JCM wird von einem BBSRC-IPA-Auszeichnung mit Unilever Plc (BB / L023040 / 1) gefördert. HAG wird von einem saudi-arabische Ministerium für Höhere Bildung PhD studentship finanziert.

Das folgende Verfahren wird 7,8 angepasst Wettbewerber Stämme mit Inhibitor-produzierenden Stämmen getestet werden . Hinweis: Dieses Protokoll beinhaltet Aerosolerzeugung mit Bakterienkulturen. Dies kann nur in einem geschlossenen Raum mit der Umsetzung von lokal zugelassenen Sicherheitsüberlegungen durchgeführt werden. Sprühen der Kultur auf die Agar-Platten innerhalb eines Level 2 Sicherheitsschrank wird eine Verschmutzung der Agar-Platten und die Umgebung zu minimieren. Dadurch wird auch die Forscher von Aerosol-Inhalation der versprühten Bakterien zu schützen, ist dies ein wichtiges Anliegen, wenn die Forscher Stufe 2 Organismen verwendet. Geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Die Fläche der Petrischale umgibt, wird am besten mit saugfähigen Wegwerfgewebe bedeckt. Post-Spray Dekontaminations UV-Licht wird empfohlen. 1. Vorbereitung der Agarplatten <ol><li> Bereiten Hirn-Herz-Infusion (BHI) -Agar gemäß der manulers Anweisungen. </li><li> Autoklaviert die BHI-Agar bei 121 ° C, 15 psi für 20 min oder entsprechend Autoklaven Empfehlungen des Herstellers, zu sterilisieren. </li><li> Gießen Sie 15 ml Aliquots von sterilisierten BHI-Agar in sterile Petrischalen und lassen Sie es zu setzen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, jeder Agarplatte verwendet werden innerhalb der Test aus dem gleichen Bestand an Agar stammt und dass es die gleiche Menge an Agar in jeder Platte. Dies schränkt die Variabilität in verfügbaren Nährstoffe und Inhibitor Diffusion zwischen den Platten ermöglicht die Vergleichbarkeit. </li></ol> 2. Vorbereitung Sterile Broth <ol><li> Bereiten Sie BHI-Brühe gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> 10 ml Aliquots von BHI bis 28 ml Glas Universal-Flaschen. </li><li> Autoklaviert die BHI broth bei 121 ° C, 15 psi für 20 min oder entsprechend Autoklaven Empfehlungen des Herstellers, zu sterilisieren. HINWEIS: Sicherstellen, dass alle im Test verwendeten Brühe stammt aus der gleichen Charge von Brühe autoclaved Variation in Nährstoffe zur gleichen Zeit zu begrenzen, die Variation in den Ergebnissen führen könnte. </li></ol> 3. Vorbereitung Sterile Vaporizer Flasche (n) <ol><li> Bauen Sie die Verdampfer Flasche. </li><li> Spray 5% oberflächenaktive Reinigungsmittel durch den Verdampfer interne Verunreinigungen zu beseitigen, genießen Sie die Verdampfer Flasche, Deckel und Verdampfer in der 5% oberflächenaktive Reinigungsmittel über Nacht. HINWEIS: Handschuhe und geeignete persönliche Schutzausrüstung zu verwenden, wenn oberflächenaktive Reinigungsmittel behandeln. </li><li> Trocknen Sie den Verdampfer, Deckel und Flaschen unter sterilen Luftstrom Haube. </li><li> Füllen Sie die Flasche mit 70% Ethanol, wieder anbringen und Verdampfer Teil des Ethanols durch den Verdampfer sprühen. </li><li> Setzen Sie den Deckel auf dem Verdampfer und speichern mit dem Ethanol im Inneren bis zur Verwendung. </li><li> Unmittelbar vor aseptisch spülen Sie die Flasche mit steriler BHI-Brühe zu verwenden und die Brühe durch den Verdampfer sprühen. ANMERKUNG: Dies verhindert, dass das Ethanol affektierender die in die Flasche gegeben Inokulum in Abschnitt 6.3. </li></ol> 4. Vorbereitung der bakteriellen Übernachtkultur (en) <ol><li> Streak der Wettbewerber und Inhibitor-Stämme auf eine sterile BHI-Agar-Platte und Inkubation bei 37 ° C aerob für etwa 18 Stunden (über Nacht). ANMERKUNG: Diese Platte erzeugt einen Vorrat von Bakterien, die für mehrere Wiederholungen innerhalb derselben Woche verwendet werden können, wenn sie bei 4 ° C gelagert. </li><li> Impfen 10 ml steriler BHI-Brühe mit einer Einzelkolonie des erforderlichen Wettbewerber Bakterienstamm in einem 28 ml Universal-Flasche. </li><li> Inkubieren Sie die Universal-Flasche bei 37 ° C aerob über Nacht in einem Schüttler bei 250 Umdrehungen pro Minute schütteln. </li></ol> 5. Spot-Kultur des Inhibitors produzierenden Isolate <ol><li> Bereiten Sie die Nacht-Kultur (en), wie in Abschnitt 4 beschrieben. </li><li> Stellen Sie sicher , Agar - Platten sind vollständig trocken, ohne Kondensation auf dem Deckel, vor der Impfung (zB durch pla Inkubationte für 60 min bei 37 ° C); Dies verhindert, dass der Impfstoff von der Impfstelle über die Platte zu verbreiten. </li><li> Je 25 ul der Übernachtkultur auf die Mitte der Agarplatten. Vermeiden Sie vollständig die Pipette Hineindrücken des Kolbens Luftblasen zu verhindern, dass die Kultur in den Agar sprühen. </li><li> Erlauben die Kultur bei Raumtemperatur trocknen Ausbreitung der Kultur zu begrenzen. Inkubieren der Agarplatten bei 37 ° C über Nacht unter aeroben Bedingungen. </li></ol> 6. Vorbereitung der Spray Inokulum des Test-Competitor-Stamm (n) <ol><li> Bereiten Sie die Nacht - Kultur , wie in Kapitel 4. Verdünnen Sie die Nacht - Kultur 10 - fach in BHI - Bouillon beschrieben auf etwa 4 x 10 6 CFU ml -1 und eine Suspension von OD 600 0,3 ± 0,05 erhalten. HINWEIS: Eine 10 - fache Verdünnung geben nicht 4 x 10 6 CFU ml -1 für alle Bakterienarten, die Berechnung der notwendigen Verdünnungsfaktor durch Ausbreitung Plattierung Reihenverdünnungen zwischen 1 x 10 <sup&gt; -1 -1 x 10 -6. </li><li> Gießen Sie die verdünnte Kultur in einen sterilen Plastik Parfüm Verdampfer Flasche. HINWEIS: Das Gesamtvolumen muss mehr sein als notwendig ist für die Anzahl der Agar-Platten gesprüht wird. Ungefähr 250 &amp; mgr; l pro Platte ist für einen Durchmesser von 9 cm Petrischale geeignet. </li></ol> 7. Latente Growth Inhibition Assay <ol><li> Sprühen der Kultur durch jeden der Verdampfer Flaschen zu gewährleisten, dass die Kultur in der Spritzmechanismus geladen wird, bevor auf den Agar Aufsprühen. </li><li> Aus einer Entfernung von etwa 15 cm über dem Agar, Spray etwa 250 &amp; mgr; l der verdünnten Kultur (3 Sprays eines typischen 50 ml Verdampfer) über die gesamte Agaroberfläche. Inkubieren der Agarplatten bei 37 ° C über Nacht unter aeroben Bedingungen. Wiederholen für andere Platten mit der gleichen Anzahl von Sprays. </li></ol> 8. Interpretieren Latente Growth Inhibition Assay Ergebnisse <ol><li> Messen Sie die Wachstumshemmung Zone des versprühten Wettbetor - Stamm (1A - C, &quot;X&quot; zu &quot;X&quot;) in mm, der Durchmesser der zentralen Stelle des Inhibitors-Produzent Subtrahieren (1A - C, &quot;Y&quot; auf &quot;Y&quot;). HINWEIS: Figur 1E zeigt , wie diese Daten dargestellt werden könnten </li><li> Notieren Sie sich die Klarheit Punktzahl für die Zonen der Hemmung. Hinweis: Dies zeigt den Grad der Hemmung beobachtet. Beispiele sind in 1A gezeigt - D - Stämme , die für die Standardisierung verwendet werden können , sind in den repräsentativen Ergebnissen Abschnitt vorgeschlagen. Die folgende Skala kann für Klarheit Scoring verwendet werden: eine Klarheit Score von 0 eine Zone der vollständigen Hemmung des Konkurrenten Stamm Wachstum zu beschreiben. Eine Punktzahl von 1 eine Zone fast vollständige Hemmung des Wachstums zu beschreiben, mit nur einzelnen Kolonien in der Zone der Lichtung. Eine Punktzahl von 2 eine sichtbare Zone mit reduziertem Wachstum zu beschreiben, das Wachstum innerhalb dieser Zone ist confließend oder nahezu konfluenten aber in der Dichte von&gt; 50% reduziert. Eine Punktzahl von 3 nur eine minimale Wachstumsreduktion zu beschreiben, ist das Wachstum konfluent und vermindert um weniger als 50%, ist eine Zone noch sichtbar und messbar. Eine Punktzahl von 4 keine sichtbare Hemmung des Wachstums zu beschreiben. Eine Punktzahl von 5 zu beschreiben, dass das Wachstum des Kompetitors Stamm wurde in der Nähe des Test inhibitor-produzierenden Stammes erhöht. Siehe Abbildung 1 für Beispiele. Diese Werte sind subjektiv zu den Experimentator. </li></ol> 9. Replikate <ol><li> Wiederholungsassays mindestens in dreifacher Ausfertigung biologischen die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Ergebnisse zu bestimmen. HINWEIS: Wenn Replikate an verschiedenen Tagen durchgeführt werden, Messungen und punkten Platten unmittelbar nach der Entnahme aus der Inkubation dann entweder speichern Platten bei 4 ° C oder qualitativ hochwertigen Fotos von Platten, bevor sie zu verwerfen. Lagerung oder Fotos von Platten ermöglicht einen einfachen Vergleich der Ergebnisse zwischen den verschiedenen Tagen, tsein ist besonders wichtig für reproduzierbare Scoring über Tage / Experimente bestätigt. Beachten Sie, dass die Lagerung der Platten, die das Potential Ergebnisse zu ändern hat. HINWEIS: Für klare Fotografien Ort Platten aufrecht, ohne ihre Deckel auf einem matten schwarzen Hintergrund in einem Bereich von diffusem Licht, verwenden Sie eine hochauflösende Kamera (≥8 MP), der auf Gegenstände in der Nähe der Linse (Makro-Modus) zu konzentrieren. Alternativ können einige Gel-Imager mit trans-Illuminator mit weißem Licht setzen hohe Qualität zu produzieren, eine hohe Reproduzierbarkeit der Bilder. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Ein kritischer Schritt dieses Bakterienart Wettbewerb Protokoll , das es von anderen unterscheidet, ist die Inkubation über Nacht des Inhibitors vor der Zugabe des Kompetitors Isolat isolieren. Der Inhibitor Stamm benötigt diese Wachstumsperiode inhibitorischen Verbindungen herzustellen. Als Kompetitor Belastung auf dem gleichen Medium überlagert wird, ermöglicht dieses Verfahren die Forscher das volle Potential zu beobachten des Inhibitors Stamm mit einem Wachstum des Wettbewerbers Belastung zu stören. Als Ergebnis spiegelt dieser Test, was mit der Natur geschieht; ein Isolat ist vollständig in einer Nische eingerichtet, und die andere müssen alle hemmenden Variablen entgegenzuwirken können der Lage sein, um erfolgreich die Nische eindringen. Es gibt zwei Teile zu diesem Protokoll, die am ehesten zu fehlerhaften Ergebnissen führen, wenn nicht richtig durchgeführt wird. Zum einen kann unvollständige Sterilisation der Verdampfer Flaschen einführen Bakterien in den Test zu kontaminieren. IncuBation der Brühe verwendet, um den Verdampfer Flasche in Schritt 3.6 in ein steriles Gefäß zu spülen können Flaschen verwendet werden, vollständig sterilisiert, um zu bestätigen wurden. Zusätzliche Wäschen in desinfizierenden Lösungen, wie Virkon kann vor der Wäsche in oberflächenaktiven Reinigungsmittel verwendet werden, beschrieben in Schritt 3.2, ob zusätzliche Sterilisation erforderlich ist. Ein zweiter Schritt, der zu falschen Ergebnissen führen kann, ist die Verdünnung des Wettbewerbers Stamm (Schritt 6.1). Wenn die Verdünnung nicht optimal, klare Messungen der Hemmung ist nicht leicht bestimmt werden. Dieser Test wurde unter Verwendung verschiedener Isolate nasal optimiert als Inhibitor produzierenden Stämme in einem breiten Spektrum von Gram-positive und Gram-negative Spezies im Vergleich zu S. aureus SH1000 als Wettbewerber Stamm 7,8. Es wurde anschließend unter Verwendung von verschiedenen Koagulase negative und Koagulase-positive Staphylokokken als Wettbewerber getestet und Inhibitor-produzierenden Stämme. Bei der Prüfung von Gattungen andere als die oben als Wettbewerber beschriebenStamm, einige Optimierung der Verdünnung des Inokulums kann notwendig sein. Wenn Klarheit Partituren signifikant zwischen den Wiederholungen variieren, könnte es notwendig sein, den Wettbewerber Stamm Inokulum zu standardisieren, indem es auf eine bestimmte optische Dichte einstellen. Das wird jedoch die Zeit, die der Test einzurichten dauert, und wird wahrscheinlich die Zahl der Stämme zu reduzieren ist es möglich, pro Experiment zu verarbeiten. Optisch Einstellen der Kultur auf einen entsprechenden OD ein McFarland-Standard eine schnelle Alternative zur Verfügung stellen kann. Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass es nur zu kultivierbaren Bakterien angewendet werden. Aus diesem Grund viele Studien verwenden 16S rRNA - Sequenzierung Konkurrenzausschluss Wechselwirkungen 3,4,13 zu prognostizieren. Allerdings genetische und Metagenom-Techniken können nur Mitglieder der Gemeinschaft auf Artenebene zu unterscheiden, und / oder berücksichtigen keine besondere innerartliche Merkmalsvariation. Es ist möglich, dass die Zuordnung eines particul zu screenenar Gen , das ein Merkmal mit der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Bakterienspezies codiert 5, jedoch erfordert dieses Vorwissen eines Gens wahrscheinlich unter Ausschluss zugeordnet werden einer Spezies. Ein Sicherheitsaspekt dieser Technik ist, dass aufgrund der Aerosolerzeugung von Bakterien, kann es nur in Laboratorien mit einem Level 2 Sicherheitsschrank oder mit ähnlichen Sicherheitsvorkehrungen verwendet werden. Es gibt alternative Techniken für den Wettbewerb zwischen den Isolaten zu testen, die für intraspezifische Merkmalsvariation berücksichtigen und erzeugen keine Aerosole von Bakterien. Ein solches Verfahren ist die gleichzeitige Antagonismus - Test 2. In diesem Verfahren wird ein Inokulum von einem Isolat auf einer Agarplatte verteilt, und ein zweites Isolat Inokulum wird auf getüpfelt oder gestochen, sobald die erste getrocknet ist. Dies würde eine Umgebung, wo die Stämme im direkten Wettbewerb (gleichzeitige Antagonismus) erzeugen, die beide im Wettbewerb hemmende Verbindungen herzustellen und scavenge Nährstoffe zuerst. Die advantage des latenten Wachstumshemmung Assays über die gleichzeitige Antagonismus-Test ist, dass der Inhibitor-Isolat immer den Wettbewerbsvorteil ist voll etabliert, bevor Invasion des Konkurrenten Isolat haben sollte. Dies ist mehr reflektiert , was in der Umgebung passieren würde, wie in den meisten Nischen, wird ein Isolat hergestellt werden , bevor ein anderer Stamm hinzugefügt wird, anstatt zwei Isolate gleichzeitig 8 hinzugefügt wird. Eine weitere Alternative zur Vermeidung von Aerosolerzeugung von Bakterien, die die Wettbewerber in Top-Agar isolieren hinzuzufügen wäre, die anstatt über den Inhibitor-Isolat gesprüht werden gegossen könnte. das Volumen der Top-Agar jedoch müssten hinzugefügt etwa 3 ml werden gleichmäßige Abdeckung der Platte zu gewährleisten. Innerhalb dieses Bandes würde die Kompetitor-Isolat nicht auf dem gleichen Medium wie dem Inhibitor Isolat wachsen, so würde nicht von reduzierten Nährstoffe leiden. Der Wettbewerber würde auch nicht mit irgendwelchen hemmenden Verbindungen in direktem Kontakt until sie in die Top-Agar diffundiert. Ein solcher Test nicht als aktive latente Hemmung oder gleichzeitige Antagonismus beschrieben werden könnte. Ein ähnliches Verfahren wurde früher verwendet, um die Niveaus von Bacitracin Widerstand unter klinischen S. beurteilen aureus - Isolaten 10. Der wesentliche Unterschied zwischen dem Protokoll hier beschrieben und die von 10 beschrieben wurde , ist die letztere nur Klein Wettbewerber Stämme als sensibel (komplett inhibition- Klarheit Score 0) oder beständig (teilweise bis gar keine inhibition- Klarheit Score 1-5). Der latente Wachstumshemmung Assay könnte daher auch für die Höhe der Widerstand an die Erzeuger von bestimmten antimikrobiellen Mitteln zu screenen, verwendet werden, oder auch für neuartige antimikrobielle Substanzen wirksam gegen multiresistente Erreger zu suchen. Es wurde vorgeschlagen , dass die Host - Mikroflora 9 unerwünschte Mitglieder der Bakteriengemeinschaft zu beseitigen manipuliert werden könnte. Die Anwendung von Corynebakterien oder Staphylococcus epidermidis wurden bereits S. gezeigt zu beseitigen aureus Besiedlung in den Nasenlöchern in einem erheblichen Teil der Bevölkerung 11,12. Studien in bestimmte Stämme, die kompetitiv unerwünschte Mitglieder der Wirts Flora, durch Techniken wie die hier beschriebene ausschließen kann, kann daher auf zukünftige Therapeutika führen.

Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brain heart infusion broth</td>
			<td style="width:71px;">Lab M</td>
			<td style="width:119px;">lab049</td>
			<td style="width:167px;">rich general purpose media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">agar-agar</td>
			<td style="width:71px;">Merck Milipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">101614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">82.1473.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">plastic perfume vaporizer</td>
			<td style="width:71px;">not known</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Universal bottles</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">no longer in production, alternative SLS BOT5006</td>
			<td>28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Decon 90</td>
			<td style="width:71px;">Decon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surface active cleaning agent&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deferred growth inhibition assay to quantify the effect of bacteria-derived antimicrobials on competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

Die Testergebnisse sollten als Differenz in dem überlagerten Wettbewerber Stamm in der Nähe des zentral spotted Inhibitor-produzierenden Stamm (Abbildung 1) zu beobachten sein. Diese Unterschiede lassen sich als Voll Hemmung (1A), die partielle Hemmung (1B und 1C) interpretiert werden, ohne Hemmung (1D) oder positive Assoziation. Die weithin verfügbar Laborstämme S. epidermidis und S. Tü3298 epidermidis RP62A und S. epidermidis und S. RP62A aureus Newman wurden in den 1B und 1D verwendet wurden . Wir schlagen vor, dass diese Stämme dieses Protokoll zu testen, verwendet werden könnten. Je nach Spezies getestet, vollständige Hemmung und partielle Hemmung sind höchstwahrscheinlich das Ergebnis von antimikrobiellen Peptiden, Antibiotika oder anderen diffusionsfähiges Wachstum inhibitors durch den Inhibitor-produzierenden Stamm produziert. Teilweise Hemmung wurde auch aufgrund der reduzierten Nährstoffverfügbarkeit für die Wettbewerber Stamm - Aufnahme oder Sequestrierung von Nährstoffen durch den Inhibitor Stamm 6 in Verbindung gebracht worden. Vergleich der Größe der Hemmzone zwischen verschiedenen Inhibitor-produzierenden getesteten Isolate gegen den gleichen Wettbewerber Stamm zeigt Unterschiede in einer der folgenden Eigenschaften: die Menge an antimikrobiellen durch den Inhibitor-produzierenden Stammes erzeugt wird; die Fähigkeit des Inhibitors durch die Medien zu diffundieren; die Art von Inhibitor produziert und der Widerstandsgrad des Wettbewerbers Stamm zu den Inhibitoren produziert. Vergleich der Größe der Hemmzone zwischen verschiedenen Konkurrenz getesteten Stämme gegen den gleichen Inhibitor-produzierender Stamm ist indikativ für die Widerstandswerte der Kompetitor-Stämme der Inhibitor produziert. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Die Ergebnisse werden auf der inhibitorischen Stamm variieren je nach verwendetem und der Wettbewerber Stamm verwendet. Wiederholt die gleiche hemmende und Wettbewerber Stamm verwenden, sollten idealerweise die gleiche Klarheit Score (beschrieben in Abschnitt 8.2), deutet dies auf eine gute Technik wurde durchgehend verwendet worden. Wenn uneinheitliche Anwendung von Bakterien die Platten aufgetreten ist, sollten nicht verwendet werden. Wenn beispielsweise der Test Konkurrenzkultur zu verdünnt ist die Zone der Hemmung erscheint größer und mit einem weniger klar definierte Kante als üblicherweise (2A) beobachtet; dies würde die Zuverlässigkeit von Vergleichszone Messungen beeinflussen. Wenn der Inhibitor-produzierenden Stamm vor Ort nicht vollständig über Nacht vor der Inkubation getrocknet wurde, ist der Inhibitor Stamm wahrscheinlich zu verbreiten und nicht eine klar definierte Stelle (2B), die typischerweise eine Zone Messungen beeinflusst , sondern auch die Klarheit Scoring beeinflussen können. Ist der Teilnehmer-Stammgleichmäßig kann dies zu einer unausgewogenen Verteilung der Bakterien führen (Abbildung 2C) nicht besprüht. Wenn der Teilnehmer zu Belastung konzentriert ist , ist es möglich , dass die Wettbewerber Belastung auf der Oberseite des Inhibitor - Stamm (2C) wachsen können, in extremen Fällen kann dies bis zu einem gewissen Umkehrung der Wettbewerber / Inhibitor - Stamm Rollen führen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig1.jpg" /> Abb . 1: Der Bereich der qualitativen und quantitativen Ergebnisse , die aus der aktiven latenten Wachstumshemmung Testergebnisse für die Wachstumshemmung erhalten werden kann , kann im Bereich von (A) eine vollständige Hemmung (Score von 0), (B) teilweise Hemmung (Note 1) , (C) teilweise Hemmung (Score von 2) bis (D) keine Hemmung (Note 4). Etiketten zeigen die Ränder des Wachstums der Inhibitor-Stämme (Y) und der äußersten Kante der HemmungZonen (X). Die Größe der Hemmzone Bereich von 0 mm bis über 10 mm, wie in (E) gezeigt, die die Messungen für die Platten in A, B, C und D. Die Ergebnisse sind gezeigt für den letzten Staphylokokken Isolate (A zeigt fotografiert , C) oder gemeinsame Staphylokokken - lab - Isolaten S. epidermidis Tü3298 (Inhibitor) und S. epidermidis RP62A (Wettbewerber) (B), und S. epidermidis RP62A (Inhibitor) und S. aureus Newman (Wettbewerber) (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54437/54437fig2.jpg" /> Abbildung 2: Beispiele für inkonsistente Ergebnisse aufgrund der schlechten Technik Ergebnisse etwas anders aus als erwartet , wenn (A. </strong&gt;) Wettbewerber Stamm wurde zu stark verdünnt, (B) Inhibitor - Stamm war nicht vollständig trocken sein, bevor die Inkubation / Platten waren nicht trocken oder (C) , wenn die Wettbewerber Belastung nicht gleichmäßig aufgesprüht wurde und zu konzentriert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54437/54437fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen dieser Figur.</a>

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Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Latente Growth Inhibition Assay zur Quantifizierung der Wirkung von Bakterien abgeleitete Antimikrobielle auf Wettbewerb

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Aufrufe.  University of Liverpool. The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Serie: Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

This video demonstrates two methods for preparing and placing beads, which have been coated with growth factor, on explants of the developing cerebral cortex. These beads can be used to induce spatially restricted gene expression on developing neural tissue such as forebrain explants. Methods are given for using both Affi-Gel beads and heparin acryllic beads.

Growth Factor-Coated Bead Platzierung auf Dorsal Vorderhirnneuronen Explantate

Forschung

Biologie

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Effect of Male Zubehör Gland Produkte auf die Eiablage in Schnecken

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the binding capabilities of GTPases for two reasons: The fact that all interactions involve the same face of the GTPases means that binding events must be considered in the context of competitors, and the fact that the bound nucleotide must also be controlled means that conventional approaches such as immunoprecipitation are unsuitable for GTPase biochemistry. The assay relies on the use of purified proteins. Purified Rac1 immobilized on beads is used as the bait protein, and can be loaded with GDP, a non-hydrolyzable version of GTP or left nucleotide free, so that the signaling stage to be investigated can be controlled. The binding proteins to be investigated are purified from mammalian cells, to allow correct folding, by means of a GFP tag. Use of the same tag on both proteins is important because not only does it allow rapid purification and elution, but also allows detection of both competitors with the same antibody during elution. This means that the relative amounts of the two bound proteins can be determined accurately.

This protocol compares the relative affinities of binding partners for Rho-family GTPases, including Rac1. In vivo, Rac1-binding proteins compete for a single binding interface, the conformation of which is dictated by a bound nucleotide. The nucleotide is both important and difficult to control experimentally, due to the high hydrolysis rate.

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Competition-Assays

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed cellular senescence. Accumulation of senescent cells occurs with organismal aging and through continual culturing in vitro. Senescent cells influence many biological processes, including embryonic development, tissue repair and regeneration, tumor suppression, and aging. Hallmarks of senescent cells include, but are not limited to, increased senescence-associated &#946;-galactosidase activity (SA-&#946;-gal); p16INK4A, p53, and p21 levels; higher levels of DNA damage, including &#947;-H2AX; the formation of Senescence-associated Heterochromatin Foci (SAHF); and the acquisition of a Senescence-associated Secretory Phenotype (SASP), a phenomenon characterized by the secretion of a number of pro-inflammatory cytokines and signaling molecules. Here, we describe protocols for both replicative and DNA damage-induced senescence in cultured cells. In addition, we highlight techniques to monitor the senescent phenotype using several senescence-associated markers, including SA-&#946;-gal, &#947;-H2AX and SAHF staining, and to quantify protein and mRNA levels of cell cycle regulators and SASP factors. These methods can be applied to the assessment of senescence in various models and tissues.

Cellular senescence, the irreversible state of cell-cycle arrest, can be induced by various cellular stresses. Here, we describe protocols to induce cellular senescence and methods to assess markers of senescence.

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to eradicate not only due to the emergence of antibiotic-resistant strains but also its ability to form biofilms. Recently, photodynamic therapy (PDT) has been indicated as one of the potential treatments for controlling biofilm infections. However, further studies are required to improve our knowledge of its effect on bacterial biofilms, as well as the underlying mechanisms. This manuscript describes an in vitro model of PDT with 5-aminolevulinic acid (5-ALA), a precursor of the actual photosensitizer, protoporphyrin IX (PpIX). Briefly, mature S. aureus biofilms were incubated with ALA and then exposed to light. Subsequently, the antibacterial effect of ALA-PDT on S. aureus biofilm was quantified by calculating the colony forming units (CFUs) and visualized by viability fluorescent staining via confocal laser scanning microscopy (CLSM). Representative results demonstrated a strong antibacterial effect of ALA-PDT on S. aureus biofilms. This protocol is simple and can be used to develop an in vitro model to study the treatment of S. aureus biofilms with ALA-PDT. In the future, it could also be referenced in PDT studies utilizing other photosensitizers for different bacterial strains with minimal adjustments.

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

This manuscript describes a protocol to study the antimicrobial effect of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy (ALA-PDT) on a Staphylococcus aureus biofilm. This protocol can be used to develop an in vitro model to study the treatment of bacterial biofilms with PDT in the future.

Eine In vitro- Modell, die Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-vermittelten photodynamische Therapie auf Staphylococcus Aureus Biofilm zu studieren

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

Eine Platte-Wettbewerb-Assay als eine schnelle vorläufige Beurteilung der Krankheit Unterdrückung

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Latente Growth Inhibition Assay zur Quantifizierung der Wirkung von Bakterien abgeleitete Antimikrobielle auf Wettbewerb

Zusammenfassung

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Growth Factor-Coated Bead Platzierung auf Dorsal Vorderhirnneuronen Explantate

Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced

Effect of Male Zubehör Gland Produkte auf die Eiablage in Schnecken

Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine mit Competition-Assays

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

Eine In vitro- Modell, die Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-vermittelten photodynamische Therapie auf Staphylococcus Aureus Biofilm zu studieren

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Eine Platte-Wettbewerb-Assay als eine schnelle vorläufige Beurteilung der Krankheit Unterdrückung

Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca^{2 +}-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma

Latente Growth Inhibition Assay zur Quantifizierung der Wirkung von Bakterien abgeleitete Antimikrobielle auf Wettbewerb

Zusammenfassung

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Growth Factor-Coated Bead Platzierung auf Dorsal Vorderhirnneuronen Explantate

Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced

Effect of Male Zubehör Gland Produkte auf die Eiablage in Schnecken

Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine ​​mit Competition-Assays

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

Eine In vitro- Modell, die Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-vermittelten photodynamische Therapie auf Staphylococcus Aureus Biofilm zu studieren

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Eine Platte-Wettbewerb-Assay als eine schnelle vorläufige Beurteilung der Krankheit Unterdrückung

Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma

Vergleicht man die Affinität der GTPase-bindende Proteine mit Competition-Assays

Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca^{2 +}-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma