Die Kennzeichnung, Hybridisierung und Waschen Protokolle hierin enthalten einige Änderungen an, die zuvor von Dr. J. Quackenbush während der Institute for Genomic Research (TIGR), Dr. Shawn Levy an der Vanderbilt Microarray Shared Resource (VMSR) entwickelt, und Dr. Rob Alba während der Boyce Thompson Institute (BTI) Cornell University.

(Hinweis Abschnitte 1 bis 4 nicht in Video demonstriert) Vorbereitung Cy-markierten Target-cDNA Was folgt, ist das Protokoll, die wir für die cDNA-Synthese aus loblolly Kiefer Gesamt-RNA und indirekten cDNA Kennzeichnung vor Hybridisierungen Microarray. Obwohl ein paar nicht-triviale Änderungen vorgenommen wurden, ist das Protokoll unter ähnlich wie in der Bedienungsanleitung SuperScript Indirekte die Invitrogen cDNA Labeling Kit zur Verfügung gestellt. Teil 1: First-Strand cDNA Synthesis Reaction <ol><li> Mix und kurz Spin jedes Kit-Komponenten vor der Verwendung. </li><li> Bereiten Sie Reaktionen wie folgt: <ul><li> Xμl DEPC-H 2 O </li><li> Xμl Gesamt-RNA, 20 ug / Reaktion (vorbehandelt mit Turbo DNase Ambions) </li><li> 2μl Anchored Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl) </li><li> 1μl Zufällige Hexamer Primer </li><li style="list-style:none;"> Gesamtvolumen = 18μl </li></ul></li><li> Die Röhrchen bei 70 ° C für 5 Minuten, und dann auf Eis für 1-2 Minuten. </li><li> Fügen Sie die folgenden zu jedem Reaktionsgefäß auf Eis: <ul><li> 6μl 5X First-Strand-Puffer </li><li> 1.5μl 0,1 M DTT </li><li> 1.5μl 10mM dNTP-Mix </li><li> 1μl RNaseOUT (40U/μl) </li><li> 2μl SuperScript III RT (400U/μl) </li></ul></li><li> Vorsichtig mischen und Spin kurz. Inkubieren Rohr über Nacht bei 45 ° C. </li><li> Add 15μl 1M NaOH zu jedem Reaktionsgefäß geben und gut mischen. </li><li> Inkubieren Rohr bei 70 ° C für 10 Minuten. </li><li> Fügen Sie 15μl von 1M HCl; vorsichtig mischen. </li><li> Add 20 &amp;mgr; l 3 M Natriumacetat (pH 5,2); vorsichtig mischen. </li></ol> Teil 2: Reinigung von First-Strand cDNA. <ol><li> Fügen Sie 500μl der Ladepuffer der cDNA (aus Schritt 1,9) und gut mischen. </li><li> Legen Sie eine SNAP Purification Column (im Lieferumfang des Indirect Labeling Kit) auf einem Sammelrohr und laden Sie Ihre cDNA auf der Säule. </li><li> Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Legen Sie die SNAP Spalte auf der gleichen Sammlung Rohr und fügen 500μl Waschpuffer. </li><li> Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,4 und 2,5 dreimal für insgesamt drei 500μl wäscht. </li><li> Spin noch einmal bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute sec; entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Legen Sie die SNAP Column auf ein neues 1,5 ml Tube. </li><li> Add 50 ul warmen DEPC-Wasser (50 ° C) auf die SNAP Column und inkubieren Spalte bei Raumtemperatur für 1 Minute. Eluieren der cDNA über eine Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2,9, mit 100 &amp;mgr; l warmes DEPC-Wasser und die gleiche 1.5ml tube für den Eluenten. </li><li> Add 20 &amp;mgr; l 3 M Natriumacetat (pH 5,2) zum Eluenten aus den Schritten 2,9 und 2,10. </li><li> Add 3μl von Glykogen (20mg/ml), um das Rohr und mischen. </li><li> Fügen Sie 500μl eiskaltem 100% EtOH, gut mischen und inkubieren das Rohr 1 Stunde bei -80 ° C. </li><li> Drehen Sie das Rohr bei 14.000 g bei 4 ° C für 20 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. </li><li> Fügen Sie 500μl eiskaltem 70% EtOH und drehen Sie das Rohr bei 14.000 g bei 4 ° C für 5 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. </li><li> Der Luft trocknen die Proben für 5 Minuten; sicherzustellen, dass alle EtOH entfernt wird. </li><li> Warm 2X Coupling Buffer bei 37 ° C für 5 Minuten und Resuspension der cDNA-Probe in 5μl der warmen 2X Coupling Buffer. </li><li> Erhitzen Sie die cDNA / Coupling-Puffer bei 50 ° C für 10 Minuten und Vortex gut. Stellen Sie sicher, dass Ihr cDNA Pellet vollständig in den 2X Coupling Buffer resuspendiert. </li></ol> Teil 3: Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff Bei der Vorbereitung der Reaktion vorsichtig sein, um die Exposition der Farbstofflösung, um Licht zu minimieren. Außerdem ist DMSO hygroskopisch und zieht Feuchtigkeit aus der Luft, die mit dem NHS-Ester des Farbstoffes reagieren und reduzieren die Kupplungsreaktion Effizienz absorbieren. Halten Sie das DMSO im Kit in einer bernsteinfarbenen Schraubverschluss Fläschchen bei -20 ° C geliefert, und lassen Sie das Fläschchen auf Raumtemperatur erwärmt, bevor um Kondensation zu vermeiden. Verwenden Sie nur das DMSO mit diesem Kit zur Verfügung gestellt. <ol><li> Öffnen Sie ein Paket von Cy-3-oder Cy-5 Dye und fügen 75μl DMSO direkt an den Farbstoff Durchstechflasche. </li><li> Add 5μl der DMSO / Farblösung in die Röhre aus Schritt 2.18. </li><li> Gut mischen und inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur im Dunkeln für 1 Stunde. </li><li> Add 20 &amp;mgr; l 3 M Natriumacetat (pH 5,2), um den Farbstoff gekoppelten cDNA-Lösung. </li><li> Fügen Sie 500μl der Ladepuffer der cDNA-Lösung. Gut mischen durch Vortexen. </li><li> Legen Sie eine SNAP Spalte auf eine klare Sammelröhrchen und laden Sie die cDNA / Puffer-Lösung. </li><li> Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Legen Sie die SNAP Spalte auf der gleichen KollektionRohr, fügen Sie 500μl Waschpuffer in Spalte. </li><li> Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3. 8-3,9 dreimal für insgesamt drei 500μl wäscht. </li><li> Spin noch einmal bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute; entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Legen Sie die SNAP Spalte auf eine neue Bernstein-Collection-Tube. </li><li> Fügen Sie 65μl der warmen DEPC-Wasser (50 ° C) auf die SNAP-Säule und Inkubation bei Raumtemperatur für 1 Minute. </li><li> Spin bei 14.000 g bei Raumtemperatur für 1 Minute und sammeln Sie die Flow-Through. Die Flow-Through sollte 60μl des gereinigten Farbstoff-gekoppelten cDNA. </li></ol> Teil 4: Beurteilung der Labeling Verfahren. <ol><li> Conduct einem Spektralphotometer Test zu jeder Cy-cDNA Kennzeichnung zu bewerten. Berechnen Sie die Gesamtzahl der pmol der synthetisierten cDNA: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Berechnen Sie die gesamte pmol eingebaut Cy-Farbstoff für jede Kennzeichnung Reaktion: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Als nächstes berechnen die pmol Nukleotid / pmol Farbstoff-Verhältnis für jede Reaktion. Optimal Reaktionen erzeugen&gt; 6000pmol der cDNA (pro 60ul),&gt; 200pmol von Cy-Dye (pro 60ul) und ein Nukleotid / Farbstoff-Verhältnis, das &lt;30 ist. </li></ol> Teil 5: Schieben Sie Pre-Wash <ol><li> Die PtGen2 Array basiert auf Corning UltraGaps Dias (Amino-Silan beschichtet) gedruckt und cDNAs sind UV-vernetzt. Print Flecken sind deutlich sichtbar durch den hohen Salzgehalt des Puffers. </li><li> Verwenden Sie ein Diamant-Spitze Feder, um die Folie für den oberen und unteren Bereich der Print-Bereich (optional) zu markieren. </li><li> Legen Sie etwa 250 ml bis 43 vorgewärmten ° C 0,2% SDS-Lösung in Objektträger waschen Teller (3 &quot;x 4&quot;). </li><li> Die Objektträger in der Bildschirmpräsentation Rack und tauchen Sie ein in die SDS-Lösung 15-20 Mal sehr heftig, um die Salze auf den Folien zu entfernen vorhybridisiert werden. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen die Dias aus dem Rack und legen Sie sie in einem Coplin Gefäß mit Pre-Hybridisierungspuffer (5x SSC, 0,1% SDS, 1% BSA), die wurde auf 43 ° C vorgewärmten Inkubation bei 43 ° C für mindestens eine Stunde. </li></ol> Teil 6: Pre-Hybridisierung <ol><li> Set fünf schieben Abwasch mit jeweils millipure dH 2 O gefüllt, und ein Coplin Glas mit molekularen grade Isopropanol gefüllt. Legen Sie die Folien in einer Bildschirmpräsentation Rack-und Prozess nacheinander durch fünf Gerichte, die von dunking 20-mal jeweils. </li><li> Die Objektträger zwei auf einmal aus dem fünften Wasser waschen und Dip 5-6 mal in der Isopropanol und sofort in Folien in die Folie Mikrofuge (Chipmate Tischgerät, 2 Positionen) und Spin 1 Minute, um zu trocknen. </li><li> Saubere Objektträger mit Druckluft durch ein 0,22 um Filterpatrone gefiltert und legen Sie sie mit dem Strichcode nach oben in einem Genomic Solutions Hybridisierung Kammer. </li><li> Saubere LifterSlips ™ mit gefilterter Luft und positionieren sie auf dem Objektträger mit den weißen Streifen nach unten. Verwenden Sie eine gelbe Pipettenspitze vorsichtig ausrichten Heber slip on the slide (Washing LifterSlips ™ zunächst in 70% Ethanol ist optional. Wir haben es nicht für erforderlich.) </li></ol> Teil 7: Hybridisierung Sollte sich in der Dunkelheit oder schlechten Lichtverhältnissen durchgeführt werden. <ol><li> Für jede Folie hybridisiert werden, berechnen die Höhe der Cy-5 und Cy-3 markierten cDNA-bis 50-75pmol der einzelnen Zielgruppen zu geben. Kombinieren Sie diese Beträge in einem einzigen Rohr und trocken in einem Vakuum-Exsikkator mit der Hitze Einstellung bei 37-45 ° C. Vermeiden Trocknung vollständig aus! </li><li> Resuspendieren der getrockneten Proben in 60 ml Hybridisierungspuffer (frisch zubereitet an diesem Tag) und kurz vortexen. </li><li> Inkubieren Sie die resuspendiert cDNAs für 5 Minuten in ein 95 ° C-Bad und dann schnell Mikrozentrifuge für 30 Sekunden. </li><li> Laden Sie das gesamte resuspendiert Sonde Volumen langsam Pipettieren bei der Dia-LifterSlip ™ Kreuzung an der Unterseite (Strichcode) Ende der Rutsche. Die Folie wird mittels Kapillarwirkung zu laden. (Einige ziehen es vor Pipette auf den Objektträger und dann vorsichtig überlagern die LifterSlip ™ ist dies ein one shot-Verfahren, da, wenn Sie Blasen bekommt man nicht bewegen kann der LifterSlip ™ nach der Platzierung, die zu verschmieren Artefakte Spot kann) </li><li> Legen Sie 20ul von 100 mM DTT in jedes gut Feuchtigkeit an den Enden der Kammer befindet. </li><li> Legen Sie die oben an der Kammer und ziehen Sie die cam Schrauben. Decken Sie die Kammer mit Aluminiumfolie und tauchen Sie ein in eine 48 ° C Wasserbad für 12-18 Stunden unter leichtem Rühren bei 50-60 Umdrehungen pro Minute. </li></ol> Teil 8: Post-Hybridisierung Wäscht Alle Wäschen sollte in der Dunkelheit oder schlechten Lichtverhältnissen durchgeführt werden. Folien sollte nie erlaubt, bis zum letzten Schritt zu trocknen. <ol><li> Richten Sie einen Coplin Glas mit Wash Solution # 1 @ 53 ° C und vier Schlitten Abwasch mit 250 ml jeder der folgenden gefüllt: 1) WAsche Lösung # 1 @ 53 ° C, 2) Waschlösung # 2 @ Raumtemperatur, 3 &amp; 4) zwei Schalen mit Waschlösung # 3 @ Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Folien aus der Hybridisierung Kammern und legen Sie sie zwei auf einmal in die Coplin Glas. Lassen Sie für 30 Sekunden, dann heben Sie die Folie langsam und der Heber Schlupf wird in das Glas zu bleiben. Objektträger in die Dia-Rack und sofort tauchen Sie ein in Waschlösung # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, Vorwärmung auf 43 ° C). Wiederholen, bis alle LifterSlips entfernt werden und alle Folien, gewaschen werden in der Waschlösung Nr. 1 Schüssel. Tauchen Sie ein Rack nach oben und unten 10 mal kräftig. </li><li> Legen Gericht in 53 ° C in Luft Schüttler Schütteln bei 50-100 rpm für 10 Minuten. </li><li> Transfer-Rack-Lösung # 2 (0,1 × SSC, 0,2% SDS), stürzen 10 Mal, und bei Raumtemperatur inkubieren Wash, langsamen Schütteln für 10 Minuten. </li><li> Dip-Rack 15-mal in der ersten Waschlösung # 3 (0,1 X SSC) zu entfernen, restliche SDS Übertrag aus der Waschlösung # 2. Legen Zahnstange in der zweiten Waschlösung Nr. 3 Schüssel stürzen 10 Mal, und dann langsam Schütteln für 10 Minuten. </li><li> Die Objektträger in 50 mL Falcon Röhrchen mit und Spin @ 1.500 Umdrehungen pro Minute in der Zentrifuge mit Ausschwingrotor ausgestattet. Entfernen Sie Folien geprüft Container Licht, verwenden wir einen anderen Falcon-Röhrchen mit Alufolie abgedeckt, und die Luft aus der Röhre mit Stickstoffgas, fest verschließen (geht auf die Oxidation des Cy-Farbstoffe, insbesondere Cy-5 im Sommer, wenn die Ozonwerte am höchsten sind ). Dias können für ein paar Stunden vor dem Scannen in den Stickstoff gespült Rohre gelagert werden, aber das beste Signal Ergebnisse werden erzielt, wenn Scan unmittelbar nach dem Waschen fertig ist. </li></ol> Teil 9: Datenerhebung und statistische Analyse <ol><li> Scan Bilddaten auf einem PerkinElmer ScanArray gesammelt. Wir verwenden eine 10-Mikron-Scan-Einstellung und Balance Cy3 und Cy5-Signale über die Line-Methode zur Anpassung gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> TIF-Dateien sind gerasterten und Rohsignal Daten gesammelt und mit ImaGene Version 7,5 (BioDiscovery, Inc., El Segundo, CA) filtriert </li><li> Daten Normalisierung und Auswertung, um statistisch gültige differentiell exprimierten Arten zu bestimmen, ist mit BRB Array-Tools Ver getan. 3.7. </li><li> Pattern-Analyse zur Bestimmung der koordinativ exprimierten Genen zu erleichtern ist mit Genexpressionsmuster Analysis Software (GEPAS) Ver getan. 3.1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1182/Figure1_WWLorenz-1.png" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Beispiel PtGen2 Array verarbeitet Verwendung dieses Protokolls in l. <img src="/files/ftp_upload/1182/Figure2_WWLorenz.png" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Beispiel PtGen2 Array verarbeitet unter Verwendung von Standard-Hybridisierung und Waschen Protokolle.

<ol>
	<li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+(Pinus+taeda)+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries.">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li><li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> unpublished data. , .</li><li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis.">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li><li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESTs,+cDNA+microarrays,+and+gene+expression+profiling:+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development.">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li><li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gene+Expression+changes+in+Pinus+species+using+a+Loblolly+pine+cDNA+microarray.">Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray.</a> IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).</li><li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+during+P.+pinaster+embryo+development.">Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development.</a> 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).</li></ol>

PtGen2 ist eine neu entwickelte, individuelle cDNA-Microarray, die entworfen, um in erster Linie durch die loblolly Kiefer Forschung verwendet werden sollte. Vorläufige Ergebnisse generiert bislang haben das Array gezeigt, dass ein wertvolles Hilfsmittel bei der Bewertung der Transkriptions-Ereignisse, die in Reaktion auf Trockenstress auftreten, sowie bei der Überwachung der Veränderungen, die während der Embryonalentwicklung entstehen in Pinien, Pinus pinaster 5,6 Wir haben auch kürzlich gezei...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pre-hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt&#x2019;s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #1</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #2</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC, 0.2% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #3</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC</td>
</tr>
<tr>
<td>Isopropyl Alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>34959-2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352196</td>
<td>Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation</td>
</tr>
<tr>
<td>Coplin Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Dish & Rack </td>
<td>Other</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
<td>Other</td>
<td>Sigma&#x2122;</td>
<td>A-9418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PolyA RNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>POLYA.GF</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling </td>
<td>Kit</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>L1014-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Turbo DNase</td>
<td>Kit</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1907</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA25001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-3 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA23001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LifterSlips&trade;</td>
<td>Other</td>
<td>Erie Scientific Company&#x2122; </td>
<td>25X601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HybChambers</td>
<td>Equipment</td>
<td>GeneMachines</td>
<td>JHYB200003</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

processing the loblolly pine ptgen2 cdna microarray

PtGen2 ist ein 26.496-Funktion cDNA-Microarray mit verstärkten loblolly Kiefer ESTs. Das Array wird in unserem Labor für die Nutzung durch Forscher studieren die Genexpression in Kiefern und andere Nadelhölzer hergestellt. PtGen2 wurde als Ergebnis unserer Bemühungen zur Entdeckung von Genen in loblolly Kiefer entwickelt und wird von Sequenzen in erster Linie aus Wurzelgewebe identifiziert umfasst, sondern auch aus Nadel-und Stammzellen. 1,2 PtGen2 durch Kreuzungen verschiedener Cy-Farbstoff markiert Nadelbaum Ziel cDNAs wurde getestet , wobei sowohl verstärkt und nicht verstärkt indirekte Markierung Methoden und auch mit einer Reihe von Hybridisierung und Waschen Bedingungen getestet. Dieses Video konzentriert sich auf die Handhabung und Verarbeitung von Folien vor und nach dem Pre-Hybridisierung, sowie nach der Hybridisierung mit einigen Modifikationen der Verfahren entwickelt zuvor. 3,4 Ebenfalls enthalten in Textform nur, sind die Protokolle für die Erzeugung, Kennzeichnung und Reinigung von Ziel-cDNA s, sowie Informationen über Software für Downstream-Verarbeitung verwendet. PtGen2 ist mit einem proprietären Druckpuffer, dass hohe Konzentrationen von Salz, die nur schwer vollständig zu entfernen Dose enthält gedruckt. Die Folien werden zunächst in einem warmen SDS-Lösung vor pre-Hybridisierung gewaschen. Nach einer Vorauswahl Hybridisierung werden die Objektträger kräftig in mehrere Änderungen des Wasser gewaschen, um das Entfernen der restlichen Salze abzuschließen. LifterSlips ™ werden dann gereinigt und positioniert auf den Folien und markierte cDNA wird vorsichtig auf dem Mikroarray durch Kapillarwirkung, die für eine gleichmäßige Verteilung der Probe auf den Objektträger bietet geladen, und verringert die Chance von bubble Statuten. Hybridisierung von Zielen auf das Array wird bei 48 ° C bei hoher Luftfeuchtigkeit durchgeführt. Nach der Hybridisierung wird eine Reihe von Standard-Wäschen bei 53 ° C durchgeführt und Raumtemperatur für längere Zeit. Verarbeitung PtGen2 Dias mit dieser Technik reduziert Salz und SDS-derived Artefakte oft gesehen, wenn das Array weniger streng verarbeitet wird. Hybridisierende Ziele aus verschiedenen Koniferen RNA Quellen stammen, ergab diese Verarbeitung Protokoll weniger Artefakte, reduziert Hintergrund, und sofern eine bessere Konsistenz zwischen den verschiedenen experimentellen Gruppen von Arrays.

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Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Die cDNA-Microarray PtGen2 war für die Genexpression Studien in loblolly Kiefer entwickelt,<em&gt; P. taeda</em&gt; Und andere Nadelbaumarten. Hier zeigen wir Pre-und Post-Hybridisierung Bearbeitung und Reinigung Techniken, die mit diesem Array verwendet werden, um eine bessere Konsistenz, verringert Artefakte und unteren Hintergründe liefern kann.

Die Verarbeitung der Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

processing-the-loblolly-pine-ptgen2-cdna-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K Aufrufe.  University of Georgia (UGA). Die cDNA-Microarray PtGen2 war für die Genexpression Studien in loblolly Kiefer entwickelt, P. taeda Und andere Nadelbaumarten. Hier zeigen wir Pre-und Post-Hybridisierung Bearbeitung und Reinigung Techniken, die mit diesem Array verwendet werden, um eine bessere Konsistenz, verringert Artefakte und unteren Hintergründe liefern kann.

Serie: Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae Ascosporen Produktion und Sammlung für Microarray-Experimente.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Forschung

Biologie

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

Die Mikrofluidik-Probe: Betrieb und Nutzung für lokalisierte Oberflächenbearbeitung

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high concentrations of phenolic compounds and polysaccharides that interfere with RNA purification. Isolation of high-quality RNA from these species requires rigorous tissue collection procedures in the field and the employment of an RNA isolation protocol comprised of multiple organic extraction steps in order to isolate RNA of sufficient quality for microarray and other genomic analyses. The isolation of high-quality RNA from field-collected loblolly pine samples can be challenging, but several modifications to standard tissue and RNA isolation procedures greatly improve results. The extent of general RNA degradation increases if samples are not properly collected and transported from the field, especially during large-scale harvests. Total RNA yields can be increased significantly by pulverizing samples in a liquid nitrogen freezer mill prior to RNA isolation, especially when samples come from woody tissues. This is primarily due to the presence of oxidizing agents, such as phenolic compounds, and polysaccharides that are both present at high levels in extracts from the woody tissues of most conifer species. If not removed, these contaminants can carry over leading to problems, such as RNA degradation, that result in low yields and a poor quality RNA sample. Carryover of phenolic compounds, as well as polysaccharides, can also reduce or even completely eliminate the activity of reverse transcriptase or other polymerases commonly used for cDNA synthesis. In particular, RNA destined to be used as template for double-stranded cDNA synthesis in the generation of cDNA libraries, single-stranded cDNA synthesis for PCR or qPCR's, or for the synthesis of microarray target materials must be of the highest quality if researchers expect to obtain optimal results. RNA isolation techniques commonly employed for many other plant species are often insufficient in their ability to remove these contaminants from conifer samples and thus do not yield total RNA samples suitable for downstream manipulations. In this video we demonstrate methods for field collection of conifer tissues, beginning with the felling of a forty year-old tree, to the harvesting of phloem, secondary xylem, and reaction wood xylem. We also demonstrate an RNA isolation protocol that has consistently yielded high-quality RNA for subsequent enzymatic manipulations.

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Many plant tissues, including phloem and xylem from loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high levels of phenolics and polysaccharides that interfere with RNA purification. This presentation discusses techniques for the harvest of field-grown tissues and isolation of RNA of sufficient quality for microarrays and other genomic analyses.

Ein verbessertes Verfahren zur RNA-Isolierung aus Loblolly Pine ( P. taeda L.) und andere Nadelbaumarten

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

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In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

Performing Benutzerdefinierte MicroRNA Microarray-Experimenten

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been studied substantially using traditional two-dimensional techniques. Recent advancements in X-ray imaging technology via desktop micro-computed tomography (&#181;CT) and synchrotron radiation micro-computed tomography (SR&#181;CT) have allowed for the acquisition of high-resolution three-dimensional (3D) scans of a larger field of view (FOV) than other 3D imaging techniques (e.g., SEM) providing a more complete picture of microscopic structures within human cortical bone. The specimen should be accurately centered within the FOV, however, to limit the appearance of streak artifacts known to impact data analysis. Previous studies have reported procurement of irregularly shaped rectilinear bone blocks that result in imaging artifacts due to uneven edges or image truncation. We have applied a geological sampling protocol (coring) to procure consistently sized cortical bone core specimens for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This coring method is efficient and minimally destructive to tissue. It creates uniform cylindrical samples that decrease imaging artifacts by nature of being isometric during rotation and providing a uniform path length for X-ray beams throughout scanning. Image processing of X-ray tomographic data of cored and irregularly shaped samples confirms the potential of the technique to improve visualization and analysis of cortical bone microarchitecture. A goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable method for the extraction of cortical bone cores that is adaptable for various types of high-resolution bone imaging experiments. An overarching goal of the work is to create a standardized cortical bone procurement for SR&#181;CT that is affordable, consistent, and straightforward. This procedure may further be adapted by researchers in related fields who commonly evaluate hard composite materials such as in biological anthropology, geosciences, or material sciences.

We employed a geological (coring) sampling protocol to procure cortical bone specimens of uniform size for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This method is minimally destructive, efficient, results in cylindrical specimens that minimize imaging artifacts from irregular sample shapes and improves microarchitectural visualization and analysis.

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Aufklärung der Glykanstruktur und des Vorkommens mittels Microarray-Polymer-Profiling

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

Autor im Rampenlicht: MAPP-Protokoll – Weiterentwicklung der Glykananalyse 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

Microarray-Polymer-Profiling (MAPP) für die Hochdurchsatz-Glykananalyse

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...

Methods Article

Die Verarbeitung der Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray