fertilizers and can increase crop productivity at low cost. Plant-microbe interactions depend upon host plant-secreted signals and a reaction hereon by their associated bacteria. However, the molecular mechanisms of how beneficial bacteria respond to their associated plant-derived signals are not fully understood. Assessing the transcriptomic response of bacteria to root exudates is a powerful approach to determine the bacterial gene expression and regulation under rhizospheric conditions. Such knowledge is necessary to understand the underlying mechanisms involved in plant-microbe interactions. This paper describes a detailed protocol to study the transcriptomic response of B. mycoides EC18, a strain isolated from the potato endosphere, to potato root exudates. With the help of recent high-throughput sequencing technology, this protocol can be performed in several weeks and produce massive datasets. First, we collect the root exudates under sterile conditions, after which they are added to B. mycoides cultures. The RNA from these cultures is isolated using a phenol/chloroform method combined with a commercial kit and subjected to quality control by an automated electrophoresis instrument. After sequencing, data analysis is performed with the web-based T-REx pipeline and a group of differentially expressed genes is identified. This method is a useful tool to facilitate new discoveries on the bacterial genes involved in plant-microbe interactions.

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

The goal of the protocol presented here is to study the transcriptomic response of endosphere-isolated Bacillus mycoides to potato root exudates. This method facilitates the identification of important bacterial genes involved in plant-microbe interactions and is in principle applicable to other endophytes and plants, with minor adjustments.

Pflanze-Mikroben-Interaktion: Transcriptional Antwort des Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.