Um Organoide aus einem einzelnen Erythropoietin-produzierenden hepatozellulären Rezeptor B2 oder einer FEB2-positiven Darmstammzelle zu generieren, führen Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung basierend auf der FEB2-Expression durch und teilen Sie die erhaltenen Zellen in vier Gruppen ein: hoch, mittel, niedrig und negativ. Nachdem Sie das FEB2-High-Cell-Pellet mit Zentrifugation bei 390 G für drei Minuten bei vier Grad Celsius gesammelt haben, betten Sie die einzelnen sortierten FEB2-High-Zellen durch Pipettieren in das ECM ein und säen Sie die Zellen dann auf einer 24-Well-Platte mit 100 Einzelstücken pro 40 Mikroliter ECM pro Well. Inkubieren Sie die 24-Well-Platte 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für die Polymerisation des ECM.
Als nächstes wird die EZM in den ersten zwei Tagen mit 500 Mikrolitern Nährmedium bedeckt, das 10 mikromolare Reihen-assoziierte Kinase oder Gesteinsinhibitoren enthält, um die FEB2-hohen Zellen zu erhalten. Untersuchen Sie die Zellen manuell mit einem inversen Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung und beobachten Sie lebensfähige Organoide mit Sphäroidbildung und Kryptenvorsprung. Selbstorganisierende Kryptenvillenstrukturen, die an den normalen Dünndarm erinnern, wurden aus einzelnen FEB2-hohen Zellen nachgebildet.
Am fünften Tag der Kultivierung bildeten sich kugelförmige Strukturen, und vom siebten bis zum neunten Tag kam es zur Evagination der Flecken, um Krypten zu bilden.
