Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation unterstützt.

I. Entwurf eines Yeast Expression System für Typ III Effektoren Kalibrieren eines Hefe-System geeignet für die Expression des Typ III Effektor (s) von Interesse ist eine wichtige Aufgabe und kann einige trial and error erfordern. Faktoren von großer Bedeutung, dass betrachtet und optimiert werden sollte bei der Gestaltung eines solchen Systems sind: 1) den Promotor die Expression des Effektors (s), 2) die Kopienzahl der Effektor-Gen, 3) die Epitop-Tag verwendet, um Protein-Expression zu überprüfen und 4) den Hefestamm. 1) Promoter Da bakterielle Typ III Effektoren können giftig sein, um Hefezellen, sollte ein induzierbarer Promotor verwendet werden, um ihren Ausdruck zu kontrollieren. Die GAL1 Promotor ist üblicherweise für diesen Zweck verwendet und seine Aktivität wird durch die C-Quelle im Nährmedium geregelt: Es wird von Glucose reprimiert und induziert durch Galaktose. Allerdings wurde dieser Promotor als leicht undicht unter Unterdrückung Bedingungen, die sich in unerwünschten Toxizität berichtet. Wenn ein ähnliches Problem aufgetreten ist, ist es ratsam, die Kopienzahl der Effektor-Gen zu minimieren, wie unten beschrieben, oder alternative Promotoren, wie die MET3 oder CUP1 Promotoren 1 zu verwenden. Hier beschreiben wir Verfahren zur Expression von Effektor-Proteine ​​aus einer Galaktose-induzierbarer Promotor. 2) Gene copy-number Ein weiterer Parameter auf die Höhe der Proteinexpression ist die Anzahl der Kopien der Effektor-Gen in der Zelle. Hohe Expression erreicht werden, wenn der Effektor-Gen durch durchgeführt ist ein 2-Mikron-Plasmid (40-60 Kopien pro Zelle). Intermediate Ausdruck wird mit einem Zentromer-haltigen Plasmid (1-3 Kopien pro Zelle), während niedrige Ausdruck ist erreicht, wenn der Effektor-Gen in die Hefe-Genoms durch homologe Rekombination integriert erhalten. Durch die Kombination einer Zentromer-haltigen Vektor und die GAL1 Promotor haben wir erfolgreich ca. 50 Effektoren des Pflanzenpathogene Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria und Pseudomonas syringae pv. ausgedrückt. Tomaten auf einem Niveau nachweisbar durch Immunoblot-Analyse und mit vernachlässigbarer Leckstrom bei unterdrücken Bedingungen (Salomon und Sessa , unveröffentlicht). 3) Epitop-Tag Wenn Antikörper gegen den Effektor von Interesse nicht verfügbar sind, ist ein Epitop auf die Effektor-Protein fusioniert, um seinen Ausdruck durch Immunoblot überwachen. Häufig verwendete Tags sind Myc, Hämagglutinin (HA) oder Flag, dem zuverlässigen kommerziellen Antikörper verfügbar sind. Wir empfehlen die Verwendung nur einer Kopie der Tag, um unerwünschte schädliche Wirkungen auf die Struktur und Aktivität der Effektor-Proteine ​​zu minimieren. 4) Der Hefestamm Eine grundlegende Anforderung für den Hefestamm, um die Expression verwendet werden soll Auxotrophie der Selektionsmarker des Expressionsvektors. Es ist wichtig zu beachten, dass verschiedene Hefestämme können unterschiedliche Empfindlichkeiten, um die Expression bestimmter Effektoren anzuzeigen. Zum Beispiel beobachten wir, dass die BY4741 und W303-Stämme unterschiedliche Empfindlichkeiten zu mehreren Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria Effektoren (Salomon und Sessa, unveröffentlicht) haben. Daher ist es vorzuziehen, den Effektor (s) von Interesse in verschiedenen Hefestämme zu testen. II. Vorbereitung der Hefe Medien Für das Wachstum von Hefe-Stämme, die keine beliebigen Vektors, verwenden YPD (10 g / L Hefeextrakt, 20 g / L Pepton und 2% [w / v] Glukose) als Wachstumsmedium. Für feste Medien, fügen Sie 2% [w / v] Agar, um die Lösung (wenn das feste Medium ist sehr weich, fügen 0,05% [v / v] aus einer 5 N NaOH-Stammlösung auf das Medium vor dem Autoklavieren). Wir empfehlen der Herstellung des Mediums ohne Glukose in 90% der endgültigen Volumen und Autoklavieren. Kurz vor der Verwendung, füllen Sie die Lautstärke auf 100% mit einem Filter-sterilisiert 20% [w / v] Glucose-Lösung (halten 20% Glucose-Lösung bei 4 ° C zur Vermeidung von Kontaminationen). Für das Wachstum von Hefe-Stämme, die einen Vektor, der Prototrophie bietet einen Selektionsmarker (Leucin, Uracil, Histidin oder Tryptophan), synthetische Drop-out-Medium ohne Leucin, Uracil, Histidin und Tryptophan (6,7 g / L Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren , 1,4 g / L Hefe synthetischen Drop-out-Medium zu ergänzen) und mit 2% [w / v] Glucose oder 2% [w / v] Galaktose und 1% [w / v] Raffinose. Für feste Medien, fügen Sie 2% [w / v] Agar, um die Lösung. Wir empfehlen der Herstellung des Mediums in 90% der endgültigen Volumen und Autoklavieren. Kurz vor der Verwendung, füllen Sie die Lautstärke auf 100% mit einem Filter-sterilisiert 20% Glukose-Lösung oder ein Filter-sterilisiert 20% Galaktose + 10% Raffinose-Lösung, je nach der gewünschten Kohlenstoffquelle (halten 20% Glucose und 20% Galaktose + 10% Raffinose Lösungen bei 4 ° C zu verhindern Kontamination). Abhängig von der Selektionsmarker des Ausdrucks vector, fügen Sie die anderen Aminosäuren oder Uracil vor Gebrauch (10 ml / L von einem 1 g/100 ml Leucin Lager, 10 ml / L von einem 200 mg/100 ml Uracil Lager, 2 ml / L von einem 1 g/100 ml Histidin Lager oder 2 ml / L von einem 1 g/100 ml Tryptophan Lager). Bei der Vorbereitung Leucin und Uracil Aktien, sterilisieren durch Autoklavieren und halten bei Raumtemperatur. Bei der Vorbereitung Histidin und Tryptophan Aktien, sterilisieren durch Filterung, wickeln Sie die Flasche mit Aluminiumfolie vor Licht zu schützen, und halten bei 4 ° C. In den unten beschriebenen Verfahren, synthetische Drop-out-Medium mit Leucin ergänzt wird Uracil, Histidin und Tryptophan als synthetische Vollmedium bezeichnet. Solid-Medien Platten können gespeichert werden bis zu zwei Monate bei 4 ° C. Vor dem Gebrauch trocknen die Platten für 20 min in einem sterilen Laminarströmungshaube bei Raumtemperatur. III. Hefe-Transformation <ol><li> Vor Beginn der Hefetransformation Verfahren, bereiten Sie die folgenden drei Lösungen: eine 50% [w / v] Polyethylenglykol (PEG) 3350-Lösung, eine 1 M LiAc pH = 8,0, und ein TE-Lösung (100 mM Tris pH = 6.85 und 10 mM EDTA pH = 8,0). Filter-Sterilisation der Lösungen und halten bei 4 ° C. </li><li> Mit einem langen hölzernen Schaft oder einer sterilen Impföse, wählen Sie eine Hefekolonie (1-2 mm Durchmesser) aus einer frischen Platte und beimpfen 3 ml YPD in ein 15 ml Polypropylen-Röhrchen. Vortex kurz. Legen Sie die Kultur Rohr in einer Rolle und Inkubieren bei 30 ° C mit konstanter Rotation über Nacht. </li><li> Am Morgen, entfernen Sie die Kultur von der Walze und Zentrifuge bei 800 g für 5 min bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation vollständig zu entfernen Überstand. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 1 ml Resuspensionspuffer (10% [v / v] TE-Lösung, 10% [v / v] 1 M LiAc Lösung) und vortexen. </li><li> Für jedes Plasmid transformiert werden und eine zusätzliche Kontrolle Transformation, Übertragung 100 ul der Zellsuspension auf eine Mikroröhrchen. </li><li> Zu jedem Röhrchen werden 5 ul der Einzelstrang Lachssperma-DNA (10 mg / ml) und 250-500 ng Plasmid-DNA transformiert (außer für das Steuerrohr) werden. </li><li> Sorgfältig in jedes Röhrchen 650 ul der Transformation-Lösung (10% [v / v] TE-Lösung, 10% [v / v] 1 M LiAc Lösung, 80% [v / v] 50% [w / v] PEG-Lösung add ) und Wirbel. </li><li> Inkubation bei 30 ° C für 30 min auf einer Walze. </li><li> Entfernen Sie die Schläuche aus dem Shaker, fügen Sie 70 ul DMSO und mischen durch Invertieren der Röhrchen 10-15 mal (nicht vortexen, um die Störung der Zellen). </li><li> Legen Sie die Röhrchen in einem 42 ° C vorgewärmten Wasserbad inkubieren 15 min. </li><li> Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Wasserbad und sofort legen sie auf Eis für 2 min. </li><li> Nachdem die Rohre abgekühlt sind, Zentrifuge sie bei 800 g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Nehmen Sie die Rohre aus dem Mikrozentrifuge und entfernen Sie vorsichtig die viskose Überstand mit einer Pipette. </li><li> Zellpellet jeder Röhre in 150 ul sterilem doppelt destilliertem Wasser (DDW), und die Ausbreitung der Zellsuspension auf einem synthetischen Vollmedium Platte mit 2% Glucose als Kohlenstoffquelle und ohne die Aminosäure-oder Nukleotid an, die das Plasmid bietet Prototrophie. </li><li> Verlassen Sie die Platten offen für 2 min und es ihnen ermöglichen, in einer Sterilbank trocknen. Legen Sie die Platten in einem 30 ° C Inkubator für 2-3 Tage. </li><li> Sobald Kolonien (1-2 mm Durchmesser) auf den Platten erschienen, nehmen rund 10 einzelne Kolonien von jeder Transformation und Übertragung auf einen frischen Teller. Beim Übertragen der Kolonien, um 2 cm x 2 cm Patches für das Wachstum einer großen Menge von Hefezellen zu ermöglichen. Die Inkubation in einem Brutschrank bei 30 ° C für zwei Tage. </li><li> Wenn die Hefe Patches sind gewachsen, entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und versiegelt sie mit Parafilm. Die Platten können bei 4 ° C gelagert werden Transfer-Kolonien zu einem neuen Platte alle 10-14 Tage. </li></ol> IV. Vorbereiten einer Hefe-Proteinextrakt zu Effektor-Expression durch Immunoblot Überprüfen <ol><li> Pick a Hefekolonie (1-2 mm Durchmesser) aus einer frischen Platte in ein 15 ml Polypropylen-Röhrchen mit 3 ml des entsprechenden synthetischen Vollmedium mit 2% Glucose als Kohlenstoffquelle ergänzt und ohne die Aminosäure-oder Nukleotid an, die das Plasmid der Wahl bietet Prototrophie. Legen Sie die Kultur Rohr in einer Rolle beimpft und über Nacht bei 30 ° C. </li><li> In den folgenden Tag, entfernen Sie die Kultur von der Walze und Zentrifuge bei 800 g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Röhrchen aus der Zentrifuge und den Überstand verwerfen. </li><li> Zellpellet in 3 ml sterile DDW und vortexen. </li><li> Centrifuge wieder Überstand verwerfen und die Zellen in 3 ml sterile DDW. </li><li> Transfer-200 ul der Zellsuspension auf ein neues 15 ml Röhrchen mit 3 ml synthetischen Vollmedium mit 2% Galactose und 1% Raffinose als Kohlenstoffquelle ergänzt, und ohne die Aminosäure-oder Nukleotid an, die das Plasmid der Wahl bietet Prototrophie.Durch Vortexen mischen, in eine Rolle, beimpft und über Nacht bei 30 ° C. </li><li> In den folgenden Morgen, je 1 ml der Kultur (oder mehr für low density Kulturen), um eine Mikroröhrchen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 800 g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Von hier an, in einem Abzug arbeiten, um zu vermeiden Atmen β-Mercaptoethanol giftige Dämpfe. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und Zellpellet in 100 ul eiskaltem Lyse-Lösung (4% [v / v] 5 N NaOH, 0,5% [v / v] β-Mercaptoethanol). Gründlich mischen durch Vortexen und inkubieren auf Eis für 30 min. </li><li> Während der Inkubation bestimmt das Volumen der HCl (6 N) für Titrierung 100 ul Lysepuffer auf pH 9-10 erforderlich. Zu diesem Zweck Platz 10 Mikroröhrchen in einem Rack und Transfer 100 ul der Lysepuffer in jedem von ihnen. Add verschiedenen Volumina (1-10 ul) HCl (6 N) in jedes Röhrchen und vortexen. Nehmen Sie eine Probe und den pH-Wert der Lösung mit einem pH-Indikator Streifen. </li><li> Am Ende der Inkubationszeit, fügen Sie die HCl Volumen in den vorherigen Schritt, um das Lysat und mischen durch Vortexen (für eine bessere Genauigkeit, legen Sie die HCl-Lösung auf der Seite des Rohres, ohne Einlegen der Spitze in das Lysat) bestimmt. </li><li> Add 50 ul 3x Probenpuffer (30% [v / v] Glycerin, 15% [v / v] β-Mercaptoethanol, 37,5% [v / v] 500 mM Tris-HCl pH = 6,8, 0,15% [w / v ] Natriumdodecylsulfat [SDS] und einige Körner Bromphenolblau) zum Lysat und mischen durch Vortexen (wenn die Lösung färbt sich gelb, bedeutet dies, dass der pH-Wert zu niedrig ist, und ein paar Mikroliter Lyse-Lösung sollte, bis die Lösung hinzugefügt werden wird blau). </li><li> Kochen Sie die Lysat-Lösung für 5 min auf einem Heizblock nach Punktion ein Loch in den Deckel des Mikroröhrchen mit einer Nadel. </li><li> Entfernen Sie die Mikroröhrchen aus dem Heizblock und lassen Sie die Lösung für 2 min bei Raumtemperatur abkühlen lassen. </li><li> Vortex Lysat-Lösung und dann drehen Sie es nach unten für 10 sec. Last 30 ul auf eine SDS-PAGE-Gel für Immunoblot-Analyse. </li></ol> V. Spotting Assay zur Erkennung Effektor-induzierte Wachstumshemmung Phenotypes <ol><li> Von einem frischen Teller holen einen Hefe-Kolonie (1-2 mm Durchmesser), welches das Expressionsplasmid von Interesse und impfen, in ein 15 ml Polypropylen-Röhrchen, 3 ml synthetischen Vollmedium mit 2% Glucose als Kohlenstoffquelle ergänzt und ohne die Aminosäure -oder Nukleotid, auf die das Expressionsplasmid bietet Prototrophie. Wiederholen Sie diesen Vorgang für ein Steuerelement Hefe-Stamm, der ein leeres Plasmid. Legen Sie die Kulturröhrchen in einer Rolle beimpft und über Nacht bei 30 ° C mit konstanter Rotation. </li><li> In den folgenden Tag, entfernen Sie die Kulturen von der Walze und Zentrifuge bei 800 g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Röhrchen aus der Zentrifuge und den Überstand verwerfen. </li><li> Zellpellet in 3 ml sterile DDW und vortexen. </li><li> Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und die Zellen in 3 ml sterile DDW. </li><li> Zur Bestimmung der optischen Dichte (OD), Transfer 100 ul jeder Kultur eine Mikroröhrchen mit 900 ul DDW und vortexen. Gießen Sie den Inhalt der Rohre in einem Kunststoff-Küvette und Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 600 nm (Verwendung als Referenz eine Küvette mit 1 ml DDW gefüllt). Berechnen Sie die OD 600 der ursprünglichen Kulturen durch Multiplikation des OD 600 der Kulturen in der Küvette durch einen Verdünnungsfaktor von 10. </li><li> Als nächstes auf der Grundlage der OD 600 der ursprünglichen Kulturen vorzubereiten Zellsuspensionen (1 ml) mit einer OD 600 = 1,0 in sterile Röhrchen. </li><li> Durch die Verwendung von 3 sterile Röhrchen mit 900 ul sterilem DDW gefüllt, bereiten drei 10-fache serielle Verdünnungen (OD 600 = 0,1, 0,01 und 0,001) von jeder Zellsuspension (OD 600 = 1,0) in den vorherigen Schritt vorbereitet. </li><li> Bereiten Sie zwei Platten mit synthetischen Vollmedium ohne die Aminosäure-oder Nukleotid an, die das Plasmid der Wahl bietet Prototrophie. Das Medium einer Platte sollte mit 2% Glucose und die der anderen Platte mit 2% Galaktose und 1% Raffinose ergänzt werden. Trocknen Sie die Platten in einem sterilen Laminarströmungshaube bei Raumtemperatur für 20 min und legen Sie sie auf einem Raster. </li><li> Für jede Kultur, spot 10 ul aus den vier Verdünnungen in einer Reihe auf beiden unterdrücken und induzieren Medien. </li><li> Nach Spotting, lassen Sie die Platten offen in der Motorhaube für einige Minuten. Wenn die Flecken trocken sind, decken sie die Teller und legen Sie sie in einem 30 ° C Inkubator für 2-3 Tage. </li><li> Nach der Inkubation, nehmen Sie die Platten und analysiert das Wachstum der Hefe. Zunächst bestätigen, dass die Zelldichte ähnlich auf der Platte enthalten, unterdrücken Medium. Dann vergleichen Sie das Wachstum der Kultur zum Ausdruck der Effektor-Protein von Interesse mit der Kultur tragen einen leeren Vektor auf der Platte mit Induktion Medium. Hinweis: Effektoren können zelluläre Prozesse, die nicht geschwindigkeitsbestimmend zu Hefewachstum unter Standard-Labor Wachstumsbedingungen Ziel.Um die Identifizierung von Wachstumshemmung Phänotypen für solche Effektoren können induzierenden Medien mit Verbindungen, die Hefe Zellfunktionen verändert ergänzt werden, wodurch ihre Empfindlichkeit gegenüber Effektoren. Eine Liste der Chemikalien, die möglicherweise in diesem Verfahren integriert werden können, um Parsons et al beziehen. (2004) 2. </li></ol> VI. Repräsentative Ergebnisse Ein Vertreter Hefe Spotting-Assay und den Nachweis von Wachstumshemmung Phänotypen durch die Expression von Typ III Effektoren induziert sind in Abb.. 1. In diesem Experiment wurden die Typ-III-Effektoren AvrPto, HopAA1-1 und AvrE1 der Gram-negativen phytopathogenen Bakterium Pseudomonas syringae pv.. Tomate (Pst) aus dem Zentromer-haltigen Plasmid pGML10 in den Hefestamm BY4741 ausgedrückt und auf ihre Fähigkeit zu hemmen das Wachstum der Hefe. Individuelle Hefekulturen Ausdruck Pst Typ III Effektoren unter der Kontrolle des Galaktose induzierbare GAL1 Promoter oder mit einem leeren Vektor wurden seriell verdünnt und ausplattiert auf unterdrücken (Glukose) oder induzieren (Galaktose) Medien (Abb. 1). Auf unterdrücken Medium zeigte Hefestämme tragen Plasmide für die Expression von AvrPto und HopAA1-1 ein ähnliches Wachstum wie die Kontrollstamm mit einer leeren Vektor. Doch auf dem gleichen Medium, Hefe Durchführung AvrE1 ein leicht geringeres Wachstum angezeigt wird, wahrscheinlich zu einem gewissen Grad der Leckage des GAL1 Promoter und die hohe zytotoxische Wirkung von AvrE1 verwandt. In induzierenden Bedingungen, verursacht Ausdruck der AvrE1 Effektorzellen eine drastische Wachstumshemmung Phänotyp durch das Fehlen von Kolonien in einer Verdünnung wider. Wie bereits von Munkvold et al. 3, Ausdruck HopAA1-1 auch in schweren Hemmung des Wachstums führte, beobachtet, während AvrPto zeigten keine Wirkung. <img src="/files/ftp_upload/1865/1865fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Hefe Wachstumshemmung durch Expression des Pseudomonas syringae pv.. Tomate verursacht (Pst) Typ III Effektoren AvrE1 und HopAA1-1. Hefestämme (BY4741), die das Plasmid pGML10, entweder leer oder tragen GAL1-driven-Kassetten für Galaktose-induzierbare Expression von AvrPto , HopAA1-1 oder AvrE1, wurden über Nacht in synthetischen Vollmedium mit Glucose (2%) als Kohlenstoffquelle ergänzt gewachsen, und ohne Leucin. Die Kulturen wurden gewaschen, normiert auf OD 600 = 1,0 und seriellen 10-fach Verdünnungen auf synthetische komplette festen Medien fehlt Leucin und Glucose (2%) oder Galaktose (2%) und Raffinose (1%) wurden gesichtet. Die Fotografien wurden nach 2 und 3 Tagen Wachstum bei 30 ° C für die Hefe wächst in Glukose und Galaktose Medien, bzw. übernommen.

<ol>
	<li>Siggers, K. A., Lesser, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae:+a+versatile+model+system+for+the+identification+and+characterization+of+bacterial+virulence+proteins.">The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins.</a> Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).</li><li>Parsons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways.">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li><li>Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+type+III+secretion+system+effector+repertoire+reveals+several+effectors+that+are+deleterious+when+expressed+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).</li><li>Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+study+bacterial+effectors.">Yeast as a tool to study bacterial effectors.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).</li><li>Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+yeast+screen+to+identify+pathogenic+bacterial+proteins.">A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins.</a> PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).</li><li>Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+role+of+the+CopN+protein+in+Chlamydia+pneumoniae+intracellular+growth.">The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth.</a> Nature. 456, 112-115 (2008).</li></ol>

In diesem Vortrag dargestellt wir, wie die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als einem heterologen System für die Expression des Typ III bakteriellen Effektor-Proteine ​​und wie Effektor-induzierte Wachstumshemmung Phänotypen identifizieren können. Wichtig ist, dass diese Phänotypen in genetischen Screens genutzt werden, um Unterdrücker der negativen Auswirkungen von Effektoren auf das Wachstum der Hefe zu identifizieren. Suppressors darstellen können entweder direkte Ziele des Effektors studiert o...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212750</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Peptone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>211677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>291940</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast synthetic drop-out medium supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Y2001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-galactose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G0750</td>
<td>&gt;99%; &lt;0.1% glucose</td>
</tr>
<tr>
<td>D-raffinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R0250</td>
<td>&gt;98%</td>
</tr>
<tr>
<td>L-leucine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uracil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>U0750</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tryptophan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-histidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H6034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA, single stranded, from salmon testes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D7656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5879</td>
<td>Desiccate</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H1758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4338</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lithium acetate (LiAc)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4958</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris (base)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T. Baker</td>
<td>4109-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5516</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B6131</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dodecyl sulfate sodium salt (SDS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>8.22050.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>67.742</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculation loop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z643009</td>
<td>Sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH indicator strip, pH 6.5-10.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>1.09543.0001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

identification of growth inhibition phenotypes induced by expression of bacterial type iii effectors in yeast

Viele Gram-negative pathogene Bakterien mit einem Typ III Sekretionssystem für eine Suite von Effektor-Proteine ​​in das Cytosol der Wirtszellen zu translozieren. Innerhalb der Zelle unterwandern Typ III Effektoren Host zelluläre Prozesse, Immunantworten zu unterdrücken und zu fördern Wachstum des Pathogens. Zahlreiche Typ III Effektoren der pflanzlichen und tierischen bakterielle Erreger wurden bisher identifiziert, doch nur wenige von ihnen sind gut charakterisiert. Das Verständnis der Funktion dieser Effektoren wurde durch eine Kombination von funktionellen Redundanz wurde in den Effektor Repertoire eines bestimmten Bakterienstamm untergraben, die subtilen Wirkungen, die sie ausüben, um Virulenz, Rollen, die möglicherweise spezifisch für bestimmte Infektionen Stufen sind, und Schwierigkeiten bei der genetisch erhöhen können Manipulation bestimmter Krankheitserreger. Expression von Typ III Effektoren in der Hefe<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Kann damit umgehen, werden diese Beschränkungen und Hilfe für die funktionelle Charakterisierung von Effektor-Proteine. Da Typ-III-Effektoren häufig Ziel zelluläre Prozesse, die zwischen Hefe und anderen Eukaryoten konserviert sind, kann ihre Expression in Hefe in Wachstumshemmung Phänotypen, die ausgenutzt werden, um Effektor-Funktionen und Ziele klären kann führen. Zusätzliche Vorteile bei der Verwendung Hefe für funktionelle Studien von bakteriellen Effektoren gehören ihre genetische Lenkbarkeit Informationen über prognostizierte Funktionen der großen Mehrheit ihrer ORFs und die Verfügbarkeit von zahlreichen Tools und Ressourcen für genomweite und kleine Experimente. Hier diskutieren wir kritische Faktoren für die Gestaltung einer Hefe-System für die Expression von bakteriellen Typ III Effektor-Proteine. Dazu gehören einem geeigneten Promotor für die Expression des Effektors Gen (e) von Interesse, die Kopienzahl der Effektor-Gen, verwendet das Epitop-Tag-Protein-Expression und der Hefestamm zu überprüfen. Wir präsentieren Verfahren zur Expression von Effektoren in Hefe zu induzieren und deren Ausdruck durch Immunoblot zu überprüfen. Darüber hinaus beschreiben wir eine Spotting-Assay auf Agarplatten für die Identifizierung der Effektor-induzierte Wachstumshemmung Phänotypen. Die Verwendung dieses Protokoll kann die Studie von Pathogenitätsfaktoren in die Wirtszelle durch keine Erreger und Translokation Mechanismus geliefert erweitert werden.

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Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zur Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe und die Identifizierung der Effektor-induzierte Wachstumshemmung Phänotypen. Solche Phänotypen können anschließend genutzt werden, um Effektor-Funktionen und Ziele zu erläutern.

Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

identification-growth-inhibition-phenotypes-induced-expression

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Aufrufe.  Tel Aviv University. In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zur Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe und die Identifizierung der Effektor-induzierte Wachstumshemmung Phänotypen. Solche Phänotypen können anschließend genutzt werden, um Effektor-Funktionen und Ziele zu erläutern.

Serie: Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Forschung

Biologie

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expression von rekombinanten Proteinen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Bakterielle Lieferung von RNAi Effektoren: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease 1. Huntington's disease (HD) is caused by the abnormal expansion of a polyglutamine (polyQ) region within the protein huntingtin. The polyQ-expanded huntingtin protein attains an aberrant conformation (i.e. it misfolds) and causes cellular toxicity 2. At least eight further neurodegenerative diseases are caused by polyQ-expansions, including the Spinocerebellar Ataxias and Kennedy&#x2019;s disease 3.
The model organism yeast has facilitated significant insights into the cellular and molecular basis of polyQ-toxicity, including the impact of intra- and inter-molecular factors of polyQ-toxicity, and the identification of cellular pathways that are impaired in cells expressing polyQ-expansion proteins 3-8. Importantly, many aspects of polyQ-toxicity that were found in yeast were reproduced in other experimental systems and to some extent in samples from HD patients, thus demonstrating the significance of the yeast model for the discovery of basic mechanisms underpinning polyQ-toxicity. 
A direct and relatively simple way to determine polyQ-toxicity in yeast is to measure growth defects of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. This manuscript describes three complementary experimental approaches to determine polyQ-toxicity in yeast by measuring the growth of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. The first two experimental approaches monitor yeast growth on plates, the third approach monitors the growth of liquid yeast cultures using the BioscreenC instrument. 
Furthermore, this manuscript describes experimental difficulties that can occur when handling yeast polyQ models and outlines strategies that will help to avoid or minimize these difficulties. The protocols described here can be used to identify and to characterize genetic pathways and small molecules that modulate polyQ-toxicity. Moreover, the described assays may serve as templates for accurate analyses of the toxicity caused by other disease-associated misfolded proteins in yeast models.

This manuscript describes three complementary protocols for assessing the toxicity of polyglutamine (polyQ)-expansion proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. These protocols can easily be modified to monitor the toxicity of other misfolded proteins in yeast.

Wachstums-Assays zur Beurteilung Polyglutamin Toxizität in Hefe

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

Quantifizierung der Orofacial Phänotypen in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

Präzise, Hochdurchsatz-Analyse des Bakterienwachstums

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&amp;#946; Signaling

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

Molekulare Analyse der endothelialen Mesenchymale Transition induziert durch Transforming Growth Factor-β-Signalisierung

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...