Wir möchten den folgenden Personen ohne deren Hilfe die Sammlung von Kiefer Gewebe wäre nicht möglich gewesen danken: Dr. Joe Nairn, Matt Bryman, Michael Bordeaux, Ujwal Bagal, Huizhe Jin, und Amanda Bouffier.

Teil 1: Baum Ernte Nachdem der Baum ausgewählt und gefällt, ist es wichtig, so sorgfältig und so schnell wie möglich zu arbeiten. Da jeder unterschiedliche Gewebetyp geerntet wird, sollten sie sofort in ihre eigenen flüssigem Stickstoff Schiffe gestellt werden, Kreuzkontaminationen von Probenmaterial zu vermeiden. Diese RNA-Isolierung Protokoll ist skalierbar. <ol><li> Cut Schrauben werden in Längen von etwa 0,5 bis 0,75 m und mit einer Kettensäge Partitur der Rinde in zwei oder drei Stellen nach der Längsachse der Schraube. </li><li> Mit einem Stechbeitel, Arbeit Rande der erzielte Region, bis die Rinde beginnt sich aus dem Holz zu trennen und weiter zu arbeiten die Meißel während Sie wieder auf den Abschnitt der Rinde, bis sie vollständig von dem Stamm. </li><li> Sekundäre Xylem ist mit einer geraden Kante, einseitig gestochen durch Kratzen entlang der Längsachse der Schraube, die von entrindetes geerntet. Latexhandschuhe tragen, um eine Verunreinigung des Gewebes zu minimieren. </li><li> Phloem, die auf der Innenseite der Rinde Abschnitten befindet, ist leicht durch manuelles Peeling geerntet. </li><li> Reaction Holz ist von der Unterseite der Gliedmaßen nach dem Markieren sie mit Sprühlack in ihre ursprüngliche Ausrichtung bezüglich dem Boden zeigen, gesammelt. </li><li> Die Glieder sind in Schrauben von 1-2 m geschnitten und hat auf beiden Seiten entlang der Längsachse nach dem ungefähren Standorte der beiden Arten von Reaktionen Holz: gegenüber Holz (auf der Oberseite des Körpers) und Druckholz (auf der Unterseite Seite des Körpers). Die Rinde ist von den Extremitäten, wie oben beschrieben getrennt, außer dass nur die Rinde für jede Art von Reaktion Holz ist auf einmal entfernt. Sekundäre Xylem oder Phloem wird dann gesammelt, wie oben beschrieben und in flüssigem Stickstoff. </li><li> Andere Proben, wie Nadeln, Triebspitzen und jungen Zapfen, von Hand geerntet werden oder mit einer Gartenschere nach Bedarf. </li><li> Gesammelten Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren werden sollten, in gekennzeichneten Säcken oder geeigneten Behältern platziert werden und verpackt in Trockeneis für den Versand ins Labor. </li></ol> Teil 2: Freezer Mühle Bearbeitung der Proben <ol><li> Füllen Sie die Spex 6850 Gefrierschrank Mühle Behälter mit flüssigem Stickstoff und stellen die Auswirkungen bar in einer der Schleifen Fläschchen füllen und mit flüssigem Stickstoff vor Kälte. Abgießen flüssigem Stickstoff und fügen Probe Durchstechflasche. </li><li> Stellen Sie sicher, dass keine überschüssige Flüssigkeit Stickstoff in die Mahlkammer bleibt und dass übermäßige Stickstoff-Gas wird vollständig entlüftet, bevor die Endkappe sitzt, um die Kammer zu versiegeln. </li><li> Legen Sie die Schleifen Fläschchen in den Träger und zu schließen. </li><li> Mühle holzige Proben für zwei Zyklen von 1 Minute / Zyklus bei einer Rate-Einstellung von 14 Jahren. </li><li> Verwenden Sie ein flüssigem Stickstoff gekühlt Spachtel auf die gemahlenen Probe (Holzmehl) in ein Becherglas, die vorgekühlte hat und enthält eine geringe Menge von flüssigem Stickstoff zu entfernen. </li><li> Gießen Sie den flüssigen Stickstoff / Probe Gülle in einen Vorratsbehälter und Ort bei -80 ° C bis zum Gebrauch. </li></ol> Teil 3: RNA Isolation, Tag 1 <ol><li> Legen Sie 20ml der RNA-Isolierung Buffer in ein 50 mL Falcon-Röhrchen verschlossen und fügen 400 ul β-Mercaptoethanol, kurz vortexen, dann Wärme in einem 60 ° C Wasserbad. </li><li> 4 g gefrorene Gewebe in jedes Röhrchen. Cap und kräftig schütteln mit der Hand durch Vortexen für 10 Sekunden an. </li><li> Fügen Sie dem gleichen Volumen Chloroform auf das Rohr und drehen vorsichtig zu mischen. Das Röhrchen wird auf einem rotierenden Rad und lassen end-over-end Mischen für 5 Minuten. </li><li> Dekantieren die Mischung in eine 50 ml Oak Ridge Röhrchen und zentrifugieren bei 12.000 (17.200 xg) rpm in einem SS34-Festwinkelrotor für 5 Minuten. </li><li> Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Oak Ridge Röhrchen und fügen Sie einen halben Volumen Chloroform. </li><li> Vortex für 1 Minute und fahren Mischen auf einem rotierenden Rad für 5 Minuten. Zentrifuge bei 12.000 rpm (17.200 xg) in einem SS34 Festwinkelrotor für 5 Minuten. </li><li> Transfer der wässrigen Phase an die frische Oak Ridge Röhrchen und fügen Sie einen halben Volumen Chloroform. Vortex für 1 Minute. Zentrifuge bei 12.000 rpm (17.200 xg) in einem SS34 Festwinkelrotor für 10 Minuten. </li><li> Übertragen Sie die wässrige Phase in ein 50 mL High-Speed-Polypropylen-Röhrchen. Zentrifuge bei 10.000 rpm (11900 xg) in einem SS34 Festwinkelrotor für 20 Minuten. </li><li> Dekantieren Überstand in 50 ml Falcon-Röhrchen und fügen Sie einen Viertel-Volumen 10 M LiCl Lösung Überstand. Kurz vortexen und bei 4 ° C über Nacht Niederschlag. </li></ol> Teil 4: RNA Isolation, Tag 2 <ol><li> Hitze SSTE Puffer in einem 65 ° C Wasserbad vor dem Start. </li><li> Gießen Sie die LiCl-gefällte Probe in ein Polypropylenröhrchen und Pellet die RNA durch Zentrifugation bei 11.000 rpm in einem SS34 Festwinkelrotor (14.450 xg) für 30 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Nach der Zentrifugationabgießen und entsorgen Sie die Flüssigkeit und drehen Sie die Rohre auf Kimwipes für ca. 1 Minute. Pipette Sie verbleibende Überstand. </li><li> Resuspendieren jedes Pellet in 800 ul von beheizten SSTE mit einer Pipette zu durchmischen die Proben. Übertragen Sie die resuspendierten Probe 2 mL Ambion RNAse-freie Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wärme-Proben bei 65 ° C für 2 Minuten durch kräftiges Vortexen gefolgt, um eine komplette Resuspension zu gewährleisten. </li><li> Fügen Sie dem gleichen Volumen Phenol-Chloroform, pH 8, zu jeder Probe Röhre. Vortex jede Probe für 30 Sekunden und dann in einer Mikrozentrifuge Spin bei 14.000 rpm für 3 Minuten </li><li> Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues 2-ml-Ambion RNAse-freie Mikrozentrifugenröhrchen, und fügen Sie ein gleiches Volumen Chloroform. Vortex jede Probe für 30 Sekunden und Spin in die Mikrozentrifuge bei 14.000 rpm für 3 Minuten. </li><li> Transfer wässrigen Phase zu Phase-Lock Gel Röhrchen, die zuvor durch microfuging bei 11.000 rpm für 2 Minuten vorbereitet. Fügen Sie einen halben Volumen Chloroform und sanft Pipette zu mischen. </li><li> Zentrifuge bei 11.000 rpm für 5 Minuten und den Transfer der wässrigen Phase an die frische 2ml Ambion RNAse-freie Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol> Teil 5: RNA Fällung und Ethanol waschen <ol><li> Dann werden 50 ul 3,0 M Natriumacetat, pH 4,8 und 1 mL 100% Ethanol in die wässrige Phase. Vortex und Niederschlag in -80 ° C für 30 Minuten oder über Nacht bei -20 ° C. </li><li> Microfuge Proben bei 14.000 rpm für 30 Minuten bei 4 ° C, und sorgfältig absaugen des Überstandes. Bitte nicht stören das Pellet. </li><li> Waschen Sie die RNA-Pellets mit 1 ml -20 ° C 70% (v / v) Ethanol. Microfuge bei 14.000 rpm für 1 Minute und absaugen des Ethanols. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.3. </li><li> Uncap den Rohren und an der Luft trocknen Pellets auf der Bank für 3-5 Minuten. </li></ol> Teil 6: Final Resuspension und Quantifizierung <ol><li> Resuspendieren jedes Pellet in 100 ul DEPC-behandeltem Wasser. Durch Vortexen mischen und die Röhrchen bei 65 ° C für 2 Minuten, bevor Sie auf dem Eis. Wiederholen Sie, wenn nötig, Probe Resuspension zu gewährleisten. </li><li> Pool wie Proben, falls gewünscht und machen 50 ul einer 1:10-Verdünnung in 10 mM Tris, pH 7,5, für die spektrophotometrische Quantifizierung. Die Absorption Verhältnisse für 260/280 und 260/230 sind in der Regel größer als 2,1 und 2,2 bzw.. RNA-Isolierung Erträge reichen von 60-120μg / g gefrorene Gewebe. </li><li> Analysieren Sie die Proben durch Ausführen von 1,5-2,5 pg RNA auf einem 1% Agarosegel in TAE-Puffer. Weitere kritische Proben, analysieren die RNA mit Hilfe eines Agilent 2100 Bioanalyzer gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: RNA-Isolierung Erträge aus verschiedenen Geweben Nadelbaum Bereich von 60 bis 120 pg / g gefrorene Gewebe mit holzigen Proben typischerweise Nachgeben rund 70-80g / g gefrorene Gewebe. Diagnostic-Verhältnisse von 260/280 und 260/230 sind beide in der Regel größer als 2,1, und sind gute Indikatoren, dass die RNA-Probe frei von signifikanten Phenol-oder Kohlenhydrat-Kontamination ist, bzw.. Proben durch Agarosegelelektrophorese durch EtBr-Färbung analysiert werden sollten zeigen drei verschiedene Bands für 25S, 18S und 5S RNA (Abbildung 1). Die Bestimmung der Stöchiometrie der 28S bis 18S auf Agarosegelen ist etwas subjektiv, und Faktoren wie läuft die Bedingungen für das Gel, Färbung und Muster laden können alle eine Wirkung haben. Im Allgemeinen ist die 28S: 18S-Verhältnis erscheint auf&gt; 1,5 sein. Allerdings haben einige Koniferen Proben niedrigere Werte. Zum Beispiel folgende Agilent 2100 Analyse haben wir mehrere Instanzen von Nadelbaum-Proben aus verschiedenen Gewebetypen, wo die Stöchiometrie ist näher an 1.2:1 gesehen. So kann eine scheinbar geringen 28S: 18S hat Stöchiometrie durch Agarosegelelektrophorese nicht unbedingt auf eine schlechte Qualität der Probe. Leaf, schießen und Kegel Proben werden oft zusätzliche deutliche Banden durch chloroplastidäre ribosomalen RNAs. EtBr-gefärbten Materialien, die nicht aus der Probe gut oder hochmolekularen Banden (&gt; 8-10 kb) Sie wandern in der Regel zeigen, genomische DNA-Kontaminationen (Abbildung 2). Niedermolekulare Abstriche in der Nähe oder unterhalb der 5S-Band und reduziert ribosomalen Band Färbung oder eine scheinbare 18S&gt; 28S Stöchiometrie ist ein guter Indikator, dass RNA-Abbau stattgefunden hat (Abbildung 3). In der Agilent 2100 Elektropherogramm Analyse der Basislinie sollte gering sein und relativ glatt mit großen Peaks, die 18S und 28S ribosomalen RNAs mit 28S: 18S-Verhältnisse im Bereich irgendwo von 1,2 bis 2,0. Die Agilent RNA Integrity Number (RIN)-Wert kann eine bessere Prognosekraft RNA Qualität sein und sollte mindestens 7 oder höher für RNA, die für die Herstellung von Microarrays Ziele verwendet werden soll. Abbildung 4 zeigt ein typisches Agilent 2100 Elektropherogramm für Xylem-RNA mit einer 28S: 18S-Verhältnis gleich 1,4 und eine RIN-Wert von 8,6, während Abbildung 5 zeigt eine schlechte Xylem RNA prep mit einem sehr hohen Ausgangswert und merkliche Verschlechterung durch den 28S offenbart: 18S ratio gleich 0,65 und eine RIN-Wert von 3,4. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Agarose-Gel-Analyse von hochwertigem Kiefernholz RNA. Lane 1, NEB 1 kb-Standard, Spur 2 zeigt eine typische Gesamt-RNA isoliert von loblolly Kiefer sekundäre Xylem mit charakteristischen ribosomalen 28S, 18S und 5S Bands und scheinbare 28S: 18S-Verhältnis&gt; 1 ist. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Agarose-Gel-Analyse von Kiefern-RNA-Probe mit genomischer DNA kontaminiert. Lane 1, NEB 1 kb-Standard, Spur 2, Xylem RNA-Probe zeigt genomische DNA-Kontaminationen. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Agarose-Gel-Analyse von Kiefern-Probe zeigt RNA-Abbaus und Kontamination mit genomischer DNA. Lane 1, NEB 1 kb-Standard, Lane2, Xylem RNA-Probe zeigt genomische DNA Kontamination und schwere RNA-Abbaus. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Agilent 2100 Elektropherogramm Xylem Gesamt-RNA isoliert mit dem beschriebenen Verfahren auf loblolly Kiefer Xylem. 28S: 18S-Verhältnis gleich 1,4, entspricht RIN-Wert 8,6 <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Agilent 2100 Elektropherogramm apikalen Spitze der Gesamt-RNA mit schweren Abbau und genomische Kontamination. 28S: 18S-Verhältnis ist gleich 0,65, entspricht RIN Wert 3.4

<ol>
	<li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees.">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li><li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Sim&#369;es, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray.">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li></ol>

Die Beschaffung qualitativ hochwertiger RNA aus Nadelbaumarten kann eine schwierige Aufgabe angesichts der hohen Phenol-und Polysaccharid-Verbindungen in holzigen Gewebe gefunden werden. Beginnend mit dem Protokoll, das von Chang et al. (1), haben wir, dass strengere Extraktion gefunden und bereinigen Stufen führen auf die konsequente Trennung von sehr hoher Qualität Gesamt-RNA aus verschiedenen holzigen und nicht verholzte Gewebe von einer Vielzahl von Nadelbaumarten abgetastet. Dieses Video hat nicht nur unsere modi...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RNA Isolation Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>C298-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15509-037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10M LiCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>SSTE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenol-chloroform (pH8.0)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Oak Ridge High Speed Teflon Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-16B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene 50mL High Speed Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-10K</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>#21008-939</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Heavy, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#2302830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion, Inc.</td>
<td>#AM12425</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an improved method of rna isolation from loblolly pine (p. taeda l.) and other conifer species

Gewebe aus Nadelbaumarten, insbesondere den Angehörigen der Pinaceae Familie, wie loblolly Kiefer isoliert (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), enthalten hohe Konzentrationen an Phenolverbindungen und Polysaccharide, die mit RNA Aufreinigung stören. Isolation von hochwertigen RNA aus diesen Arten sind strenge Gewebe Mahnverfahren in das Feld und die Beschäftigung eines RNA-Isolierung Protokoll von mehreren organischen Extraktion Schritte umfasst, um RNA in ausreichender Qualität für die Microarray-und andere genomische Analysen zu isolieren. Die Isolierung von hochwertigen RNA aus Feld-gesammelt loblolly Kiefer Proben kann eine Herausforderung sein, aber einige Anpassungen an Standard-Gewebe und RNA-Isolierung Verfahren erheblich besseren Ergebnissen führen. Das Ausmaß der allgemeinen RNA-Abbaus erhöht, wenn die Proben nicht ordnungsgemäß gesammelt und transportiert werden aus dem Feld, vor allem während große Ernten. Gesamt-RNA-Ausbeuten deutlich durch Pulverisieren Proben erhöht werden in einer mit flüssigem Stickstoff Gefrierschrank Mühle vor der Isolierung RNA, besonders wenn Proben aus holzigen Gewebe kommen. Dies ist vor allem auf die Anwesenheit von Oxidationsmitteln, wie Phenol-Verbindungen, und Polysaccharide, dass beide vorhanden sind, in hohen Konzentrationen in Extrakten aus den holzigen Gewebe der meisten Nadelbaumarten. Wenn sie nicht entfernt, können diese Verunreinigungen über zu Problemen führen, wie RNA-Abbaus, dieses Ergebnis in geringen Ausbeuten und eine schlechte Qualität RNA-Probe zu tragen. Verschleppung von Phenolverbindungen sowie Polysaccharide, können auch verringern oder sogar ganz beseitigen die Aktivität der reversen Transkriptase oder andere Polymerasen allgemein zur cDNA-Synthese verwendet. Insbesondere bestimmt RNA als Vorlage für doppelsträngigen cDNA-Synthese in der Generierung von cDNA-Bibliotheken, einzelsträngige cDNA-Synthese für PCR oder qPCR ist, oder für die Synthese von Microarray-Target-Materialien verwendet werden, müssen von höchster Qualität sein, wenn Forscher erwarten, um optimale Ergebnisse zu erzielen. RNA-Isolierung Techniken, die üblicherweise für viele andere Pflanzenarten eingesetzt werden, oft in ihrer Fähigkeit, diese Verunreinigungen aus Nadelholz Proben zu entfernen und somit nicht Ertrag Gesamt-RNA-Proben geeignet für nachgeschaltete Manipulationen nicht aus. In diesem Video zeigen wir Methoden für Feld-Sammlung von Koniferen Gewebe, beginnend mit dem Einschlag eines 40 Jahre alten Baum, um die Ernte von Phloem-, Sekundar-Xylem und Reaktion Holz Xylem. Wir zeigen auch ein RNA-Isolation-Protokoll, das eine gleichbleibend hohe Qualität RNA für nachfolgende enzymatische Manipulationen nachgegeben hat.

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An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Viele pflanzliche Gewebe, einschließlich Phloem und Xylem von loblolly Kiefer (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), einen hohen Gehalt an Phenolen und Polysaccharide, die mit RNA Aufreinigung stören. Diese Präsentation beschreibt Techniken für die Ernte im Freiland Gewebe und Isolierung von RNA in ausreichender Qualität für Microarrays und andere genomische Analysen.

Ein verbessertes Verfahren zur RNA-Isolierung aus Loblolly Pine ( P. taeda L.) und andere Nadelbaumarten

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

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Research

JoVE Journal

Biology

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

13.7K Aufrufe.  University of Georgia (UGA). Viele pflanzliche Gewebe, einschließlich Phloem und Xylem von loblolly Kiefer ( Pinus taeda L.), einen hohen Gehalt an Phenolen und Polysaccharide, die mit RNA Aufreinigung stören. Diese Präsentation beschreibt Techniken für die Ernte im Freiland Gewebe und Isolierung von RNA in ausreichender Qualität für Microarrays und andere genomische Analysen.

Serie: An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

Die Verarbeitung der Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Forschung

Biologie

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ease of growth and small size. This small size, though, has disallowed a number of technical approaches found in other model systems. For example, blood transfusions in mammalian systems and grafting techniques in plants enable asking questions of circulatory system composition and signaling. The circulatory system of the worm, the pseudocoelom, has until recently been impossible to assay directly. To answer questions of intercellular signaling and circulatory system composition C. elegans researchers have traditionally turned to genetic analysis, cell/tissue specific rescue, and mosaic analysis. These techniques provide a means to infer what is happening between cells, but are not universally applicable in identification and characterization of extracellular molecules. Here we present a newly developed technique to directly assay the pseudocoelomic fluid of C. elegans. The technique begins with either genetic or physical manipulation to increase the volume of extracellular fluid. Afterward the animals are subjected to a vampiric reverse microinjection technique using a microinjection rig that allows fine balance pressure control. After isolation of extracellular fluid, the collected fluid can be assayed by transfer into other animals or by molecular means. To demonstrate the effectiveness of this technique we present a detailed approach to assay a specific example of extracellular signaling molecules, long dsRNA during a systemic RNAi response. Although characterization of systemic RNAi is a proof of principle example, we see this technique as being adaptable to answer a variety of questions of circulatory system composition and signaling.

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The model organism C. elegans uses pseudocoelomic fluid as a passive circulatory system. Direct assay of this fluid has not been previously possible. Here we present a novel technique to directly assay the extracellular space, and use systemic silencing signals during an RNAi response as a proof of principle example.

Vampiric Isolation der extrazellulären Flüssigkeit aus<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

RNA-Isolierung aus Maus Pankreas: Eine Ribonuklease-reichen Gewebe

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Ein verbesserter Schnittverfahren für widerspenstige Pflanzengewebeproben

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Spaltöffnungen Tape-Peel: Ein verbessertes Verfahren zur Wache Zelle Probenvorbereitung

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

Ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...