Ce travail a été soutenu par une subvention de la MRC.

1. L&#39;accouplement et la collecte des œufs <ol><li> Médaka féminine et masculine se distinguent facilement par la taille et la forme des nageoires dorsale et anale. Les nageoires anales des mâles sont plus grands et en forme de parallélogramme comparé à celui des femelles. La nageoire anale des femmes est plus petite et en forme de triangle. La nageoire dorsale mâle a une encoche visible profonde entre les deux derniers rayons. </li><li> Medaka pondre jusqu&#39;à 40 oeufs tous les jours et les femelles portent des oeufs médaka regroupées à leur ventre par des filaments d&#39;attache pendant plusieurs heures avant ils sont supprimés dans les usines dans le réservoir. </li><li> Les femelles peuvent être pris dans un filet et maintenu à l&#39;intérieur délicatement des deux côtés d&#39;une seule main. Les oeufs peuvent alors être légèrement taquiné par le ventre avec l&#39;index de l&#39;autre main. La femelle peut alors être renvoyé dans le réservoir. Les œufs doivent être transférés dans une boîte de Pétri de 6 cm remplis avec les médias embryon par une pince émoussée ou un doigt. </li><li> Paires Medaka se battent rarement quand ils sont conservés dans une boîte d&#39;accouplement de petite taille. Par conséquent, ils peuvent être gardés dans un petit réservoir avec un débit d&#39;eau afin qu&#39;ils puissent être nourris et les oeufs peuvent être recueillies auprès de la même paire chaque jour pendant une couple de mois. </li><li> Il est important que les poissons femelles ne devraient pas être conservés sans les hommes, puisque l&#39;ovulation se produit tous les jours chez les femelles, médaka. Sinon, les femelles ne peuvent pas offrir des oeufs et de devenir malade. </li></ol> 2. Nettoyage des embryons <ol><li> Transfert unclustered oeufs avec une pipette de verre pour poncer (grain P2000, imperméable) placé dans le couvercle d&#39;une boîte de Pétri de 9 cm. Retirer l&#39;excès, mais d&#39;assurer moyenne un volume suffisant demeure pour éviter le dessèchement des embryons. </li><li> Roulez doucement sur le papier de verre en utilisant des embryons de l&#39;index, appliquer une pression minimale et garder doigt parallèlement à la surface du papier de sable pour environ 45-60 secondes pour enlever une partie des poils surface externe du chorion. Ne pas rouler plus de 5-7 embryons à la fois cette précaution permettra de minimiser le risque d&#39;écrasement des embryons en dessous de l&#39;autre. </li><li> Transfert embryons nettoyé à un plat frais de milieu embryon. </li></ol> 3. Faire plaques d&#39;agarose pour la tenue de l&#39;embryon pendant la microinjection Les embryons sont maintenus dans des auges pendant l&#39;injection faite avec un moule en plexiglas agarose à 1,5% (figure 1). La concentration d&#39;agarose est important de tenir embryons correctement. <ol><li> Tout d&#39;abord, faire un cadre d&#39;agarose à tenir le moule en plexiglas. Verser agarose à 1,5% dans l&#39;eau à une profondeur 0.5cm dans un plat 9cm de Petri et attendre qu&#39;il se solidifie complètement. Découpez une zone de l&#39;agarose simplement plus grande que la taille du moule. </li><li> Verser 1,5% d&#39;agarose pour remplir la zone de coupe et placez le moule de façon à ce qu&#39;aucune bulle sont piégés et attendre d&#39;agarose se solidifie. Cette plaque d&#39;agarose peuvent être stockés dans le réfrigérateur pour accélérer solidifaction. </li><li> Retirer le moule pour créer des auges pour tenir les oeufs. Ajouter suffisamment d&#39;embryons moyenne de plonger le moule, couvrir et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Schéma du sur-mesure moule utilisé pour préparer les creux dans les plaques d&#39;agarose pour la microinjection. </li></ol> 4. Microinjection d&#39;embryons médaka Dans le médaka, ADN, ARN, oligonucléotides morpholino et colorants traceurs sont microinjectés travers le chorion dans le cytoplasme de la 1 à 64 cellules embryon au stade plutôt que le jaune que chez le poisson zèbre. Depuis le cytoplasme est plus petit et moins visible dans le médaka, la pratique en injectant des colorants tels que la rhodamine-dextran est recommandé de développer cette compétence. Ajout de rouge de phénol comme traceur est également encouragée pour permettre la confirmation des injections. Comme le chorion entourant embryons médaka est rude, une courte aiguille d&#39;injection solide et large est nécessaire (figure 2). Préparer cette aiguille d&#39;injection fort et large à partir d&#39;un verre à filament contenant capillaire. <ol><li> Préparer la solution d&#39;injection avec le rouge de phénol comme traceur et le charger dans l&#39;aiguille de l&#39;arrière avec un microloader Eppendorf. Connectez à l&#39;aiguille de l&#39;injecteur pompe à air. </li><li> Les œufs doivent être collectés et unclustered dès que possible après la fécondation d&#39;injecter au stade d&#39;une cellule. Plus embryons peuvent être injectés en les stockant sur la glace (pas plus de 30 minutes) pour arrêter la division cellulaire. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Comparaison des aiguilles medaka et le poisson-zèbre. Notez la pointe de l&#39;aiguille MF (en haut) est plus courte et plus large donc plus forte pour percer le chorion difficiles entourant embryons médaka. </li><li> Transfert des œufs dans la plaque d&#39;agarose et les aligner dans le creux avec une pince. Juste avant l&#39;injection, cinq œufs doivent être tournés de façon la membrane cellulaire du cytoplasme d&#39;une cellule peut être touché par ee l&#39;aiguille perpendiculairement. Le cytoplasme de la cellule unique peut être trouvée par la recherche d&#39;une zone dépourvue de petites gouttelettes d&#39;huile qui est opposé au côté de l&#39;œuf avec des gouttelettes d&#39;huile plus dense. La zone identifiée peut être confirmé pour être le cytoplasme en regardant par le côté. </li><li> Placer la fermeture aiguille pour les oeufs. Ouvrez la pointe de l&#39;aiguille en touchant doucement la pointe de l&#39;aiguille pour le chorion ou en utilisant microforceps (figure 3). Une petite quantité de substance d&#39;injection doit être vu de s&#39;écouler. </li><li> Crevaison à travers le chorion de placer la pointe de l&#39;aiguille à l&#39;intérieur du chorion. Régler la pression de maintien de l&#39;injecteur à être relativement élevé, afin de s&#39;assurer qu&#39;aucun reflux survient en raison de la forte pression sur la ponction à travers le chorion difficiles (les paramètres de 80-100hPA pour la pression holding et 500-700hPa pour la pression d&#39;injection). </li><li> Insérer la pointe de l&#39;aiguille dans le cytoplasme par une forte piquer sa membrane. Evitez d&#39;insérer la pointe de l&#39;aiguille dans le jaune. Contrairement poisson zèbre, matière injectée dans le jaune ne sera pas transféré dans le cytoplasme. Liquides injectés ont une frontière distincte lorsqu&#39;il est injecté dans le jaune alors que la limite est floue lorsque dans le cytoplasme (figure 4). Parfois, l&#39;aiguille peut être bloquée par agarose / débris. Pince peuvent être utilisés pour toucher / sauts de la fin de l&#39;aiguille et retirer le blocage. Si l&#39;aiguille se casse à tout moment pendant l&#39;injection, le bullage sera vu dans le support d&#39;embryon et la substance vous injectez seront perdues. Les injections doivent être effectuées systématiquement de haut en bas le long des canaux d&#39;agarose et de gauche à droite dans le moule. </li><li> Embryons injectés doivent être transférés à un plat propre milieu contenant l&#39;embryon et développés à la température appropriée. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Briser la pointe de l&#39;aiguille avant l&#39;injection. 1: Déplacer la pointe de l&#39;aiguille à proximité du chorion de l&#39;embryon; 2: Touchez le chorion et déplacer l&#39;aiguille d&#39;avant en arrière doucement à briser la pointe; 3: Quand une petite quantité de substance par injection s&#39;écoule de l&#39;extrémité de l&#39;aiguille, ce qui confirme la rupture de la pointe. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Images représentant des embryons injectés médaka. Le panneau A montre une image représentative de l&#39;injection correcte de la rhodamine-dextran dans le cytoplasme d&#39;un embryon d&#39;une cellule de phase de médaka. Groupe B montre une image représentative de l&#39;injection incorrecte de la rhodamine-dextran dans le sac vitellin d&#39;un embryon d&#39;une cellule de phase de médaka. Panneaux C et D montrent les embryons à partir de panneaux A et B respectivement à environ 30 heures après l&#39;injection. EM: embryon, antérieure est à la hausse dans les panneaux C et D et la vue est dorsale. Notez le corps de l&#39;embryon dans le panneau D n&#39;est pas rouge comme le colorant a été incorrectement injecté dans le sac vitellin. Les flèches en B et D indiquent la rhodamine-dextran injecté correctement dans le sac vitellin noter la frontière distincte circulaire. Les lignes en pointillé dans A et B indiquent aperçu du cytoplasme d&#39;une cellule, vue latérale.

<ol>
	<li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka,+Oryzias+latipes.">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li><li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+and+zebrafish,+an+evolutionary+twin+study.">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).</li></ol>

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour traceur cellulaire, de l&#39;ARNm, l&#39;ADN ou anti-sens d&#39;injection d&#39;oligonucléotides en une seule cellule embryons médaka scène. Cette technique nous a permis d&#39;étudier divers processus de développement in vivo en temps réel. Ce processus et l&#39;analyse subséquente détaillées qu&#39;il offre a le potentiel d&#39;améliorer considérablement notre compréhension de l&#39;organogenèse des vertébrés et de la biologie cellulaire sous-jacent. Ces connaissances peuvent être importants pour, et le rendement des applications thérapeutiques en médecine régénérative.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4" fine net</td>
<td>Tools</td>
<td>J &amp; K Aquatics Ltd.</td>
<td>MD001</td>
<td>Used to capture fish during egg harvesting.</td>
</tr>
<tr>
<td>Embryo medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size </td>
<td>Tools</td>
<td>Hermes Abrasives Ltd.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>GC100-10F</td>
<td>For making microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige scientific instrument lab</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>For making microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf microloader</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>For loading microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Microinjector apparatus </td>
<td>Equipment</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model 5242.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model MN151.</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose injection plate</td>
<td>Tools</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For holding embryos during injection.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique de micro-injection dans une cellule embryons médaka scène. Medaka est un poisson d&#39;eau douce petite ponte qui permet des analyses génétiques et embryologiques et est l&#39;un des organismes modèles vertébrés dans lequel l&#39;ensemble du génome phénotype mutant axée écrans ont été effectuées 1, comme dans le poisson zèbre et la souris. Divergence de chevauchement fonctionnelle des gènes liés entre medaka et le poisson-zèbre permet l&#39;identification de phénotypes nouveaux qui ne sont pas identifiables dans une seule espèce 2, ainsi medaka et le poisson-zèbre sont complémentaires pour la dissection génétique du génome des vertébrés fonctions. Pour profiter de poissons médaka dont les embryons sont transparents et développer à l&#39;extérieur, la microinjection est une technique essentielle pour injecter des cellules-traceurs pour les cellules de l&#39;étiquetage, les ARNm ou oligonucléotides anti-sens pour les sur-exprimant et frapper vers le bas des gènes d&#39;intérêt, et d&#39;ADN pour faire lignées transgéniques.

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Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Medaka et le poisson-zèbre sont complémentaires pour la dissection génétique du génome des vertébrés fonctions. Ce protocole met en évidence les points clés pour réussir la microinjection dans des embryons de medaka, une technique importante pour l&#39;analyse embryologique et génétique à l&#39;aide medaka et le poisson zèbre dans un laboratoire.

Microinjection d&#39;embryons Medaka pour être utilisé comme un organisme modèle génétique

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.6K vues.  University of Bath. Medaka et le poisson-zèbre sont complémentaires pour la dissection génétique du génome des vertébrés fonctions. Ce protocole met en évidence les points clés pour réussir la microinjection dans des embryons de medaka, une technique importante pour l'analyse embryologique et génétique à l'aide medaka et le poisson zèbre dans un laboratoire.

Vidéo: Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection d&#39;embryons aegypti a. Pour obtenir les moustiques transgéniques

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Recherche

Biologie

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Méthode de coloration Mont anticorps entier de Chick

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Dosage de l&#39;induction neurale dans l&#39;embryon de poulet

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

L&#39;utilisation de Rotorod comme une méthode pour l&#39;analyse qualitative de la marche chez le rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection d&#39;embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Les études génétiques des protéines humaines réparation de l&#39;ADN utilisant de la levure comme système modèle

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation d&#39;embryons Medaka et la transplantation de cellules pour la production de chimères

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

L&#39;utilisation de la microscopie à Time Lapse Visualisez anoxie induite Suspended Animation en<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryons

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Microinjection d'embryons Medaka pour être utilisé comme un organisme modèle génétique

PLAYLIST