Wir danken Brian G. Coon und Claudia B. Hanna für hilfreiche Diskussionen und Unterstützung. Dieses Projekt wurde durch eine Anschubfinanzierung aus dem Dep unterstützt. of Biological Sciences, Purdue University zu R. Claudio Aguilar und ein American Cancer Society Institutional Research Grant R. Claudio Aguilar durch die Purdue Cancer Center.

A. Zellkultur und Protein Induction Dieser Abschnitt beschreibt Zellkulturbedingungen, Zellzyklus-Synchronisation mit Nocodazol, durch Induktion der Proteinexpression von einem regulierbaren Promotor in Hefe-Zellen gefolgt. <ol><li> Die Wildtyp-Hefestamm W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) ist mit hoher Kopienzahl (2μ) Plasmid-DNA, die unsere Gen von Interesse (ENTH2) enthält unter der Kontrolle verwandelt eines Methionin-repressible Promotor (MET25). 2mM Methionin ist ausreichend, um die Promotoraktivität zu unterdrücken, während Medien fehlt Methionin ermöglicht maximale Expression. Somit kann eine Reihe von Methionin-Konzentrationen verwendet werden, um das Protein auf dem gewünschten Niveau zu äußern. 1 Transformation von Plasmid-DNA in Zellen W303 erfolgt über die LiAc-TE-Methode gemäß Standardverfahren. 2 Hinweis: Dieses Experiment sollte, indem die Zellen über Nacht in Gegenwart von 2 mM Methionin-Protein-Expression nur im Hintergrund Ebenen zu gewährleisten durchgeführt werden. Am nächsten Morgen sollte die Proteinexpression durch Resuspendieren der Zellen in Medien fehlt Methionin unmittelbar nach Zellzyklus-Synchronisation (ca. 4h) induziert werden. Allerdings haben wir festgestellt, dass die ENTH2-abhängige Zellteilung Phänotyp induziert wird (in der Regel nach 4-6h von Protein-Induktion 3) erst mit einer erheblichen Konzentration von ENTH2 hat sich in den Zellen gebaut, was den zeitlichen Verlauf der Analyse aller Erscheinungsformen des der Phänotyp sehr lange (mindestens 16h). Wir haben festgestellt, dass das Wachstum der Zellen über Nacht in Gegenwart von 0,2 mM Methionin unterdrückt die morphologischen Phänotyp, sondern ermöglicht unterkritischen Proteinkonzentration, die schnell auf-Phänotyp-induzierenden Ebenen erhöht werden kann, wenn die Medien fehlen Methionin übertragen. Dies ermöglicht eine detaillierte Analyse der schweren Erscheinungsformen der Zellteilung Defekt in einem relativ kürzerer Zeit. Wir empfehlen daher, dass der Experimentator die Methionin-Konzentration, die unterhalb der Schwelle für Phänotyp Induktion auf einer Fall-zu-Fall-Basis zu ermitteln. </li><li> Wählen sechs Kolonien aus einer Platte, die vor kurzem transformierten Zellen und impfen in 50 ml von selektiven Medien mit 0,2 mm Methionin in einem sterilisierten Erlenmeyerkolben mit Standard-sterile Techniken. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. (Für weitere Informationen über Standard-Hefekultur Bedingungen, vgl. Rz. 4) </li><li> Am nächsten Morgen, schätzen Zelldichte durch Messung der optischen Dichte der Kultur bei 600nm. Übertragen Sie die Höhe von 20 OD 600nm von Zellen in ein steriles Zentrifugenröhrchen und Ernte durch Spinnen bei 2200 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Die Zellen in einer Konzentration von 0,4 OD 600nm / ml YPD und fügen Nocodazol, um eine endgültige Konzentration von 15μg/ml von einem Bestand von 1mg/ml in DMSO. Inkubieren 4h bei 30 ° C unter Schütteln bei 200rpm. Hinweis: Alternative Verhaftung Methoden einschließlich Verhaftung an der G0-Phase mit alpha-Faktor-oder G1-S-Phase mit Hydroxyurea eingesetzt werden kann. Wir haben festgestellt, dass Verhaftung bei der Mitose mit Nocodazol einfach und effektiv genug für unsere Zwecke ist. </li><li> Nach 4h, überprüfen Prozentsatz an Zellen in der Mitose durch Zählen der Anzahl der Zellen mit gleich großen Knospen, indem Sie unter dem Mikroskop verhaftet. Wenn die Verhaftung von mehr als 90% auf den folgenden Schritt fort. Ansonsten halten Zellen in Nocodazol, bis der gewünschte Prozentsatz der Mitose erreicht wird. </li><li> Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten und wäscht mit eiskaltem Wasser dreimal. Nach dem letzten Waschen, das Pellet in selektiven Medien fehlt Methionin in einer Zelldichte von ~ 0,5 OD 600nm / ml. Übertragung der Hälfte des Volumens von Zellen zu einem neuen sterilen Röhrchen und fügen Methionin, um eine endgültige Konzentration 0,2 mM. Dies wird als Kontrolle für Effekte aufgrund basalen Ebenen der Proteinexpression dienen. Dies ist das erste Mal-Punkt des Experiments (Zeit = 0h). Analysieren Sie die Zellen jede Stunde für 6h. </li></ol> B. Analyse der Phänotyp Entwicklung Hinweis: Alle die Analyse unten beschriebenen Methoden müssen nicht gleichzeitig durchgeführt werden. Bestimmung von Protein-Expression mittels Western Blot <ol><li> Bei jedem Zeit-Punkt, messen Sie die OD 600nm von der Kultur und Ernte 2 OD 600nm Äquivalente der Zellen durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten. </li><li> Das Pellet in 1 ml sterilem Wasser und übertragen Sie die Suspension auf eine 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Wiederholen Sie die Zentrifugation zu einem Pellet zu erhalten. Den Überstand aspirieren. </li><li> Das Pellet in 50 ul SDS-PAGE Laemmli-Probenpuffer (50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 2% β-Mercaptoethanol und 0,006% Bromphenolblau). Add 50 ul des Säure-gewaschene Glasperlen (0.2-0.4 Mikron Durchmesser) und Wirbel für 1 min. </li><li> Boil Röhrchen auf einem 95 ° C Hitze block für 2 Minuten, Wirbel wieder für 30 Sekunden und wieder kochendes für 5 Minuten. Einfrieren der Proteinprobe bei -20 ° C. </li><li> Run Protein-Proben auf einem 12% SDS-PAGE-Gel, Transfer auf eine Nitrozellulosemembran und führen Western-Blot mit den entsprechenden Antikörpern gegen das Protein von Interesse zu erkennen. In diesem Beispiel Sonde wir das Vorhandensein von Hämagglutinin (HA) markiert ENTH Domains durch Inkubation mit Maus-Anti-HA-Antikörper (Covance, Princeton, NJ) bei 1:2000-Verdünnung in Blotto-Tween (1XPBS, 5% fettfreier Trockenmilch , 0,1% Tween). HRP markierten Ziege anti-Maus Sekundärantikörper (Pierce) in einer Verdünnung von 1:2500, auch in Blotto-Tween, darf an den primären Antikörper auf der Membran für 1h bei Raumtemperatur zu binden. Supersignal West Pico Chemilumineszenzsubstrat wird verwendet, um HRP markierten anti-Maus-Antikörper erkennen. </li><li> Quantifizierung der Proteinexpression Ebenen durch Densitometrie. </li></ol> Dieser Abschnitt beschreibt zwei Methoden der Tracking-Phänotyp Entwicklung in Abhängigkeit von steigender Proteinkonzentration. Die erste Methode ist Zell-Population basiert, während die zweite Studien auf der Ebene einer einzelnen Zelle. Die Quantifizierung der Zellteilung Phänotyp und Zelltod <ol><li> Zu jeder Zeit-Punkt, Transfer 1ml Zellsuspension in ein steriles Eppendorf-Röhrchen mit sterilen Techniken und Ernte Zellen durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten. </li><li> Saugen Sie den Überstand und das Pellet in 70μl Medien, von 30μl Methylenblau aus einem Bestand von 1mg/ml in sterilem Wasser gefolgt. Methylenblau ist ein blauer Vitalfarbstoffs dass farblos in der reduzierenden Umgebung des Cytosol damit toten Zellen können durch ihre blaue Farbe identifiziert werden wird. </li><li> Pipette ~ 6μl dieser Suspension auf einen sauberen Glasobjektträger und setzen Sie ein Deckglas über die Tropfen. Drücken Sie die Deckglas vorsichtig, um eine dünne, gleichmäßige Schicht von Zellen zwischen den Glas-Grenzflächen zu bilden. </li><li> Teilen Sie dem Deckglas in 9 Quadranten und nehmen Sie 3 Bilder pro Quadranten wie in Abb.. 2. Die Anzahl der Zellen / Feld sollte nicht größer als 30 Zellen eine genaue Quantifizierung. Jedes Deckglas kann für ca. 15 Minuten dargestellt werden, bevor Luftblasen Schaden der Vorbereitung. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die den Phänotyp unter studieren. Die Zellteilung Fehler auf ENTH2 Überexpression induzierten führt zum Zelltod und damit wir auch zählen die Anzahl der toten Zellen durch ihre blaue Farbe gekennzeichnet. </li><li> Berechnen Sie den Anteil der phänotypischen Zellen. </li><li> Zeichnen Sie die Daten wie in Abb.. 3. </li></ol> Visualisierung von Phänotyp-spezifische Defekte mittels Fluoreszenzmikroskopie Zellteilung defekten Zellen, wie auf ENTH2 Überexpression gesehen haben, sind oft von Zellwand Mängel und Septin mislocalization3 (visualisiert als GFP-Fusionsproteine) gekennzeichnet. Die Zellwand von Hefezellen kann leicht durch Färbung mit Calcofluor White (CFW), die irreversibel bindet in Hefe-Zellwände Chitin. <ol><li> Bei jedem Zeit-Punkt, Aliquot 1 ml Kultur in ein steriles Eppendorf-Röhrchen und Ernte Zellen durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Zellpellet in 100 &amp;mgr; l von 1mg/ml CfW Lösung in sterilem Wasser und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und 3 x waschen mit 1X PBS. </li><li> Das Pellet in 100 &amp;mgr; l 1X PBS und Bild unter dem Mikroskop mit UV-Optik (Zellwand) und FITC-Filter (GFP-Septin) bei 100-facher Vergrößerung. </li><li> Quantify Anteil der Zellen mit Zellwand Mangels und Septin mislocalization durch folgende Schritte 4-6 in Abschnitt B.2.1 </li></ol> B.3. Bestimmung des Phänotyps Entwicklung an der einzelnen Zelle Ebene: Zeitraffer-Video-Mikroskopie. <ol><li> Saubere einem Glasträger mit einer konkaven Vertiefung mit 70% Alkohol und an der Luft trocknen. </li><li> Boil 0,06 g Agarose in 5ml selektiven Medien fehlt Methionin in einem sterilen Glasröhrchen in der Mikrowelle, bis die Agarose vollständig auflöst. </li><li> Schnell Pipette 200 ul der Agarose mit Medien in der Folie Depression und invertieren Sie einen sauberen Glasobjektträger über sie darauf achten, dass keine Luftblasen unter gefangen sind. </li><li> Wenn das Gel erstarrt, stellen Sie den Schieberegler auf der Oberseite glatt weg von der Depression rutschen, halten ihre Flächen parallel zu allen Zeiten. Dies gewährleistet, dass die Oberfläche der Agarose Bett bündig mit der Oberfläche der Mulde gleiten kann. Reinigen Sie die Folie Region um die Agarose Bett mit einem feinen Gewebe. Die Folie ist nun einsatzbereit. </li><li> Zum Zeitpunkt = 4 Stunden, Transfer 1ml von Zellen aus der Kultur in ein steriles Eppendorf-Röhrchen und Ernte durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Hinweis: Es wird empfohlen, zu einem späteren Zeit-Punkt gewählt, um ein hohes Maß an Protein-Expression zu gewährleisten, so dass Phänotyp Entwicklung garantiert werden. Pilotversuche sind determin erforderliche Induktionszeiten auf einer Fall-zu-Fall-Basis. </li><li> Saugen Sie den Überstand und die Zellen in 100 &amp;mgr; l frisches selektiven Medien fehlt Methionin. </li><li> Vaseline, um die Ränder des Deckglases. Dann geben Sie einen Tropfen der Zellsuspension in der Mitte der Agarose Bett und breitete einheitlich durch leichtes Drücken auf einem Deckglas über sie. </li><li> Seal die Ränder des Deckglases mit Vaseline und fixieren ihre Position durch die Auskleidung die Ränder mit Nagellack. Warten Sie, bis der Nagellack trocknet. </li><li> Legen Sie die Folie auf einem beheizten eines Mikroskops, und wählen Sie ein Feld, das nicht mehr als 10 Zellen verteilt ausreichend enthält. Wie sich Zellen teilen, wird das Feld im Laufe der Zeit überfüllt. </li><li> Nehmen Sie ein Bild des Feldes alle 5 Minuten für ca. 5 Stunden. Phänotyp Fortschreiten kann durch Zusammenfügen der Bilder in einen Film mit ImageJ-Software (studiert werden <a name="cite">Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005</a> ) </li></ol> Hinweis: Wir verwenden Zeiss Axiovert 200M Mikroskop, monochrome Zeiss AxioCam MRm Digitalkamera und Carl Zeiss AxioVision Bildaufnahme-Software (Version 4.4) für Live Cell Imaging. Die Temperaturregelung erfolgt, indem gleitet auf einer beheizten Bühne bei 30 ° C durch die Pecon TempControl 37 medizinischen Geräten erzielt. Um zu vermeiden, re-Einstellung des Fokus wiederholt, ist es zweckmäßig, die Bildaufnahme-Software-Programm, um automatisch erwerben ein paar Z-Stapel-Bildern zu jeder Zeit-Punkt, und wählen Sie das Bild mit dem besten Fokus später bei der Montage des Films. Einige Bildaufnahme Software haben die Möglichkeit, Autofokus für zeitliche Verlauf Experimente. Es ist zweckmäßig, diese Option ein, wenn verfügbar ist. Wildtyp-Hefezellen wachsen am besten bei 30 ° C damit Temperaturregelung ist kritisch. Um eine ausreichende Wärme zu gewährleisten, ist es hilfreich, einen externen Wärmequelle neben dem beheizten Bühne bieten. Zum Beispiel lassen wir die übertragenen weißem Licht des Mikroskops auf für die gesamte Dauer der Bildgebung. Es ist auch wichtig, um Luftblasen zu vermeiden, wenn die Vorbereitung der Agarose Bett und Zell-Sandwich. Die Luft in den Blasen eingeschlossene erweitert, wenn im Laufe der Zeit erhitzt und neigen dazu, Zellen wegschieben aus dem Bereich abzubildenden. Es ist auch wichtig, dass einzelne Zelle Positionen innerhalb des Feldes werden, nicht wesentlich ändert über die Dauer der bildgebenden Verfahren, vor allem während der Re-Fokussierung versucht. Bildstabilisierung Plugins sind verfügbar für ImageJ kleine Verschiebungen in der Zelle Position zu korrigieren, um nach dem Film montiert worden ist. ( <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/ ~ Kangli / code / Image_Stabilizer.html</a> ).

<ol>
	<li>R&#246;nicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).</li><li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway.">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Entwicklung eines morphologischen Phänotyp (Hefezelle nicht korrekte Zellteilung) auf Protein-Überexpression zu überwachen. Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, um Hefezellen durch Pelletierung bei der empfohlenen Zentrifugationsgeschwindigkeit als höhere Geschwindigkeiten Zellen und obskuren Ergebnisse Schäden können zu ernten. Methylenblau und Calcofluor weiß sollte hinzugefügt werden, um Zellen kurz vor der Bildgebung leben, wie sie giftig sind...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nocodazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>M1404</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene Blue 1% (w/v)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW6276-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcofluor White</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>F3543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petroleum Jelly</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW3339-2</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast

Gene Löschungs-und Protein-Überexpression sind gängige Methoden zur Untersuchung von Funktionen von Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Analyse der Phänotyp Entwicklung als eine Funktion der Protein-Konzentration in der Bevölkerung und Single-Cell-Ebenen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Obwohl dieses Protokoll auf die Überexpression eines Proteins beruht, kann es leicht zur morphologischen Phänotypen abhängig Unterdrückung der Proteinexpression angepasst werden. Unser Labor ist interessiert an einem Studium der Signalisierung Eigenschaften der endocytischen Adapter-Protein epsin. Zu diesem Zweck verwendeten wir eine dominant negative Ansatz, bei dem wir die konservierten überexprimiert<u&gt; E</u&gt; PSIN<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; Erminal<u&gt; H</u&gt; Omology (ENTH) Domain, um mit den Funktionen des endogenen epsin-2 (Ent2 oder YLR206W) stören. Wir haben beobachtet, dass die Überexpression der ENTH Domäne Ent2 (ENTH2) in Wildtyp-Zellen führte zu einer Zellteilung Defekt, der abhängig von der mislocalization einer Familie von Gerüstproteine, septins ist.

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Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene Löschungs-und Protein-Überexpression sind gängige Methoden zur Untersuchung von Funktionen von Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Analyse der Phänotyp Entwicklung als eine Funktion der Protein-Konzentration in der Bevölkerung und Single-Cell-Ebenen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Aufrufe.  Purdue University. Gene Löschungs-und Protein-Überexpression sind gängige Methoden zur Untersuchung von Funktionen von Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Analyse der Phänotyp Entwicklung als eine Funktion der Protein-Konzentration in der Bevölkerung und Single-Cell-Ebenen in Saccharomyces cerevisiae.

Serie: Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

Verwendung von Drehstabtest als Methode für die qualitative Analyse von Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Forschung

Biologie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...