Name: collection and processing of lymph nodes from large animals for rna analysis: preparing for lymph node transcriptomic studies of large animal species
Uploaded: 2018-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species at JoVE.

Die Autoren möchten James Fosse für seine hervorragende Arbeit auf allen Videografie und Videoverarbeitung danken; Michael Marti für seine hervorragende Arbeit bei der Erzeugung von digitalisierten Rinder Bilder; Lilia Walther für ihre Hilfe mit RNA-Extraktion und Bioanalyzer läuft; Mitch Palmer und Carly Kanipe für ihre hilfreiche Bewertung und Feedback auf Lymphknoten Bilder; und die Tierpflege und Tierärzten bei der National Animal Disease Center für all ihre harte Arbeit und Unterstützung bei der Tierhaltung und der Vorbereitung auf Autopsien.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen. Alle Forschung wird mit intramurale Mittel aus dem US Department of Agriculture, Agricultural Research Service finanziert. Alle Verweise auf bestimmte Produkte werden für die Zwecke der experimentellen Reproduzierbarkeit zur Verfügung gestellt und stellen keine Billigung dieser Produkte durch die Bundesregierung.

Die Mehrheit der transkriptomischen Studien und die dazugehörigen Protokolle auf Maus, Ratte oder Post-Mortem Humanproben konzentrieren. Jedoch bieten Untersuchungen in Vieh und Wildtiere eine breite Palette von Möglichkeiten für die Charakterisierung der Immunantwort gegen Krankheiten, sowohl als für Veterinärmedizin und in Bezug auf zoonotische Krankheiten, für die menschliche Gesundheit. Dieses Protokoll zur Verfügung gestellt, einer Übersicht der wichtigsten Überlegungen für hoher Integrität RNA-Extraktion...

RNA-Sequenzierung Analyse des transkriptoms Lymphknoten bietet die Möglichkeit, die Immunantwort von Tieren zu einer Vielzahl von Krankheitserregern zu charakterisieren. Während diese Methode bei Mäusen ausgiebig genutzt wurden, haben vor kurzem Analysen in größeren Säugetiere1,2ausgebaut. Vieh/großes Tier Lymphknoten kann verwendet werden, um Host Reaktion auf eine Infektion, nicht nur für den Gebrauch im Impfstoff oder genetische Anfälligkeit Studien und für die Identifizierung von Zielen für die Entwicklung von Medikamenten, sondern auch als Modellsysteme für Studien am Menschen zu charakterisieren über Zoonosen. Zum Beispiel im Falle von Brucellose (eine bakterielle Zoonose, dass Auswirkungen eine halbe Million auf der ganzen Welt jedes Jahr Menschen), trotz deutlich erhöhte Kosten, Studien bei Schafen oder Ziegen sind relevanter für die Infektion beim Menschen und menschliche Impfstoff Entwicklung als Labor Tiermodelle. Maus Infektionsmodelle rekapitulieren die retikuloendothelialen System Infektion aber nicht die charakteristischen klinischen Symptome3.
Im großen Tierversuch im Vergleich zu tierischen Laborstudien umfasst den Prozess des Gewebes Ernte unbedingt eine längere Verzögerung zwischen der Euthanasie und die Gewebe-Kollektion, die eine mögliche für die Erhaltung der Herausforderung qualitativ hochwertige RNA. Intakte RNA ist essentiell für die Generation der biologisch relevanten transkriptomischen Daten. Die Erzeugung von qualitativ hochwertigen RNA aus Gewebeproben erfolgt im Containment Einrichtungen für große Tiere Pathogen Studien besonders kritisch. Solche Studien sind von Natur aus schwieriger durchzuführen, da sie nicht nur genehmigte Anlagen und hoch qualifiziertes Personal erfordern aber auch erhebliche finanzielle Kosten, die abhängig von der Arbeit von Dutzende bis Hunderte von Tausenden von Dollar reichen können. Diese Arten von Studien beinhalten auch eine interdisziplinäre Zusammenarbeit und fachübergreifende Kenntnisse für ihren Abschluss, ihre Komplexität hinzufügen. Daher bietet Ausbildung auf, Entwicklung und Einhaltung ein optimiertes System für die Entnahme von Proben und Erhaltung erhebliche Vorteile für nachgeschaltete molekulare Untersuchungen von Geweben von infizierten Tieren.
Die Sammlung von größeren Lymphknoten präsentiert zusätzliche Herausforderungen für die Gewebe-Sammlung im Vergleich zu ähnlichen Probenahme von murinen Lymphknoten. Die Vorbereitung auf die Probe-Exzision erfordert ein grundlegendes Verständnis der Anatomie des Lymphknotens, einschließlich der relevanten internen Strukturen. Die Struktur eines Lymphknotens besteht aus lymphoiden Läppchen umgeben von Nebenhöhlen mit Lymphe gefüllt. Diese Strukturen sind in eine zähe, fibröse Kapsel eingeschlossen. 4 eine lymphoide Lobule ist die "grundlegende anatomische und funktionelle Einheit des Lymphknotens" und besteht aus Follikel, eine tief kortikale Einheit und medulläre Schnüre und Nebenhöhlen4 (Abbildung 1A). B- und T-Lymphozyten sind Heimat der Follikel und tiefen kortikalen Einheiten. Diese Strukturen bieten eine 3D Gerüst und der Interaktion zwischen Lymphozyten und Antigen oder antigenpräsentierende Zellen.
Grob, Follikel und tiefen kortikalen Einheiten identifiziert werden können auf Schnittfläche als sie eine dichtere netzartige Geflecht enthalten und dunkler als die Nebenhöhlen, die bestehen aus einem zarteren netzartige Geflecht und heller erscheinen (Abbildung 1 b). Gemäß der Konvention beziehen sich Pathologen auf die Regionen der Lymphknoten als oberflächliche Kortex (Follikel), Parakortex (tief kortikalen Einheiten) und der Medulla (medulläre Schnüre und Nebenhöhlen). Eine ordnungsgemäße Untersuchung aller drei Regionen wurde als beste Praxis in Routine pathologischen Untersuchung Leitlinien für Lymphknoten5angesehen. Beachten Sie, dass es erhebliche Unterschiede in der Konsistenz, Größe und Farbe der Lymphknoten, auch innerhalb eines einzelnen Tieres. Zunehmendem Alter der Tiere ihre Lymphknoten wird tendenziell kleiner und werden fester als bei jüngeren Tieren, in der Regel auf eine Erhöhung ihrer Bindegewebe und eine Verminderung der normalen lymphatischen Struktur6,7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg"> Abbildung 1. Anatomie des Lymphknotens. (A) Diese Karikatur zeigt die Anatomie des Lymphknotens, Schlüsselstrukturen darstellt. (B) dieses noch Bild zeigt einen bovinen Lymphknoten schneiden im Querschnitt. Die relevanten Strukturen/Layer, die mit dem bloßen Auge sichtbar sind, werden hervorgehoben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Abhängig von der experimentellen Frage wird verschiedenen Lymphknoten für die Erhebung und Analyse von Interesse sein. Peripheren Lymphknoten sind diejenigen befindet sich tief im subkutanen Gewebe. Bei Rindern, periphere oder oberflächlichen Lymphknoten oft verwendet in der klinischen und experimentellen Praxis umfassen Parotis, mandibulären, retropharyngeal, prescapular, Thymus (precrural) und oberflächlichen inguinalen (Supramammary bei Frauen, bei Männern scrotal) () ( Abbildung 2). In Tabelle 1sind die Eigenschaften der wichtigsten oberflächlichen Lymphknoten, wie beschrieben in die Rinder System8beschrieben. Im folgenden sind einige mögliche Lymphknoten Sammlung Pläne für bakterielle Infektionskrankheiten von Rindern als Ausgangspunkt für die Untersuchung vorgestellt.
Brucella Abortus/Brucella Melitensis: Standard necropsies für B. Abortus-infizierten Rindern und B. Melitensis-infizierten Ziegen am National Animal Disease Center zu erholen, Supramammary, Prescapular und Parotis Lymphknoten Gewebe , sowohl für das Schleifen für die bakterielle Enumeration und für die RNA-Vorbereitung für den Host RNA Ausdruck profilieren. B. Abortus zurückgewonnen werden regelmäßig in jedem der diese Lymphknoten in experimentell infizierten Rindern9. Das Vorhandensein von Bakterien in jedem solcher Lymphknoten nachweisbar in B. Melitensis-infiziert Ziegen bis zu mindestens neun Monate nach der Infektion mit der RNA-basierten Methoden aus unseren Studien (Boggiatto Et Al., unveröffentlicht). Salmonellen SP.: Prescapular, subiliac (Thymus), mesenterialen Lymphknoten nützlich erwiesen haben, während die Profilierung der Rinder Kadaver Salmonellen Prävalenz10,11,12 und wäre von Interesse für transkriptomischen Studien. E. Coli O157: H7: mesenterialen Lymphknoten (in den mittleren Dünndarm und distalen Dünndarm Standorten) sind die Niederlassungen einer gelegentlichen Erholung der Bakterien im infizierten Kälbern (aber nicht bei infizierten Erwachsenen Rindern)13. Leptospirose (Leptospira SP.): eine chronische Persistenz der Bakterien in den Lymphknoten Entwässerung der Brustdrüse14beobachtet worden. Mycobacterium bovis : Bei Rindern wurden die Bakterien wieder Post-experimentelle Infektion von mediastinalen und tracheobronchialer Lymphknoten Kälber15. Darüber hinaus ist Lymphknoten RNA verwendet worden, um große Tier Host Reaktionen auf Viren, wie die Schweine reproduktive und respiratorische Syndrom Virus2zu untersuchen. Abbildung 2 zeigt den Speicherort der eine Teilmenge von diesen großen Lymphknoten im Körper Rinder.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg"> Abbildung 2: Cartoon Darstellung ausgewählter Lymphknoten Standorte in Bos taurus . Die nummerierten Lymphknoten sind kommentiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
In diesem Papier und das zugehörige Video präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung von großen Tieren Lymphknoten für RNA-Studien, soll informativ für Molekularbiologen transkriptomischen Studien von großen Tieren Infektionen beteiligt sein. Erstens bieten wir einen Überblick über die Isolierung-Verfahren für die Lymphknoten mit Probenahme von Rindern und Bisons Gewebe als Beispiele. Gepaart mit dieser Demo, wie im Video dargestellt, ist ein Workflow für eine reproduzierbare Gewebe Probenahme zur RNA-Isolierung. Anschließend beschreiben wir wichtige Überlegungen für die Verarbeitung eines infizierten Lymphknotens mit Fokus auf Sicherheit, Beständigkeit und RNS-Qualität.
Die Vorbereitung der RNA aus dem Gewebe mit einem versauerten Phenol-Guanidin erfolgt Reagenz basiert auf der Originalmethode von Chomczynski und Sacchi16,17, mit einer Reinigung über Silica-basierten Spin Spalten in Anwesenheit von chaotropen Agenten basierend auf der ursprünglichen Arbeit von Vogelstein und Gillespie18. Wir untersuchen auch das Potenzial für die Verwertung von RNA für Transkriptom von Rindern Lymphknoten durch alternative Methoden haltbar gemacht. Schließlich beschäftigen wir die Auswirkungen der Zeitvariablen RNS-Qualität in großen Tier Autopsien, einschließlich eine repräsentativere Experiment Darstellung der Wirkung einer Erhöhung in der Zeit zwischen der Euthanasie und die Probenahme auf dem wiederhergestellten RNA-Profil von Bison und Bovine Lymphknoten. Dieser Artikel wird nicht nur Molekulare Biologen, sondern auch zu tierärztliche Forscher beginnend transkriptomischen Studien nützlich.

<table><tbody><tr><td>RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpels</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF7281</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps, rat tooth</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td>Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference</td></tr><tr><td>3 mm punch biopsy needles</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9949469</td><td></td></tr><tr><td>Sharps container (small and transportable for necropsy)</td><td>Stericycle</td><td>8900SA</td><td>1 qt. size shown here</td></tr><tr><td>Cutting boards or disposable trays</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>Available in a variety of sizes, depends on user preference</td></tr><tr><td>Personal protective equipment</td><td></td><td></td><td>Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.)</td></tr><tr><td>Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments)</td><td>ThermoFisher</td><td>12183018A</td><td>Designed for up to 100 mg tissue</td></tr><tr><td>100% Ethanol (200 proof for molecular biology)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (General, for gel electrophoresis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>1X TBE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24301</td><td>Can also make from scratch in the laboratory</td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>EMD Millipore</td><td>S4117</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer)</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols)</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1975</td><td></td></tr><tr><td>Plastic spreader (L-shaped spreader)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-665-231</td><td>Only needed for sterility testing for samples from infected animals</td></tr><tr><td>Necropsy knives</td><td>Livestock Concepts</td><td>WI-0009209</td><td></td></tr></tbody></table>

collection and processing of lymph nodes from large animals for rna analysis: preparing for lymph node transcriptomic studies of large animal species

Große Tiere (Vieh und Wildtiere) dienen als wichtiges Reservoir von Zoonoseerregern, einschließlich Brucella, Mycobacterium Bovis, Salmonellenund Escherichia Coli, und eignen sich für die Untersuchung der Pathogenese und/oder Ausbreitung der Bakterien in natürlichen Wirte. Mit der wichtigen Funktion der Lymphknoten in der Host-Immunantwort dienen Lymphknoten Gewebe als eine potentielle Quelle von RNA für nachgeschaltete transkriptomischen Analysen, um die zeitlichen Veränderungen in der Genexpression in Zellen im Verlauf einer Infektion zu bewerten. Dieser Artikel bietet eine Übersicht über den Prozess der Lymphknoten Sammlung, Gewebe-Sampling und nachgelagerten RNA Verarbeitung in Vieh, weitere Beispiele zur Verfügung gestellt von der amerikanischen Bison (Bison Bison Rind (Bos Taurus) als ein Modell mit ). Das Protokoll enthält Informationen über die Lage, Ermittlung und Entfernung der Lymphknoten aus mehreren wichtigen Standorten im Körper. Darüber hinaus wird eine Biopsie Sampling-Methode vorgestellt, die für eine Konsistenz der Probenahme über mehrere Tiere ermöglicht. Einige Überlegungen zur Probe Erhaltung werden diskutiert, einschließlich der Erzeugung von RNA geeignet für nachgeschaltete Methoden wie RNA-Sequenzierung und RT-PCR. Aufgrund der langen Verzögerungen große Tier vs. Maus Zeitstudien Kurs innewohnt sind repräsentative Ergebnisse von Bisons und Rinder Lymphknoten Gewebe präsentiert um zu beschreiben, den zeitlichen Verlauf der Abbau in diesem Gewebetyp, im Rahmen einer Überprüfung der methodische Vorarbeiten auf RNA-Abbau in anderen Geweben. Insgesamt wird dieses Protokoll sinnvoll, beide tierärztliche Forscher Anfang Transkriptom Projekte auf große Tiere Proben und Molekularbiologen Lerntechniken für in Vivo Gewebe-Probeentnahme und in-vitro- Verarbeitung interessiert sein.

Die Nutzung der in diesem Artikel (Schritte 1 bis 4 des Protokolls) vorgestellten Überlegungen helfen bei der Beitreibung von RNA aus großen Tier Proben, die für eine nachgeschaltete Analyse in Host genexpressionsstudien geeignet ist. Die RNA-Qualität für downstream-Anwendungen wird durch mehrere standard-Maßnahmen beurteilt. Spektrophotometrie A260/a280 Verhältnis liefert ein Maß für die Protein-Verschmutzung und A260/a230 Verhältnis stellt ein weiteres Mittel zur Re...

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Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Erhebung und Verarbeitung von Lymphknoten von großen Tieren für RNA-Analyse: Vorbereitung auf Lymphknoten Transkriptomischen Studien der großen Tierarten

Dieses Protokoll bietet einen Überblick über Verfahren zur Isolierung von RNA für die transkriptomischen Profilierung der Lymphknoten Gewebe von großen Tieren, einschließlich Schritte bei der Identifizierung und Entfernung der Lymphknoten von Vieh und Wildtiere, Probenahme Ansätze Konsistenz über mehrere Tiere, und Überlegungen sowie repräsentative Ergebnisse für die Post-Sammlung, Erhaltung und Verarbeitung für RNA-Analyse zu schaffen.

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.3K Aufrufe.  U.S. Department of Agriculture. Dieses Protokoll bietet einen Überblick über Verfahren zur Isolierung von RNA für die transkriptomischen Profilierung der Lymphknoten Gewebe von großen Tieren, einschließlich Schritte bei der Identifizierung und Entfernung der Lymphknoten von Vieh und Wildtiere, Probenahme Ansätze Konsistenz über mehrere Tiere, und Überlegungen sowie repräsentative Ergebnisse für die Post-Sammlung, Erhaltung und Verarbeitung für RNA-Analyse zu schaffen.

Serie: Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and Western Blot, since it mostly contains lipids. RNA isolation from adipose tissue samples is also challenging as extra steps are required to avoid these lipids. Here, we present a procedure to collect three anatomically different white adipose tissues from mice, to process these samples and perform RNA isolation. We further describe the synthesis of cDNA and gene expression experiments using real-time PCR. The hereby described protocol allows the reduction of contamination from the animal's hair and blood on fat pads as well as cross-contamination between different fat pads during tissue collection. It has also been optimized to ensure adequate quantity and quality of the RNA extracted. This protocol can be widely applied to any mouse model where adipose tissue samples are required for routine experiments such as real-time PCR but is not intended for isolation from primary adipocytes cell culture.

The purpose of this paper is to present a step-by-step procedure to collect different white adipose tissues from mice, process the fat samples and extract RNA.

Maus Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung für die RNA-Analyse

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Forschung

Biochemie

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Genetik

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent pathways. Until recently, thermogenic adipocytes were considered a homogeneous population. However, recent studies have indicated that there are multiple subtypes or subpopulations that are distinct in developmental origin, substrate use, and transcriptome. Despite advances in single-cell genomics, unbiased decomposition of adipose tissues into cellular subtypes has been challenging because of the fragile nature of lipid-filled adipocytes. The protocol presented was developed to circumvent these obstacles by effective isolation of single nuclei from adipose tissue for downstream applications, including RNA sequencing. Cellular heterogeneity can then be analyzed by RNA sequencing and bioinformatic analyses.

This publication describes a protocol for the isolation of nuclei from mature adipocytes, purification by fluorescence-activated sorting, and single-cell level transcriptomics.

Isolierung von Adipose-Gewebekernen für einzellige Genomanwendungen

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine cancer models are extremely limited in their diversity and suffer from poor translation to the clinic. To serve as a more physiological preclinical model for immunotherapy studies, this protocol has been developed to evaluate the treatment of human tumors in a mouse reconstituted with a human immune system. This unique protocol demonstrates the development of human immune system (HIS, &#34;humanized&#34;) mice, followed by implantation of a human tumor, either a cell-line derived xenograft (CDX) or a patient derived xenograft (PDX). HIS mice are generated by injecting CD34+ human hematopoietic stem cells isolated from umbilical cord blood into neonatal BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2R&#947;C-/- NODSIRP&#945;) highly immunodeficient mice that are also capable of accepting a xenogeneic tumor. The importance of the kinetics and characteristics of the human immune system development and tumor implantation is emphasized. Finally, an in-depth evaluation of the tumor microenvironment using flow cytometry is described. In numerous studies using this protocol, it was found that the tumor microenvironment of individual tumors is recapitulated in HIS-PDX mice; &#34;hot&#34; tumors exhibit large immune infiltration while &#34;cold&#34; tumors do not. This model serves as a testing ground for combination immunotherapies for a wide range of human tumors and represents an important tool in the quest for personalized medicine.

This protocol outlines the generation of human immune system (HIS) mice for immuno-oncology studies. Instructions and considerations in the use of this model for testing human immunotherapeutics on human tumors implanted in this model are presented with an emphasis on characterizing the response of the human immune system to the tumor.

Erprobung von Krebsimmuntherapeutika in einem humanisierten Mausmodell mit menschlichen Tumoren

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine ...

Krebsforschung

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identifizierung der Codierung und nicht-kodierende RNA-Klassen ausgedrückt bei Schweinen Vollblut

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Immunologie und Infektion

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Neurowissenschaften

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into sympathetic and parasympathetic branches. Normally, there is a balance between these two branches to maintain homeostasis. However, cardiac disease states such as myocardial infarction, heart failure, and hypertension can induce the remodeling of cells involved in cardiac innervation, which is associated with an adverse clinical outcome.
Although there are vast amounts of data for the histological structure and function of the cardiac autonomic nervous system, its molecular biological architecture in health and disease is still enigmatic in many aspects. Novel technologies such as single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) hold promise for the genetic characterization of tissues at single-cell resolution. However, the relatively large size of neurons may impede the standardized use of these techniques. Here, this protocol exploits droplet-based single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq), a method to characterize the biological architecture of cardiac sympathetic neurons in health and disease. A stepwise approach is demonstrated to perform snRNA-seq of the bilateral superior cervical (SCG) and stellate ganglia (StG) dissected from adult mice.
This method enables long-term sample preservation, maintaining an adequate RNA quality when samples from multiple individuals/experiments cannot be collected all at once within a short period of time. Barcoding the nuclei with hashtag oligos (HTOs) enables demultiplexing and the trace-back of distinct ganglionic samples post sequencing. Subsequent analyses revealed successful nuclei capture of neuronal, satellite glial, and endothelial cells of the sympathetic ganglia, as validated by snRNA-seq. In summary, this protocol provides a stepwise approach for snRNA-seq of sympathetic extrinsic cardiac ganglia, a method that has the potential for broader application in studies of the innervation of other organs and tissues.

This protocol describes the detailed, low-input sample preparation for single-nucleus sequencing, including the dissection of mouse superior cervical and stellate ganglia, cell dissociation, cryopreservation, nucleus isolation, and hashtag barcoding.

Low-Input-Nukleus-Isolierung und Multiplexing mit Barcode-Antikörpern sympathischer Mausganglien für die Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into ...

Medizin

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Gewebesammlung von Fledermäusen für -Omics Analysen und primäre Zellkultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Biologie

Application of Laser Microdissection to Uncover Regional Transcriptomics in Human Kidney Tissue

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and depth of this technology and extending it to the level of cells within the tissue is needed. Although the use of single nuclear and single cell RNA sequencing has become widespread, the expression signatures of cells obtained from tissue dissociation do not maintain spatial context. Laser microdissection (LMD) based on specific fluorescent markers would allow the isolation of specific structures and cell groups of interest with known localization, thereby enabling the acquisition of spatially-anchored transcriptomic signatures in kidney tissue. We have optimized an LMD methodology, guided by a rapid fluorescence-based stain, to isolate five distinct compartments within the human kidney and conduct subsequent RNA sequencing from valuable human kidney tissue specimens. We also present quality control parameters to enable the assessment of adequacy of the collected specimens. The workflow outlined in this manuscript shows the feasibility of this approach to isolate sub-segmental transcriptomic signatures with high confidence. The methodological approach presented here may also be applied to other tissue types with substitution of relevant antibody markers.

We describe a protocol for laser microdissection of sub-segments of the human kidney, including the glomerulus, proximal tubule, thick ascending limb, collecting duct and interstitium. The RNA is then isolated from the obtained compartments and RNA sequencing is carried out to determine changes in the transcriptomic signature within each sub-segment.

Anwendung der Laser-Mikrodissektion zur Aufdeckung der regionalen Transkriptomik im menschlichen Nierengewebe

Gene expression analysis of human kidney tissue is an important tool to understand homeostasis and disease pathophysiology. Increasing the resolution and ...