Intrazelluläre Bakterien sezernieren Effektorproteine in den Wirt, die biologische Wege manipulieren können, um das Überleben von Krankheitserregern zu fördern. Das Aufdecken von Wirtszielen von Effektoren ist für das Verständnis intrazellulärer Krankheitserreger wie Chlamydia trachomatis unerlässlich. Hefetoxizität und Suppressor-Bildschirme können wichtige Erkenntnisse über das natürliche biologische Ziel von bakteriellen Effektorproteinen liefern und können besonders nützlich sein, wenn ein Bindungspartner unbekannt ist.
Wir zeigen die Hefetoxizität und Suppressor-Assays hier für das Screening auf Chlamydia trachomatis Effektorproteine, aber diese Technik wurde auch für die Charakterisierung von Legionella pneumophila und Coxiella burnetii Effektoren verwendet. Beginnen Sie mit der Impfung von fünf Millilitern einzelner Aussetzerbrühe mit der einzigen Hefekolonie, die mit dem mit Plasmid haltigen Effektorprotein transformiert wird. Verwenden Sie Hefe, die mit dem Vektor allein als Negativkontrolle transformiert wurde, und inkubieren Sie das Inokulum über Nacht bei 30 Grad Celsius beim Schütteln.
Am nächsten Tag 180 Mikroliter steriles Wasser in die A2-Brunnen einer 96-Well-Platte geben. Wirbel nieren Sie die Nachtkultur und fügen Sie 180 Mikroliter Hefe zu gut A1 hinzu. Dann die Hefe in den Brunnen mit Wasser verdünnen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipetten, um fünf Mikroliter jeder Verdünnung auf einzelne Aussetzerglukose und einzelne Aussetzer-Galaktose-Agarplatten zu erkennen und die Platten 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius zu bebrüten.
Bewerten Sie nach der Inkubation die Toxizität visuell, indem Sie das Wachstum von Hefe, das das effektor-Protein ausdrückt, das auf den Galaktose-haltigen Medien angebaut wird, mit dem Wachstum von Hefe vergleichen, die den Vektor allein ausdrückt. 100 Milliliter der einzelnen Aussetzerbrühe mit einem Milliliter des zuvor vorbereiteten Hefebestandes impfen und 16 bis 24 Stunden bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 150 U/min bebrüten. Am nächsten Tag die gesamten 100 Milliliter der Nachtkultur auf 900 Milliliter vorgewärmter Einzelbrühe hinzufügen und den Kolben vier bis fünf Stunden bei 30 Grad Celsius beim Schütteln bebrüten.
Nach der Inkubation pellet die Kultur bei 6.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 250 Milliliter sterilem Wasser wieder auf. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand.
Dann das Pellet in 250 Millilitern eines Millimolaren-Lithiumacetats wieder aufsetzen. Pellet die Kultur durch Zentrifugation, entfernen Sie das Lithiumacetat, und setzen Sie das Pellet in 9,6 Milliliter von 50%PEG 3350. Fügen Sie dann Transformationsreagenzien hinzu, wie im Manuskript beschrieben, und passen Sie das Volumen auf 15 Milliliter an, wobei steriles Wasser sanft invertieren wird, um es zu mischen.
Inkubieren Sie die Mischung bei 30 Grad Celsius für 30 Minuten. Dann 750 Mikroliter DMSO hinzufügen und in einem Wasserbad bei 42 Grad Celsius für weitere 30 Minuten brüten. Das Hinzufügen des DMSO vor einem Hitzeschock ist entscheidend, um eine hohe Transformationseffizienz zu erreichen.
Nach der Inkubation die Hefe durch Zentrifugieren bei 3.000 mal g für fünf Minuten pellet. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 10 Milliliter sterilem Wasser, dann wiederholen Sie die Zentrifugation, um die Hefe zu pellet. Das Pellet in acht Milliliter Wasser wieder aufhängen.
Bestimmen Sie die Transformationseffizienz, indem Sie die Probe eins bis zehn verdünnen und 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf einen doppelten Aussetzeragar plattieren. Dann 200 Mikroliter der Probe auf doppelten Aussetzer-Galactose-Agarplatten verbuchen und die Platten 48 bis 96 Stunden bei 30 Grad Celsius bebrüten oder bis Kolonien auftauchen. Sobald Kolonien erschienen sind, patchen Sie sie auf doppel ausgelassengalactose Agar und bebrüten sie für weitere 24 bis 48 Stunden.
Verwenden Sie einen Teil des Pflasters, um fünf Milliliter doppeler Aussetzerbrühe zu impfen und das Inokulum über Nacht bei 26 Grad Celsius mit Schütteln bei 150 U/min zu bebrüten. Am nächsten Tag 180 Mikroliter steriles Wasser in fünf Brunnen einer 96-Well-Platte geben, beginnend mit gut A2. Wirbel nen den Nächtlichen Kulturmix. Fügen Sie 180 Mikroliter Hefe gut A1 hinzu und verdünnen Sie sie seriell mit dem Wasser in den Brunnen A2 bis A6. Entdecken Sie fünf Mikroliter jeder Verdünnung auf einzelnen Drop-out-Glukose und einzelne Drop-out-Galactose-Agar-Platten, die sicherstellen, dass der toxische Effektor allein als Kontrolle enthalten ist.
Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für 48 Stunden und vergleichen Sie dann das Wachstum der Hefe mit toxischem Effektor allein mit dem Wachstum von Hefe mit dem potentiellen Suppressor. Um Suppressoren zu bestätigen, die eine verminderte Toxizität im Vergleich zum toxischen Effektor allein nachgewiesen haben, isolieren Sie das Plasmid nach Manuskriptanweisungen und wandeln Es wieder in die giftige Hefe um. Entleeren Sie doppelte Drop-out-Glukosebrühe mit einer Kolonie aus der Transformationsplatte.
Inkubieren Sie es über Nacht und Punkt auf doppelten Drop-out-Glukose und Galaktose-Agar, um die Unterdrückung der Toxizität zu bestätigen. Vor der Durchführung des Hefe-Suppressor-Bildschirms wurden die Effektorproteine von Interesse auf Toxizität in Hefe getestet. Das Protein von Interesse wurde in Hefe unter der Kontrolle eines Galactose induzierbaren Promotors ausgedrückt und das Wachstum auf Galaktose wurde mit dem Wachstum auf Glukose verglichen.
Als CT229 auf Toxizität getestet wurde, wurden kleinere Kolonien und Wachstumsunterdrückung beobachtet. Idealerweise sollte eine Zwei- bis Drei-Log-Abnahme beobachtet werden, um mit Hefe-Suppressor-Bildschirmen fortzufahren. Der Suppressor-Bildschirm wurde durchgeführt, indem der toxische Stamm mit der Hefe-Genombibliothek pYAP 13 transformiert und die Transformanten auf Galaktose-Agar plattiert wurden.
Die erhaltenen Suppressor-Klone wurden auf doppelausgelassenen Galactose-Agarn gesichtet, um die Unterdrückung der Toxizität zu bestätigen. Die Unterdrücker pSup1 und pSup2 unterdrückten die Toxizität des Effektorproteins, während pSup3 dies nicht tat. Diese Verfahren erfordern sorgfältige Liebe zum Detail zusätzlich zu den kritischen Vorarbeiten, einschließlich der Vorbereitung großer Mengen an Medien und Platten, die vor der Durchführung des Experiments bereitstehen.
Sobald Unterdrücker identifiziert sind, können Experimente durchgeführt werden, um Wechselwirkungen mit dem Effektor des Interesses zu überprüfen, einschließlich Pull downs, Immunfluoreszenzkolokalisierung, Effektor Knockout oder Knockdown von Host-Faktoren in den Bildschirmen identifiziert. Die Entwicklung dieser Technik für Chlamydien-Effektoren hat eine beschleunigte vorläufige Charakterisierung von Effektorproteinen ermöglicht und dazu beigetragen, unsere Bemühungen auf die Aufklärung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu konzentrieren, die Wirtspathogen-Wechselwirkungen vermitteln.
