Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der MRC unterstützt.

1. Paarung und sammeln Eier <ol><li> Weibliche und männliche medaka kann leicht durch die Größe und Form des analen und Rückenflossen unterschieden werden. Die Afterflosse der Männchen sind größer und Parallelogramm-förmige Vergleich zu den Weibchen. Die weibliche Afterflosse ist kleiner und Dreieck geformt. Die männlichen Rückenflosse hat eine deutlich sichtbare tiefe Kerbe zwischen den beiden letzten Strahlen. </li><li> Medaka legen bis zu 40 Eier täglich und medaka Weibchen tragen Eier in ihrem Bauch durch Anlagerung Filamente für mehrere Stunden Cluster, bevor sie in den Werken in den Tank entfernt werden. </li><li> Frauen können in einem Netz gefangen und gehalten werden innen sanft von beiden Seiten mit einer Hand. Eier können dann vorsichtig aus dem Bauch mit dem Zeigefinger der anderen Hand aufgezogen werden. Das Weibchen kann dann in den Tank zurückgeführt werden. Eier sollten auf einer 6 cm Petrischale mit Embryo Medien durch stumpfe Pinzette oder einem Finger gefüllt übertragen werden. </li><li> Medaka Paare nur selten zu kämpfen, wenn sie in einem kleinen Paarung Box aufbewahrt werden. Deshalb können sie in einem kleinen Tank mit Wasser fließen gehalten werden, so dass sie verfüttert werden können, und Eier aus dem gleichen Paar gesammelt werden können jeden Tag für ein paar Monate. </li><li> Es ist wichtig, dass die weiblichen Fische sollten nicht ohne Männchen gehalten werden, da der Eisprung stattfindet Alltag in medaka Frauen. Andernfalls können Frauen nicht liefern Eier und sich unwohl fühlt. </li></ol> 2. Reinigung Embryonen <ol><li> Transfer ohne Cluster Eier mit einer Glaspipette auf Schleifpapier (p2000 Korn, wasserdicht) in den Deckel eines 9cm Petrischale. Entfernen Sie überschüssiges Medium, sondern sorgen für eine ausreichende Lautstärke bleibt zu verhindern Trocknung von Embryonen. </li><li> Sanft rollen Embryonen auf Schleifpapier mit dem Zeigefinger, der Anwendung minimal Druck und halten den Finger parallel zur Oberfläche des Sandes Papier für etwa 45-60 Sekunden, um einige der äußeren Oberfläche Haare des Chorion zu entfernen. Rollen Sie nicht mehr als 5-7 Embryonen auf einmal diese Vorsichtsmaßnahme die Gefahr von Quetschungen Embryonen unter einander zu minimieren. </li><li> Transfer gereinigt Embryonen in ein frisches Gericht Embryo Medium. </li></ol> 3. Machen Agaroseplatten zum Halten Embryonen während der Mikroinjektion Die Embryonen werden in Mulden während der Injektion mit einem Plexiglas-Form in 1,5% Agarose (Abbildung 1) hergestellt worden war. Die Konzentration der Agarose ist wichtig, dass Embryonen richtig halten. <ol><li> Stellen Sie zunächst einen Rahmen aus Agarose, die Plexiglas-Form zu halten. Gießen Sie 1,5% Agarose in Wasser zu einer 0,5 cm Tiefe in einem 9cm Petrischale und warten, bis es erstarrt vollständig. Schneiden Sie einen Bereich des Agarose nur größer als die Größe der Form. </li><li> Gießen Sie 1,5% Agarose, um den Schnitt Bereich zu füllen und legen Sie die Form, so dass keine Luftblasen eingeschlossen sind und warten, bis Agarose erstarrt. Diese Agarose Platte kann in den Kühlschrank zu beschleunigen solidifaction gespeichert werden. </li><li> Entfernen Sie den Schimmel zu Tröge zu schaffen, um die Eier zu halten. Fügen Sie genug Embryo Medium, um die Form, Deckel und lagern bei 4 ° C eintauchen, bis es gebraucht. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der maßgeschneiderten Form verwendet werden, um Tröge in Agarose-Platten für die Mikroinjektion vorzubereiten. </li></ol> 4. Mikroinjektion von medaka Embryonen In Medaka, sind DNA-, RNA-, Morpholino-Oligonukleotide und Tracer Farbstoffe durch das Chorion in das Zytoplasma der 1 bis 64-Zell-Stadium Embryos statt den Dotter als im Zebrafisch mikroinjiziert. Da das Zytoplasma ist kleiner und weniger sichtbar in Medaka, Praxis durch die Injektion von Farbstoffen wie Rhodamin-Dextran wird empfohlen, diese Fähigkeiten zu entwickeln. Die Zugabe von Phenolrot als Indikator wird auch aufgefordert, eine Bestätigung der Injektionen zu ermöglichen. Wie das Chorion umgeben medaka Embryonen ist hart, ist eine kurze, starke und breite Injektionsnadel erforderlich (Abbildung 2). Bereiten Sie diese starke breite Injektionsnadel aus einem Filament-haltigen Glaskapillare. <ol><li> Bereiten Injektionslösung mit Phenolrot als Tracer und laden Sie sie in die Nadel von der Rückseite mit einer Eppendorf Microloader. Schließen Sie die Nadel in die Luft Pumpe-Düse. </li><li> Eier müssen gesammelt und so bald wie möglich ohne Cluster werden nach der Befruchtung an der Ein-Zell-Stadium zu injizieren. Mehr Embryonen können, indem Sie sie auf dem Eis (nicht länger als 30 Minuten), um die Zellteilung zu stoppen injiziert werden. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Vergleich medaka und Zebrafisch Nadeln. Beachten Sie die Spitze des MF Nadel (oben) ist kürzer und breiter daher stärker für die Punktion der harten Chorion umgeben medaka Embryonen. </li><li> Transfer-Eier in die Agarose Platte und richten Sie sie in die Tröge mit einer Pinzette. Kurz vor der Injektion sollte fünf Eier gedreht werden, so dass die Zellmembran der Ein-Zell-Cytoplasma durch th getroffen werden könnene Nadel senkrecht. Das Zytoplasma der one-Zelle kann durch die Suche nach einem Gebiet ohne kleine Öltröpfchen, die gegenüber der Seite des Eies mit dichteste Öltröpfchen gefunden werden. Die identifizierten Bereich kann bestätigt werden, um das Cytoplasma durch Betrachtung von der Seite. </li><li> Stecken Sie die Nadel in der Nähe der Eier. Öffnen Sie die Spitze der Nadel durch leichtes Berühren der Spitze der Nadel auf die Chorion oder mit microforceps (Abbildung 3). Eine kleine Menge der Injektion Substanz sollte gesehen abfließen werden. </li><li> Punktion durch das Chorion an der Spitze der Nadel im Inneren des Chorion Platz. Passen Sie den Nachdruck der Einspritzdüse relativ hoch zu sein, um sicherzustellen, kein Rücklauf erfolgt aufgrund des hohen Drucks auf Punktion durch die harten Chorion (Einstellungen von 80-100hPA für Nachdruck und 500-700hPa für Einspritzdruck). </li><li> Legen Sie die Spitze der Nadel in das Zytoplasma durch stark Stossen ihrer Membran. Vermeiden Sie die Spitze der Nadel in den Dotter. Im Gegensatz zu Zebrafisch wird das Material in den Dotter injiziert nicht in das Zytoplasma übertragen werden. Eingespritzten Flüssigkeiten haben eine deutliche Grenze, wenn sie in den Dotter injiziert, während die Grenze verwischt ist, wenn in das Zytoplasma (Abbildung 4). Gelegentlich kann die Nadel verstopft durch Agarose / Schutt. Pinzetten können verwendet werden, um touch / rebreak Ende der Nadel, und entfernen Sie die Blockierung sein. Wenn die Nadel bricht zu irgendeinem Zeitpunkt während der Injektion wird sprudeln in den Embryo Medium gesehen werden und die Substanz, die Sie spritzen verloren. Die Injektionen sollten systematisch von oben nach unten entlang Agarose-Kanäle und von links nach rechts über die Form durchgeführt. </li><li> Injizierten Embryonen sollte auf eine saubere Schüssel mit Embryo-Medium übertragen und weiterentwickelt werden bei entsprechender Temperatur. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Breaking the Nadelspitze vor der Injektion. 1: Bewegen Sie die Nadelspitze in der Nähe des Chorion des Embryos; 2: Tippen Sie auf das Chorion und bewegen Nadel hin und her sanft bis zur Spitze zu brechen; 3: Wenn eine kleine Menge der Injektion Stoffströme aus dem Ende der Nadel dies bestätigt Bruch der Spitze. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Repräsentative Bilder injiziert medaka Embryonen. Panel A zeigt ein repräsentatives Bild der richtigen Injektion von Rhodamin-Dextran in das Zytoplasma einer one-Zell-Stadium medaka Embryo. Panel B zeigt ein repräsentatives Bild der falschen Injektion von Rhodamin-Dextran in den Dottersack eines Ein-Zell-Stadium medaka Embryo. Panels C und D zeigen die Embryonen aus Platten A und B jeweils bei etwa 30 Stunden nach der Injektion. EM: Embryo wird vorderen nach oben in Platten C und D und zeigen Sie ist dorsal. Beachten Sie den Körper des Embryos in Panel D ist nicht rot, wie der Farbstoff wurde falsch in den Dottersack injiziert. Arrows in B und D zeigen, Rhodamin-Dextran injiziert fälschlicherweise in den Dottersack beachten Sie die unterschiedlichen kreisförmige Begrenzung. Die gestrichelten Linien in A und B Umriss des Zytoplasma einer Zelle anzuzeigen, ist eine Ansicht lateral.

<ol>
	<li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka,+Oryzias+latipes.">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li><li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+and+zebrafish,+an+evolutionary+twin+study.">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).</li></ol>

In diesem Video zeigen wir eine Methode für die Zell-Tracer, mRNA, DNA oder anti-sense-Oligonukleotid-Injektion in einem Zell-Stadium medaka Embryonen. Diese Technik hat uns erlaubt, verschiedene Entwicklungsprozesse Studie in-vivo in Echtzeit. Dieser Prozess und die anschließende detaillierte Analyse bietet es hat das Potenzial, deutlich verbessern unser Verständnis von Wirbeltieren Organogenese und die zugrunde liegenden Zellbiologie. Solches Wissen kann wichtig sein für die, und die Ausbeute therapeutische Anwendungen in der regenerativen Medizin.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4" fine net</td>
<td>Tools</td>
<td>J &amp; K Aquatics Ltd.</td>
<td>MD001</td>
<td>Used to capture fish during egg harvesting.</td>
</tr>
<tr>
<td>Embryo medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size </td>
<td>Tools</td>
<td>Hermes Abrasives Ltd.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>GC100-10F</td>
<td>For making microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige scientific instrument lab</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>For making microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf microloader</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>For loading microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Microinjector apparatus </td>
<td>Equipment</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model 5242.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model MN151.</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose injection plate</td>
<td>Tools</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For holding embryos during injection.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism

In diesem Video zeigen wir die Technik der Mikroinjektion in one-Zell-Stadium medaka Embryonen. Medaka ist eine kleine eierlegende Süßwasserfische, dass sowohl genetische und embryologische Analysen ermöglicht und ist eines der Wirbeltiere Modell-Organismen in die genomweite Phänotyp-driven Mutantenscreens out 1 durchgeführt wurden, wie im Zebrafisch und Maus. Divergenz der funktionellen Überlappung von Genen zwischen medaka und Zebrafisch ermöglicht die Identifizierung von neuen Phänotypen, die nicht identifizierbar sind in einer einzigen Spezies 2, also medaka und Zebrafisch sind komplementär für Genetische Analyse von Vertebratengenom Funktionen. Um die Vorteile von medaka Fische, deren Embryonen sind durchsichtig und entwickeln nach außen, ist die Mikroinjektion eine wesentliche Technik, um Zell-Tracer für die Markierung von Zellen, mRNAs oder anti-sense-Oligonukleotide injizieren zur Überexpression und Klopfen-down Gene von Interesse, und DNAs zur Herstellung von transgenen Linien.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism at JoVE.com

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Medaka und Zebrafisch sind für die genetische Dissektion Vertebratengenom Funktionen ergänzen. Dieses Protokoll werden die wichtigsten Punkte für eine erfolgreiche Mikroinjektion in medaka Embryonen eine wichtige Technik für embryologische und genetische Analyse mit medaka und Zebrafisch in einem Labor.

Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

microinjection-of-medaka-embryos-for-use-as-a-model-genetic-organism

Research

JoVE Journal

Biology

25.6K Aufrufe.  University of Bath. Medaka und Zebrafisch sind für die genetische Dissektion Vertebratengenom Funktionen ergänzen. Dieses Protokoll werden die wichtigsten Punkte für eine erfolgreiche Mikroinjektion in medaka Embryonen eine wichtige Technik für embryologische und genetische Analyse mit medaka und Zebrafisch in einem Labor.

Serie: Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Forschung

Biologie

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Assay für Neural Induction im Hühnerembryo

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

Verwendung von Drehstabtest als Methode für die qualitative Analyse von Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation von Medaka Embryonen und Zell-Transplantation für die Erzeugung von Chimären

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryonen

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

Zusammenfassung

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